一種重組人源性抗B肝表面抗原(HBsAg)Fab抗體及其製取方法
2023-07-23 18:14:06
專利名稱：一種重組人源性抗B肝表面抗原(HBsAg)Fab抗體及其製取方法
技術領域：
本發明涉及一種抗體及其製取方法，特別是一種人源性抗HBsAg Fab抗體及其製取方法，屬於生物製品領域。
背景技術：
B型肝炎是一種世界範圍的流行性傳染病，全球B肝病毒攜帶者有三億人之多，其中我國B肝病毒攜帶者有一億多，B型肝炎患者一千多萬。據世界衛生組織統計，全世界每年死於該病者多達一百多萬，臨床缺乏有效的治療方法。由於目前還沒有治療B型肝炎的有效手段，因此預防其感染在控制該病的傳染上顯得尤為重要，使預防成為防治B型肝炎的重點。
血源性抗B肝表面抗原抗體可用於B型肝炎的被動免疫，可有效地預防B肝病毒急性感染。能與B肝病毒表面抗原結合併阻止其侵襲肝細胞的B肝表面抗體或其抗體片段是唯一能用於緊急預防的被動免疫生物製品，單獨或與疫苗製成的免疫複合物還可防止B型肝炎的母嬰傳播。但是，血源性抗體的來源卻相當有限且具有潛在的傳染性，給它的應用帶來限制。
基因工程生產的人源性抗體或其單鏈抗體可代替血源性抗體在臨床上具有防治B型肝炎病毒的很好的應用前景，如防治新生兒B型肝炎病毒的垂直傳播、肝臟移植病人的病毒控制和用於製備治療性B肝疫苗等。Fab(抗原結合段，fragment ofantigen binding)抗體具有全抗體相同的抗原結合活性，且糖基對抗原抗體的結合活性沒有影響。
甲醇酵母表達系統是近年來發展最快和最具潛能的的真核表達系統，表達量高，可進行分泌型表達且其培養基成分簡單，有利於目的蛋白純化等優點，已被成功地應用於多種異源蛋白高水平表達和商業化大規模生產。
對於基因工程人B肝表面抗體的研究，目前國內外均應用噬菌體展示文庫技術獲得其Fab段基因，然後應用大腸桿菌表達，但其問題是Fab抗體呈雙鏈，在大腸桿菌中進行分泌型表達，表達量很低，進行包涵體表達又難以復性。有人將其重新構建成IgG置於CHO細胞中表達，但其表達量極低，難以規模化生產。而重組成單鏈抗體在大腸桿菌中表達仍然存在變性復性的問題。應用甲醇酵母系統進行重組蛋白表達的表達量相當高，既可以分泌型表達，也可以胞內表達。由於真核表達系統胞內表達的蛋白是有活性的蛋白，屬可溶性蛋白，無需復性處理，因此，非常有利於作為抗體的表達系統。國外應用此系統表達一些單鏈抗體已獲成功，但應用於B肝表面抗體則未見報導。國內尚未見進行這方面的研究。
發明內容
本發明的目的在於提供一種用作人B肝表面抗體的重組人源性抗HBsAg抗體，所述抗體具有較強的HBsAg結合活性和抗原特異性和結合B肝表面抗原的能力。
本發明的另一目的在於提供一種製取用作人B肝表面抗體的重組人源性抗HBsAg抗體的方法，所述方法採用甲醇酵母表達載體，兩步法轉化酵母，表達量很高，表達出的抗體片段與原始基因序列推導出的一致。
為了實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種人源性抗HBsAg Fab抗體片段基因，包括下述序列結構人源性抗HBsAg Fab重鏈(Fd鏈)基因序列CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGC人源性抗HBsAg Fab輕鏈(k鏈)基因序列GACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAACGGCCAATTAACCTGG
TACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGATCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG一種用作人B肝表面抗體的重組人源性抗HBsAg抗體，具有如下的胺基酸序列結構人源性抗HBsAg Fab抗體重鏈胺基酸序列FEQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGGAAAGTGTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS人源性抗HBsAg Fab抗體輕鏈胺基酸序列DIVLTQSPGTLSLSSGEGATLSCRASQSVSNGQLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYDGSPETFGQGTKVEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC上述重組人源性抗HBsAg抗體的製備方法為利用噬菌體展示技術，獲得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因，在原核表達系統中進行表達，在此基礎上，利用PCR技術將Fab的輕重鏈基因擴增出來，構建到甲醇酵母表達載體中，轉化酵母，構建Fab工程菌，分泌表達生產Fab抗體片段。
