利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法
2023-07-27 13:39:46 1
專利名稱：利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法
技術領域：
本發明屬於植物品種改良及育種技術領域，涉及利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法。
背景技術：
目前，植物基因克隆技術有以下幾種1)序列克隆，即根據已知基因的序列克隆植物基因的方法，利用此方法已經克隆了豌豆外源凝集素基因，酵母超氧化物歧化酶基因、水稻富硫10KD醇溶蛋白基因；2)表達產物克隆，即根據植物基因表達的產物RNA和蛋白質克隆基因，許多種於貯藏蛋白基因、激素或環境脅迫誘導表達基因；3)表型差異克隆，即根據植物表型差異或組織器官特異表達產生的差異克隆植物基因，包括轉座於標籤和T-DNA標籤技術以及「鳥槍」克隆。「鳥槍」克隆法是隨機切割供體基因組DNA，再轉化到受體基因組中，根據對轉化子的表型鑑定，找出所需克隆的基因，「鳥槍」克隆戰略已成功地應用幹分離細茵的無毒基因。但由於高等植物基因組很大，應用此方法克隆基因十分困難。如，將此方法應用於番茄的抗病基因篩選時，需要以雙元載體構建抗病品種的基因文庫，然後通過農稈菌等將它們導入感病品種之中，由此鑑定的一個單拷貝基因，需要篩選大量轉基因植株，需要建立高效轉化和再生植株技術平臺，耗材費時；4)定位克隆，即根據連鎖圖譜定位克隆植物基因，如番茄對丁香假單胞菌抗性基因pto基因、擬南芥的抗細菌病基因RSPZ基因、水稻抗白葉枯病基因Xa21基因的成功克隆；5)測序克隆，即通過測定DNA的序列克隆基因，如目前廣泛應用轉座子標籤和T-DNA標籤技術構建突變體庫的克隆技術以及定位克隆技術等。
常規基因克隆技術不適合於野生稻有利基因的發掘和利用。我國緯度跨度大，生態環境多樣，擁有豐富的生物基因資源，包括野生稻資源。野生稻由於長期處於野生狀況，經受各種災害和不良環境的選擇，具有對各種病蟲害的抗性和各種逆境的適應性，如抗病、抗蟲、耐寒、耐旱、耐鹽鹼、耐淹、耐蔭以及高產、優質、雄性不育、磷鉀高效利用等。30年代，中國農科院首任院長丁穎教授利用野生稻培育出了「中山一號」水稻品種，其優勢種質被利用了整整半個世紀。70年代，雜交水稻之父袁隆平利用野生稻「野敗」不育株開創了三系雜交水稻先例，使水稻產量大幅度提高。因此，利用現有的野生植物資源挖掘優異基因，創造新型種質，培育綜合性狀良好和/或具有特殊整合性狀如超高產、特殊用途的品種，已成為新世紀農業生物工程科技創新的首要目標。然而，野生稻基因組基礎研究還處於起步階段，由於其遺傳雜合性及多為多倍體等原因，尚未獲得遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜和表達圖譜。因此，應用常規技術對野生稻進行基因克隆和功能研究受到限制，技術上存在諸多局限與缺點1.野生稻遺傳背景薄弱，大多沒有建立高密度的遺傳圖譜，因此，利用圖位克隆技術分離基因很困難。
2.標籤技術依賴於轉座子系統、高效轉基因技術體系的建立以及轉基因突變體的篩選等，而野生稻的組織培養再生體系大多不完善，較栽培稻難度大，並且由於野生稻是天然的雜合體，後代存在分離，也影響著突變體的篩選，因此，標籤技術尚未應用於野生稻的基因克隆。
3.由於表達產物、序列分析等克隆策略都不適合野生稻功能基因的發掘、利用，因此，對野生稻進行大規模的功能基因組研究至今尚未啟動。
綜上所述，目前，野生稻有利基因資源的挖掘、利用還僅限於對AA基因組野生稻採用雜交轉育的方式，故發掘、利用野生稻等植物基因寶庫迫切期待新的技術與方法。
發明內容
本發明的第一個目的在於提供一種利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法，以克服現有技術存在的缺陷，從而大規模克隆植物有利基因，提供性狀得到改良的轉基因突變體植株並用於育種及品種改良。