對該抗體結合活性進行的研究顯示，該Fab抗體具有較強的HBsAg結合活性和抗原特異性。
其中人源性抗HBsAg Fab片段的基因的獲得採用如下方法對B肝疫苗志願者加強免疫注射後取血，分離單核細胞，提取mRNA，反轉錄合成cDNA，用設計好的引物PCR擴增出抗體的輕鏈基因和重鏈Fd的片段基因，分別插入到載體pComb3H的相應位點構建含有抗體輕鏈和重鏈Fd段的載體質粒。用該質粒轉化XL1-Blue，重組菌體在SB培養基中培養，然後加入噬菌體VCSM13培養，其上清即為噬菌體抗體庫。
其中Fab抗體酵母表達體系的建立-工程菌的構建及表達採用如下方法採用Pichia pastoris載體系統(購自Invitrogen公司，見EasyselectTMPichia Expressionkit，A manual of Methods for Expression of Recombinant proteins Using pPICZ and pPICZαin Pichia pastoris)，構建高效分泌表達Fab的酵母工程菌，可以進一步提高抗HBsAg抗體Fab段的表達量，並能大規模發酵來生產Fab抗體，並對該Fab抗體進行分泌表達和純化，使純化的Fab抗體純度達到95％以上。
本發明對重組Fab抗體的等電點(PI)、與HBsAg結合能力(ELISA測定)、抗B肝表面抗原單鏈抗體(以下簡稱為ScFv)單克隆抗體的製備、鼠抗ScFv單克隆抗體結合能力、分子量測定以及重組Fab抗體活體中HBsAg進行了測定。質譜分子量分析和肽圖分析證明表達出的Fab抗體片段與原始基因序列推導出的大小一致。ELISA試驗、2215細胞(表面)抗原中和試驗以及B肝表面抗原轉基因小鼠的中和試驗表明，分泌表達的Fab抗體片段具有很強的結合B肝表面抗原的能力。因而在臨床上可用於治療重型B型肝炎、慢性B型肝炎、B型肝炎的母嬰垂直傳播、暴露者被動免疫保護及肝移植保護等。
圖1為本發明所述的重鏈序列圖2為本發明所述的輕鏈序列圖3為本發明所述人源性抗HBsAg Fab重鏈(Fd段)基因序列同源性比較圖4為本發明人源性抗HBsAg Fab輕鏈(k鏈)基因序列同源性比較具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例進一步描述本發明，但所述實施例僅用於說明本發明而不是限制本發明。
一、噬菌體展示技術獲得抗HBs Fab抗體片段基因對B肝疫苗志願者加強免疫注射後第五天取血，分離單核細胞，提取mRNA，反轉錄合成cDNA，用設計好的引物PCR擴增出抗HBsAg抗體的輕鏈基因和重鏈Fd的段基因，分別插入到載體pComb3H(Carlos F.Barbas and Dennis R.Burton，1994，ColdSpring Harbor Laboratory，Monoclonal Antibodies from combinatorial Libraries)的相應位點構建含有抗體輕鏈和重鏈Fd段的載體質粒。用該質粒轉化XL1-Blue(CarlosF.Barbas and Dennis R.Burton，1994，Cold Spring Harbor Laboratory，MonoclonalAntibodies from combinatorial Libraries)，重組菌體在SB培養基[Super-Broth，含3％Tryptone(購自OXOID公司)，2％ yeast extract(購自OXOID公司)，1％Mops，Ph7.0]中培養2小時後加入噬菌體VCSM13(Carlos F.Barbas and Dennis R.Burton，1994，Cold Spring Harbor Laboratory，Monoclonal Antibodies from combinatorial Libraries)培養過夜，其上清即為噬菌體抗體庫。
1、引物設計重鏈(VH)5′引物為VH1aCAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGGVH1fCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGGVH2fCAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGGVH3aGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGVH4fCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGGVH4gCAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGVH6aVAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG重鏈3』引物CG1aGCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCG2aCTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTTCG3aTGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTTCG4aGCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGAK鏈5』引物；V1a GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAV2a GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCAV3a GAAATTGAGCTGACGCAGTCTCCAK鏈3』引物5』--ACT GTG GCT GCA CCA TCT G--32、PCR的擴增分別取1ul上述反應物為模板，10倍的PCR緩衝液(500mM KCl；100mM Tris.ClPH8.3；20mM MgCl2)，1.5ul的0.1mMdNTP，1.2ul的20uM不同組合的3』，5』端引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶(購自基因有限公司)，12.75ul的雙蒸水。反應30個循環(94℃，45秒，50℃60秒，72℃120秒)，反應產物用1.2％瓊脂糖(購自Promega公司)電泳回收。
3、噬菌體抗體的篩選向預先包被HBsAg的微孔板內，每孔加入全套抗體庫液50ul，37℃溫育2小時，棄上清，用適量的0.5％Tween20的TBS(含50mmol/L Tris Base，150mmol/L Nacl)清洗數遍。每孔加入50ul洗脫緩衝液，吸出孔內液體，室溫放置10min，用適量的2mol/LTris調PH至中性。用洗脫液感染2ml新鮮製備的XL1-blue，培養6-8小時，加輔助噬菌體VCSM13繼續培養過夜，重新獲得噬菌體，重複上述步驟，3輪篩選後收集感染的細菌，提取雙鏈噬菌體DNA(含Fab抗體基因)。
4、陽性克隆的的序列分析及同源性比較從篩選到的抗HBsAg的Fab陽性的克隆，即為含Fab抗體基因的克隆。將抗體的輕、重鏈基因片段插入到測序載體測序鑑定，結果如圖1，同源性比較如圖2、圖3。
二、Fab抗體酵母表達體系的建立-工程菌的構建及表達為了進一步提高抗HBsAg抗體Fab段的表達量，並能大規模發酵來生產Fab抗體，以開發抗B型肝炎病毒的新藥，本發明選用近年來發展最快的Pichia pastoris載體系統，構建高效分泌表達Fab的酵母工程菌，並對該Fab抗體進行分泌表達和純化。
1、引物設計為Fab重鏈(H鏈)基因上遊引物為5』-CGGAATTCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3』下遊引物為5』-GGGGTACCTTAGCTAGTTTTGTCACAAGA-3』。
Fab輕鏈(L鏈)基因上遊引物為5』-GGAATTGTGTTGACCCAGTCT-3』，下遊引物為5』-CGGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGA-3』。
2、載體構建以噬菌體抗體篩選得到的陽性克隆為模板，在50ul反應體系中加入5ul反應緩衝液(500mM KCl，100mM Tris.Cl PH8.3，20mM MgCl2)，1.5ul 0.1mol/L的dNTPs(Gene公司)，1ul的20uM不同組合的3』，5』端引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶(Gene公司)，補加雙蒸水至50ul。反應30個循環(95℃*45秒，60℃*60秒，72℃*120秒)，反應產物用1.2％瓊脂糖電泳回收。將H、L鏈的PCR產物回收EcoR I和Xba I雙酶切，分別插入到克隆載體pGEM-7Zf相應的EcoR I和Xba I酶切窗口上，構建H、L鏈基因的克隆載體，對這兩個克隆載體進行序列測定，結果表明克隆的H、L鏈基因的鹼基序列與預期的完全一致。EcoR I和Xba I雙酶切出重鏈基因片段，連接到載體pPICZα(購自Invitrogen公司，見EasyselectTMPichia Expression kit，A manual ofMethods for Expression of Recombinant proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichiapastoris)的強啟動子PAOXI下遊的相應酶切窗口上構建酵母表達載體pPICZα-A-H，BamH I和EcoR I雙酶切出輕鏈基因片段，插入到載體質粒pPIC9K強啟動子PAOXI下遊的BamH I+EcoR I酶切窗口中，構建表達載體pPIC9K-L。