為實現上述的目的，本發明方法包括如下步驟a.建立供體植物可轉化大片斷基因組文庫；b.通過轉基因技術將可轉化大片斷基因組文庫導入受體植物，獲得全基因組突變體庫；c.通過對突變體庫的篩選、鑑定和遺傳分析，以及對大片段克隆的亞克隆、序列分析，克隆並獲得控制突變性狀的基因；d.對克隆的控制突變性狀的基因進行測序和功能補償分析。
上述步驟a中，利用雙元細菌人工染色體載體(BIBAC)或可轉化人工染色體載體(TAC)構建可轉化大片段基因組文庫。步驟b中的突變體庫，可以直接利用步驟a中的基因組文庫，或者利用步驟c中篩選的大片斷克隆建庫；步驟c中，主要根據某些已克隆基因的保守序列如抗性基因的NBS-LRR保守結構和分子標記，對步驟a中的基因組文庫進行篩選，確定候選大片斷克隆。涉及的轉基因技術為農桿菌介導、基因槍、花粉管通道、穗頸注射中的任何一種，將全基因組克隆和/或候選克隆導入栽培稻品種，待轉化水稻材料為純度好的常規稻和雜交稻親本，構建全基因組基因敲入突變體庫。步驟c中，首先採用抗生素篩選、PCR分析、報導基因GUS分析等方法鑑定陽性轉基因植株，再按常規水稻田間管理方法規範種植陽性轉基因植株和對照品種，以便於考察農藝性狀，篩選變異植株和突變性狀。步驟d中，對步驟c中篩選的變異植株所攜帶的大片斷克隆進行測序分析，利用生物信息學技術，預測控制突變性狀的基因。根據測序結果，將各編碼區段亞克隆，對預測控制突變性狀的基因進行補償性測定實驗，克隆控制突變性狀的基因。
本發明的優點1.本發明利用可轉化大片段基因組文庫和全基因組基因敲入技術克隆近緣植物有利基因，不需要先具備該基因的表達產物、遺傳圖譜等，操作簡便易行，特別適用於與栽培稻不能交配的野生稻有利基因的利用和分離克隆。
2.採用大片段基因文庫，完成全基因組基因敲入所需的轉基因植株數量少，容易建立突變體庫；3.不需要對野生稻遺傳背景有太高要求，如高密度遺傳圖譜等；4.在進行野生稻基因克隆的同時就獲得了具有優良性狀的育種材料，直接用於品種改良。
5.所克隆的基因來自栽培稻近緣種野生稻，對人體和環境無害，容易通過轉基因安全性審定。
6.已克隆的基因或攜帶該基因的大片段克隆可以用於其它水稻品種和植物，迅速進行遺傳改良。
圖1為PCR擴增RSD130的結果。1，RSD130；2，陽性對照(Xa21基因)；M，1Kb Marker。
圖2為載體PCR擴增結果。1載體BIBAC2；2RSD130；3陽性對照(Xa21基因)。
圖3回收產物的電泳結果。MMarker；1，2，3，4分別從小到大4條回收產物。
圖4回收產物再次PCR擴增結果。MMarker；1陽性對照；2，3，4，5分別從大到小4條回收產物再次PCR結果。
圖5PCR回收克隆產物酶切鑑定結果結果。1單酶切；2為雙酶切；3為酶切的質粒；M1Kb Marker。
圖6轉基因水稻的抗蟲性鑑定。A對照品種；B轉基因水稻。
具體實施例方式
實施例1利用抗性基因的保守序列篩選藥用野生稻BIBAC可轉化大片段基因組文庫，對篩選出的候選大片段克隆進行測序和生物信息學分析，並通過遺傳轉化進一步進行功能補償測定。
(1)野生稻BIBAC可轉化大片段文庫的篩選。
a.引物設計根據NBS-LRR類及STK類抗病基因保守區域設計併合成引物兩對引物序列為RNL1F 5′-GGN GGN NTN GGN AAR ACN AC-3′，RNL1R 5′-AN NSH NARNGG NAR NCC-3′，RS1F 5′-TTY GGN RDN GTN TAY MRN GG-3′，RS1R 5′-AYNCC RWA NGA RTA NAY RTC-3′(混合鹼基代碼R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，H＝A/T/C，N＝A/T/G/C.)。
b.PCR篩選及陽性克隆分析反應混合物為10×PCR buffer，2.5μl；2.5mmol/L4種dNTP混合液，1.0μl；12.5μmol/L上、下遊引物，各1.0μl；25mmol/L MgCl2，1.5μl；TaqDNA聚合酶，1.5單位；模板DNA，30ng；加ddH2O至25μl。PCR反應條件94℃預變性3分鐘；94℃變性40″；45℃退火40″；72℃分鐘，共進行40個循環；最後72℃延伸7分鐘.
從野生稻可轉化大片段基因組文庫接種菌株到液體LB培養基中振蕩培養12-16小時後提取質粒，利用設計的兼併引物進行PCR篩選。篩選到大片段克隆RSD130，能擴增出4條帶(見圖1)，最大片斷約700bp。同時發現使用空載體作模板進行PCR擴增能得到除最大片斷外的另3條帶(見圖2)。因此，可以推導有一個引物結合在載體上。將4條帶回收(見圖3)，並再次進行PCR擴增，發現每一條帶均能擴增出包括自身在內的所有小帶(見圖4)。由此推導，最大的片斷包含另外3條片斷的序列，只需對最大片斷作進一步分析。
c.PCR產物的克隆PCR產物在1.5％的瓊脂糖凝膠上用TAE電泳緩衝液電泳分離，片斷回收用DNA Gel Extraction Kit(V-Gene公司)試劑盒，回收的PCR產物用pMD18-T Vector試劑盒(TaKaRa公司)連接。Cacl2法轉化DH5a感受態細胞。塗布於含IPTG、X-Gal和Amp(60mg/ml)的LB平板上，37℃培養過夜，挑取白色的菌落，並轉接於LB培養液中振蕩培養12-16小時後用鹼裂解法抽提質粒DNA，用HindIII和Bam H酶切檢測插入片斷(圖5)。
(2)候選大片段克隆的測序和生物信息學分析。
a.對克隆產物進行測序分析(測序公司為上海博亞公司)，1、採用測序，原始序列為GTAACGGCAACAATGGCCAAAAAGATTGCAAGCGTAAGCCCGAGGATCTGGTCGCCGCAATGTCAAACTACCAGCAGCAACGTCCACGTGTCAGCGCCTATGACAAGATCATGAACGCTCAATGCACATCTCATCCGAATCATAAACATGCAGCCAAGGACTGTTTCATCTACAAGCAATTCGCCGAGCACTACACGGCGCAACTTCAGAAACCGACTGACAGAGTCGGGACTTCAGGAACCAAGAAGGATGATGGAAATGACCACAGGACCGAGTTGAACCATATCTTCGGAGGACCACTCACCTACGTGTCGAAGCGAAAGCAGAAGTTGGCCGACAGAGAAATCAACGCAGTTCAGCCTGAAGTTCCACGTTACCTACGATGGTCGGAGGTGGCTATCACGTTTAACCGCTCGGATCACCCTGACCGAGTGGTTCACCCGGGGCGGTATTCCCTGGTATTAGACCCGGTTGTCCGTAATGTCAAGCTCAAGCATGTTCTCATTGATGGTGGCAGCGCTCTCAATATCCTCTTTGCCAAGATACTGGACGAGATGCAGATCCCAAGGTCTGAGTTAAAACCAAGTTTAGCCCCTTTTCATGGAGTTATTCCAGGGTAGTCTTCCCAACACCCCCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGTCGTCGCTGCGGCGAGCGGTTTCAGCTCACTCAAAGCGTATACCGTTATCCCAGATCAGGATACGCCAGAGA ACCTGTGACAAGGCCAGCAAGCCAGACCGTTAAAGGCCGGTGCTGGGCTTTCATGGTCCGCCCCTTGGCGACACAC去除載體(pMD 18-T Vector)後的序列結果為GGGGGTCTCGGGAAAACAACGGCAACGGTAACGGCAACAATGGCCAAAAAGATTGCAAGCGTAAGCCCGAGGATCTGGTCGCCGCAATGTCAAACTACCAGCAGCAACGTCCACGTGTCAGCGCCTATGACAAGATCATGAACGCTCAATGCACATCTCATCCGAATCATAAACATGCAGCCAAGGACTGTTTCATCTACAAGCAATTCGCCGAGCACTACACGGCGCAACTTCAGAAACCGACTGACAGAGTCGGGACTTCAGGAACCAAGAAGGATGATGGAAATGACCACAGGACCGAGTTGAACCATATCTTCGGAGGACCACTCACCTACGTGTCGAAGCGAAAGCAGAAGTTGGCCGACAGAGAAATCAACGCAGTTCAGCCTGAAGTTCCACGTTACCTACGATGGTCGGAGGTGGCTATCACGTTTAACCGCTCGGATCACCCTGACCGAGTGGTTCACCCGGGGCGGTATTCCCTGGTATTAGACCCGGTTGTCCGTAATGTCAAGCTCAAGCATGTTCTCATTGATGGTGGCAGCGCTCTCAATATCCTCTTTGCCAAGATACTGGACGAGATGCAGATCCCAAGGTCTGAGTTAAAACCAAGTTTAGCCCCTTTTCATGGAGTTATTCCAGGGTAGTCTTCCCAACACCCCC