3、工程菌的構建表達載體pPIC9K-L轉化Pastoris pichia酵母GS115(購自Invitrogen公司，見EasyselectTMPichia Expression kit，A manual of Methods for Expression of Recombinantproteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris)，G418(Geneticin，一種抗生素，購自GIBCO公司)抗性平板篩選重組酵母，得到表達Fab L鏈基因的重組酵母，分別挑取篩選出的多拷貝重組子單菌落，接種到發酵培養基中，28℃培養至OD600約為5-6左右，離心收菌，重懸於BMMY培養基[含2％Tryptone(購自OXOID公司)，1％yeastextract(購自OXOID公司)，100mM磷酸鹽(pH6.0)，1.34％YNB(購自Invitrogen公司)，4×10-5％biotin(購自Invitrogen公司)，0.5％甲醇(購自廣州化學試劑廠)]中進行甲醇誘導培養，培養上清液進行SDS-PAGE和Western Blotting分析，結果顯示，在分子量約為28KD處，可見重組子表達上清中有特異的輕鏈蛋白帶。再以此表達量最高的重組酵母為宿主菌，將表達載體pPICZα-A-H轉入，用Zeocin(一種抗生素，購自Invitrogen公司)抗性板篩選得到Fab工程菌。分別挑取篩選出的多拷貝重組酵母GS115/Fab的單菌落，接種到BMGY培養基[含2％Tryptone(購自OXOID公司)，1％yeast extract(購自OXOID公司)，100mM磷酸鹽(pH6.0)，1.34％YNB(購自Invitrogen公司)，4×10-5％biotin(購自Invitrogen公司)，1％甘油(購自廣州化學試劑廠)]中，28℃培養至OD600約為5-6左右，離心收菌，重懸於BMMY培養基中進行甲醇誘導培養，對誘導培養第4天的培養液上清分別進行SDS-PAGE和WesternBlotting分析，結果顯示，在分子量28KD附近有兩條特異蛋白帶。非還原處理的SDS-PAGE結果顯示，在45KD附近有一條特異的蛋白帶，分子量大小與理論計算的一致。ELISA分析表明表達產物具有較強的結合HBsAg的能力。
三、重組人源性抗HBsAg Fab抗體酵母工程發酵工藝研究重組人源性抗HBsAg Fab抗體酵母工程菌通過搖瓶培養，其重組Fab抗體的表達量可達到30～50mg/L。在此基礎上我們對該工程菌進行了5L發酵罐的發酵研究，初步確立的重組Fab抗體酵母工程菌的發酵工藝。從新鮮YPD[含2％Tryptone(購自OXOID公司)，1％yeast extract(購自OXOID公司)，2％葡萄糖(購自廣州化學試劑廠)，2％瓊脂粉]平板挑重組人源性抗HBsAg Fab抗體酵母工程菌GS115/Fab23或GS115/Fab51單菌落接種於100ml種子培養基中，30℃振蕩培養20-24小時備用。按10％接種量接入2.5L發酵基礎培養基中(5L發酵罐內)，用氨水調PH至5-6。發酵開始攪拌轉速為500rpm，30C恆溫發酵。當溶氧加速上升時，開始流加補料生長培養基(流加速率維持溶氧大於20％)。當光密度OD600為150-250左右時，停止補料，甘油耗盡後流加發酵誘導培養基。通過調節轉速、罐壓、通氣量和甲醇流加速率使溶氧大於20％。發酵液的甲醇濃度控制在10g/L，誘導發酵100小時左右。經分析發酵上清總蛋白達到2.2g/L，目的蛋白約佔總蛋白的19.3％。發酵液最後的蛋白量基本處於最高水平。
四、人源性抗HBsAg Fab抗體的純化工藝研究根據酵母表達的人源性抗HBsAg Fab抗體的特點，從經濟、實用、純化效率等方面為出發點，我們設計了三套純化方案，採用兩種親和層析方法和離子交換層析法，對酵母表達的人源性抗HBsAg Fab抗體的純化方法進行了比較研究。三套純化方案均達到了從酵母誘導表達的培養液中高效純化人源性抗HBsAg Fab抗體的目的。
1、抗Fab抗體親和層析柱純化重組人源性抗HBsAg Fab抗體誘導表達的培養上清液先用(NH4)2SO4沉澱，脫鹽後用羊抗人Fab偶聯的HiTrap抗體柱(Pharmacia公司)進行親和純化。用0.1mol/L的Tris.Cl(PH8.0)平衡，流速1ml/min，1小時後上樣，上樣完後改用10倍柱體積0.1mol/L的Tris.Cl(PH8.0)緩衝液洗滌，再用10倍柱體積的0.01mol/L的Tris.Cl(PH8.0)的緩衝液進行洗滌。將雜蛋白全部洗出後改用0.1mol./L的甘氨酸(PH 3.0)緩衝液進行洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰，收集蛋白峰(第一洗脫峰)。SDS-PAGE電泳鑑定，純化的Fab抗體的純度達到90％以上。將親和純化的Fab抗體進一步做分子篩(Sephadex G75)層析純化。用0.01mol/L Tris.Cl(PH8.0)緩衝液平衡，流速0.6ml/min，上樣後用同樣的緩衝液進行洗脫，280nm檢測蛋白峰，收集目的蛋白峰(第一峰)。SDS-PAGE電泳鑑定，純化的Fab抗體的純度可達到95％以上。
2、鼠抗HBs ScFv單克隆抗體親和層析柱純化重組人源性抗HBsAg Fab抗體(1)鼠抗HBs ScFv單克隆抗體的製備為了方便後期重組Fab抗體產品的檢測和純化，我們用與該Fab抗體基因序列同源的ScFv抗體免疫小鼠製備單克隆抗體。將與Fab抗體基因序列同源的ScFv與完全弗式佐劑(購自GIBCO公司)混合，注射於BALB/C雌小鼠腹股溝皮下，兩周後同部位再注射一次，於第一次注射後0天檢測小鼠組中抗ScFv抗體的滴度。將免疫成功的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以1∶5比例在聚乙二醇條件下進行融合。以有限稀釋液將雜交瘤細胞克隆，第二次克隆後陽性率應達100％，再行二次克隆後，分離到13株能分泌抗ScFv單抗的雜交瘤細胞。我們選用抗HBs ScFv的14F7單克隆抗體細胞株，注射BALB/C小鼠腹腔進行單克隆抗體擴增，收穫的腹水經辛酸純化法純化，用於製備14F7親和層析柱。
(2)14F7親和層析柱的製備①將初步純化的鼠抗HBs ScFv MAb 14F7置於偶聯緩衝液中透析平衡。
②裝置5mL HiTrapTMNHS activatited Sepharose HP柱，3×10ml冰冷1mmol/L HCl洗柱，流速0.5ml/min，洗脫柱上的異丙醇。
③注入5～10ml MAb 14F7溶液，25℃吸附30min。
④滅活緩衝液A、B交替洗柱，洗脫非特異性結合抗體並滅活未結合的活化基團。
⑤中和緩衝液至pH中性，4℃保存備用。
(3)14F7親和層析柱純化重組Fab抗體先用再生緩衝液洗柱，0.1mol/L PH8.0的磷酸緩衝液(30～40mL)平衡，再將脫鹽樣品直接從進樣口上樣，接著用0.1mol/L PH8.0、0.01mol/L PH8.0磷酸緩衝液分別洗去雜蛋白，最後用0.1mol/L甘氨酸-HCl洗脫緩衝液將目的蛋白洗脫下來。收集樣品洗脫液，將有目的蛋白的樣品洗脫液分部收集並進行SDS-PAGE檢測。薄層掃描分析顯示，用14F7親和層析柱純化的重組Fab抗體的純度可達98％左右。而且用該方法純化的回收率有了大幅度的提高，可達70-85％。
3、離子交換層析柱純化重組Fab抗體從理論上看，Fab抗體的等電點應在PI＝7.5-8.5之間，當抗體在緩衝液的PH為6.5時，Fab帶正電荷，過陰離子柱時被穿流，過陽離子柱時被吸附，所以我們採用離子交換法來純化Fab抗體。步驟如下①樣品先過陰離子柱(DEAE-Sepharose)Buffer為0.01M PB，PH為6.5，收集穿流峰，即上樣峰。因為Fab抗體此時帶正電荷，被不吸附，而部分雜蛋白則被吸附上，從而達到初步純化的目的。②將收集的陰離子柱的穿流峰過陽離子柱(CM-Sepharose)，緩衝液為0.01M PB，PH為6.5，用1M NaCL洗脫，收集目的峰。因為Fab抗體此時帶正電荷，被吸附，而部分雜蛋白被穿流，從而達到進一步純化的目的。薄層掃描分析顯示，所純化的Fab抗體的純度達95％以上，可用於分子量的確證和活性檢測。
五、人源性抗HBsAg Fab抗體的結構檢測及活性分析
1、人源性抗HBsAg Fab抗體的PI測定(等電聚焦)人源性抗HBsAg FabPI的測定參照《蛋白質電泳實驗技術》的方法進行，結果表明重組抗體的PI值為7.25-7.53。
2、人源性抗HBsAg Fab的ELISA測定(HBsAg結合能力)在包被好HBsAg的多孔板中分別加入抗HBsAg抗體Fab重組酵母(GS115/Fab)培養上清液，10倍系列稀釋的純化的Fab抗體進行ELISA檢測，血源性抗HBsAg免疫球蛋白(8U/ml)為陽性對照，重組酵母培養上清的吸收值達到1.05-1.99，與陰性對照的比值高達21-39.8，顯示出重組酵母培養上清具有很好的HBsAg結合活性。
3、人源性抗HBsAg Fab的ELISA測定(鼠抗ScFv單克隆抗體結合能力測定)將純化的重組Fab抗體(7ug/ml和0.7ug/ml)及表達上清(10倍稀釋和100倍稀釋)分別包被多孔板，4℃過夜，0.5％牛血清白蛋白封閉，洗滌後，按1∶1000，1∶10000，1∶15000，1∶100000，1∶200000，1∶400000稀釋抗ScFv單克隆抗體，加樣，37℃溫育1小時，洗滌，加羊抗鼠IgG-HRP(購自華美生物工程公司)(1∶1000)，37℃溫育30min，加鄰苯二胺顯色，493nm波長比色測定吸收值。結果顯示重組Fab抗體與抗ScFv單抗具有很強的結合能力。該單抗可以用來作為重組Fab抗體親合純化用抗體和用於產品檢測。
4、人源性抗HBsAg Fab抗體的分子量測定對重組Fab抗體進行分子量測定，用基質輔助雷射解析飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS，BRUKER公司，儀器型號Bruker Reflex III)測定Fab的平均分子量，該Fab抗體的平均分子量為49609道爾頓。
5、人源性抗HBsAg Fab抗體活體中和HBsAg測定用重組Fab抗體(0.35mg/ml)200ul靜脈注射HBsAg轉基因小鼠，每組六隻，30min後眼眶取血200ul，分離的血清用於HBsAg的ELISA測定，結果顯示，重組Fab抗體(0.35mg/ml)的HBsAg的中和率為30％-40％。
權利要求
1.人源性抗HBsAg Fab抗體片段基因，其特徵在於包括下述序列結構人源性抗HBsAg Fab重鏈(Fd鏈)基因序列CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGC人源性抗HBsAg Fab輕鏈(k鏈)基因序列GACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAACGGCCAATTAACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGATCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
2.一種用作人B肝表面抗體的重組人源性抗HBsAg Fab抗體，具有如下的序列結構人源性抗HBsAg Fab抗體重鏈胺基酸序列FEQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGGAAAGTGTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS人源性抗HBsAg Fab抗體輕鏈胺基酸序列DIVLTQSPGTLSLSSGEGATLSCRASQSVSNGQLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYDGSPETFGQGTKVEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC
3.一種用作人B肝表面抗體的重組人源性抗HBsAg抗體，其等電點為7.0-7.6，分子量為50KD，重組人源性抗HBsAg Fab抗體對HBsAg具有較強的中和作用。
4.根據權利要求1、2或3所述的重組人源性抗HBsAg抗體，其中所述抗體具有輕度的糖基化，SDS-PAGE和Western Blotting分析中，在分子量28KD附近有兩條特異蛋白帶，非還原處理的SDS-PAGE結果顯示，在45KD附近有一條特異的蛋白帶。
5.權利要求1所述的人源性抗HBsAg Fab抗體片段基因的製取方法，包括如下步驟1)對B肝疫苗志願者加強免疫注射後取血，分離淋巴細胞，提取mRNA，反轉錄合成cDNA；2)用引物PCR擴增出抗HBsAg抗體的輕鏈基因和重鏈Fd的段基因，分別插入到載體pComb3H的相應位點構建含有抗體輕鏈和重鏈Fd段的載體質粒；3)用該質粒轉化XL1-Blue，重組菌體在培養基中培養後加入噬菌體培養過夜，其上清即為噬菌體抗體庫。
6.根據權利要求5所述的人源性抗HbsAg Fab抗體片段基因的製取方法，其中所述引物為重鏈(VH)5』引物VH1a CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGGVH1f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGGVH2f CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGGVH3aGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGVH4fCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGGVH4gCAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGVH6aVAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG重鏈3』引物CG1aGCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCG2aCTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTTCG3aTGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTTCG4aGCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGAK鏈5』引物；V1a GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAV2a GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCAV3a GAAATTGAGCTGACGCAGTCTCCAK鏈3』引物GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGATCTCAG
7.根據權利要求5所述的人源性抗HBsAg Fab抗體片段基因的製取方法，其中PCR的擴增包括取反應物為模板，10倍的PCR緩衝液，1.5ul的0.1mM dNTP，1.2ul的20uM不同組合的3』，5』端引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶，12.75ul的雙蒸水；反應30個循環，反應產物用1.2％瓊脂糖電泳回收；其中噬菌體抗體的篩選為向預先包被HBsAg的微孔板內，每孔加入全套抗體庫液50ul，37℃溫育2小時，棄上清，用適量的0.5％Tween20的TBS清洗數遍；每孔加入50ul洗脫緩衝液，吸出孔內液體，室溫放置10min，用適量的2mol/L Tris調PH至中性；用洗脫液感染2ml新鮮製備的XL1-blue，培養6-8小時，加輔助噬菌體VSM繼續培養過夜，重新獲得噬菌體，重複上述步驟，3輪篩選後收集感染的細菌，提取含Fab抗體基因雙鏈噬菌體DNA。
8.權利要求2、3或4所述的人B肝表面抗體的重組人源性抗HBsAg抗體的製取方法，包括如下步驟1)利用噬菌體展示技術，獲得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因；2)在原核表達系統中表達人源性抗HBsAg Fab片段的基因；3利用PCR技術將Fab的輕重鏈基因擴增出來，構建到甲醇酵母表達載體中；4)兩步法轉化酵母，構建Fab工程菌，分泌表達生產Fab抗體片段。
9.根據權利要求8所述的方法，其中a)利用噬菌體展示技術，獲得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因所採用的方法為1)對B肝疫苗志願者加強免疫注射後取血，分離單核細胞，提取mRNA，反轉錄合成cDNA；2)用引物PCR擴增出抗HBsAg抗體的輕鏈基因和重鏈Fd的段基因，分別插入到載體pComb3H的相應位點構建含有抗體輕鏈和重鏈Fd段的載體質粒；3)用該質粒轉化XL1-Blue，重組菌體在培養基中培養後加入噬菌體培養過夜，其上清既為噬菌體抗體庫；b)在原核表達系統中進行表達人源性抗HBsAg Fab片段的基因並利用PCR技術將Fab的輕重鏈基因擴增出來，構建到甲醇酵母表達載體中採用如下方法以陽性克隆為模板，在反應緩衝液中加入3』、5』端引物、聚合酶反應，反應產物用1.2％聚丙醯胺電泳回收，將H、L鏈的PCR產物回收酶切，分別插入到克隆載體pGEM-7Zf的相應酶切窗口上，構建H、L鏈基因的克隆載體，EcoR I和Xba I雙酶切出重鏈基因片段，連接到載體pPICZα的強啟動子PAOXI下遊的相應酶切窗口上構建酵母表達載體pPICZα-A-H，BamH I和EcoR I雙酶切出輕鏈基因片段，插入到載體質粒pPIC9K強啟動子PAOXI下遊的BamH I+EcoR I酶切窗口中，構建表達載體pPIC9K-L。c)兩步法轉化酵母，構建Fab工程菌，分泌表達生產Fab抗體片段工程菌的構建採用下述方法表達載體pPIC9K-L轉化Pastoris pichia酵母GS115、G418抗性平板篩選重組酵母，得到表達Fab L鏈基因的重組酵母，分別挑取篩選出的多拷貝重組子單菌落，接種到BMGY培養基中，28℃培養至OD600約為5-6左右，離心收菌，重懸於BMMY培養基中進行甲醇誘導培養，培養上清液進行SDS-PAGE和Western Blotting分析；再以此表達量最高的重組酵母為宿主菌，將表達載體pPICZα-A-H轉入，用Zeocin抗性板篩選得到Fab工程菌；分別挑取篩選出的多拷貝重組酵母GS115/Fab的單菌落，接種到BMGY培養基中，28℃培養至OD600約為5-6左右，離心收菌，重懸於BMMY培養基中進行甲醇誘導培養；其中的重組Fab抗體酵母工程菌的發酵工藝為從新鮮YPD，I％yeast extract，2％葡萄糖，2％瓊脂粉]平板挑重組人源性抗HBsAg Fab抗體酵母工程菌GS115/Fab23或GS115/Fab51單菌落接種於100ml種子培養基中，30℃振蕩培養20-24小時備用；按10％接種量接入2.5L發酵基礎培養基中，5L發酵罐內，用氨水調PH至5-6；發酵開始攪拌轉速為500rpm，30C恆溫發酵。當溶氧加速上升時，開始流加補料生長培養基，流加速率維持溶氧大於20％；當光密度OD600為150-250左右時，停止補料，甘油耗盡後流加發酵誘導培養基。通過調節轉速、罐壓、通氣量和甲醇流加速率使溶氧大於20％；發酵液的甲醇濃度控制在10g/L，誘導發酵100小時左右；經分析發酵上清總蛋白達到2.2g/L，目的蛋白約佔總蛋白的19.3％。
10.根據權利要求8或9所述的方法，還包括對表達產物Fab抗體的純化，所述純化步驟包括誘導表達的培養上清液先用(NH4)2SO4沉澱，脫鹽後用羊抗人Fab偶聯的HiTrap抗體柱進行親和純化，用0.1mol/L的Tris.Cl平衡，流速1ml/min，1小時後上樣，上樣完後改用10倍柱體積0.1mol/L的Tris.Cl緩衝液洗滌，再用10倍柱體積的0.01mol/L的Tris.Cl的緩衝液進行洗滌，將雜蛋白全部洗出後改用0.1mol./L的Gly緩衝液進行洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰，收集蛋白峰；SDS-PAGE電泳鑑定，純化的Fab抗體的純度達到90％以上；將親和純化的Fab抗體進一步做分子篩層析純化；用0.01mol/L Tris.Cl緩衝液平衡，流速0.6ml/min，上樣後用同樣的緩衝液進行洗脫，280nm檢測蛋白峰，收集目的蛋白峰；SDS-PAGE電泳鑑定，純化的Fab抗體的純度可達到95％以上；或者首先製備鼠抗HBs ScFv單克隆抗體用與該Fab抗體基因序列同源的ScFv抗體免疫小鼠製備單克隆抗體；將與Fab抗體基因序列同源的ScFv與完全弗式佐劑混合，注射於BALB/C雌小鼠腹股溝皮下，兩周後同部位再注射一次，於第一次注射後0天檢測小鼠組中抗ScFv抗體的滴度。將免疫成功的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以1∶5比例在聚乙二醇條件下進行融合；以有限稀釋液將雜交瘤細胞克隆，第二次克隆後陽性率應達100％，再行二次克隆後，分離到13株能分泌抗ScFv單抗的雜交瘤細胞；選用抗HBs ScFv的14F7單克隆抗體細胞株，注射BALB/C小鼠腹腔進行單克隆抗體擴增，收穫的腹水經辛酸純化法純化，用於製備14F7親和層析柱；然後製備14F7親和層析柱①將初步純化的鼠抗HBs ScFv MAb 14F7置於偶聯緩衝液中透析平衡；②裝置5mL HiTrapTMNHS activatited Sepharose HP柱，3×10ml冰冷1mmol/L HCl洗柱，流速0.5ml/min，洗脫柱上的異丙醇；③注入5～10ml MAb 14F7溶液，25℃吸附30min；④滅活緩衝液A、B交替洗柱，洗脫非特異性結合抗體並滅活未結合的活化基團；⑤中和緩衝液至pH中性，4℃保存備用；14F7親和層析柱純化重組Fab抗體先用再生緩衝液洗柱，0.1mol/L PH8.0的磷酸緩衝液平衡，再將脫鹽樣品直接從進樣口上樣，接著用0.1mol/L PH8.0、0.01mol/L PH8.0磷酸緩衝液分別洗去雜蛋白，最後用0.1mol/L甘氨酸-HCl洗脫緩衝液將目的蛋白洗脫下來；收集樣品洗脫液，將有目的蛋白的樣品洗脫液分部收集並進行SDS-PAGE檢測；薄層掃描分析顯示，用14F7親和層析柱純化的重組Fab抗體的純度可達98％左右，純化的回收率可達70-85％；或者採用離子交換層析柱純化重組Fab抗體步驟如下①樣品先過陰離子柱Buffer為0.01M PB，PH為6.5，收集穿流峰，即上樣峰；②將收集的陰離子柱的穿流峰過陽離子柱，緩衝液為0.01M PB，PH為6.5，用1M NaCL洗脫，收集目的峰；薄層掃描分析顯示，純化的Fab抗體純度達95％以上。
全文摘要
本發明提供一種用作人B肝表面抗體的重組人源性抗B肝表面抗原(HBsAg)Fab抗體及其製取方法。上述重組人源性抗HBsAg抗體的製備方法為利用噬菌體展示技術，獲得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因，在原核表達系統中進行表達。在此基礎上，利用PCR技術將Fab的輕重鏈基因擴增出來，構建到甲醇酵母表達載體中，兩步法轉化酵母，構建Fab工程菌，分泌表達生產Fab抗體片段。對該抗體結合活性進行的研究顯示，該Fab抗體具有較強的HBsAg結合活性和抗原特異性。該基因的表達產物在臨床的肝病治療中具有較高應用價值。
文檔編號C12P19/34GK1495193SQ0314596
公開日2004年5月12日 申請日期2003年7月18日 優先權日2002年7月19日
發明者餘宙耀, 粟寬源, 任向榮, 高輝, 楊安鋼 申請人:餘宙耀, 粟寬源