b.將上述去載體(pMD 18-T Vector)後的序列提交到NCBI，使用BLAST程序對GenBanK基因庫進行同源序列搜索，結果顯示靶序列來源於水稻。與靶序列相似的基因序列號如下38344628；37534952；50931185；54287609；37532102；37533012；39546270；5902444；34913644；52353363；54291739；50920793；40882693；38346966；53982138；38347562；9988424；50932123；38344380；38346888；21741410；52353374；37532100；37532196；37531820；51451363；38346188；32480044；38347303；38344596；38344319；50300537；50931111；50900820；32488767；37536646；38344177；37531824；34896656；34906286；37532308；50932119；46485805；38346695；51038246；38567795；4680183；32488246；38344494；32488502；37537100；20303586；50931925；34896928；37530834；54291738；50582731；29788855；38345918；34015095；50932399；34896494；37532648；22725926；50582686；50878388；50900958；38347153；50932291；37532038；37535232；37533636；34902892；37532552；38346443；32492099；38567701；37533230；50900996；37991853；38345222；38347264；38344528；37530352；38345568；50399972；52353739；38346855；37533528；37534244；32482939；54287583；37532398；34015138；38346685；50920633；34015355；50511475；50920201；38346605c.接著使用BLASTx程序(因為目標是要找保守序列，而從蛋白質序列上更容易反映這一點，所以使用了BLASTx，以便將DNA序列翻譯成胺基酸序列)，找出得分最高的100個相似序列，然後進行多序列比對，最後只取了家族關係最近的72條。並用Clustlw軟體對這72條序列進行多序列比對以找到他們的共有序列。然後拿靶序列與共有序列進行比對，結果如下queryKDCKRKPEDLVAAMSNYQQQRPRVSAYDKIMNAQCTSHPNHKHAAKDCFIYKQFAEHYTAQLQKPTDRVGTSGTKKDconsKDRKRKPeELVATashsSRQRSrvNTfDKIMNsQCPHHPNSNHvAKdCFvYKQFaeQYTkttrKnsdeeqstsrkkdqueryDGN-------DHRTELNHIFGGPLTYVSKRKQKLADREINAVQPEVPRYLRWSEVAITFNRSDHPDRVVHPGRYSLVcons D-gDtpagFqDhRkELNHIFGGpIAYeSKRKqKLteREinaVQPdtPqyLrWSEialkFdrsDHPDrvVhPGrYPLVqueryLDPVVRNVKLKHVLIDGGSALNILFAKILDEMQIPRSELKPSLAPFHGVIPGSScons IdpvVrNvKLrRtLIDGGSaLNILFAkTLDdMQIPRsELkPSnaPFHGviPGIS說明query為靶序列(已經翻譯成蛋白質)cons為同家族的共有序列下劃線「——」標出了保守性的位點d.根據資料表明NBS-LRR類植物抗性基因序列有特有的結構(1)亮氨酸富集重複序列域(LRR)這一結構因亮氨酸在其中呈規律性重複而得名。LRR都具有「XLXXLXLXX」的結構。(2)核苷酸結合位點(NBS)NBS由三個區域組成，第一個區域為磷酸結合環(P-loop)，又稱為激酶(kinase)la，作用是結合ATP或GTP的磷酸，其共有序列為GM(G/P)GXGK(a/T)(X為任意胺基酸，a為疏水胺基酸)。第二個區域為激酶2，共有特點是4個疏水胺基酸殘基後緊跟一個不變的帶負電的天冬氨酸，但在植物中，這一區域的兩邊還具有高度保守的胺基酸，共有序列為K(K/R)XaaaaDDV(W/D)。第三個區域為激酶3a，與DNA的嘌呤或核糖結合有關，通常含有一個精氨酸殘基，其保守區為SraaaT(T/S)R.我們根據編碼胺基酸位置的不同(考慮閱讀框ORF的不同，分別從+1、+2和+3鹼基開始閱讀)在靶序列中尋找到這些特徵結構，結果如下按照+1閱讀框，RSD130的蛋白質序列為GGLGKTTATVTATMAKKIASVSPRIWSPQCQTTSSNVHVSAPMTRS*TLNAHLIRIINMQPRTVS STSNSPSTTRRNFRNRLTESGLQEPRRMMEMTTGPS*TISSEDHSPTCRSESRSWPTEKSTQFSLKFHVTYDGRRWLSRLTARITLTEWFTRGGIPWY*TRLSVMSSSSMFSLMVAALSISSLPRYWTRCRSQGLS*NQV*PLFMELFQGSLPNTP。
分析表明，具有NBS類型的Kinase I和Kinase II以及LRR的LXXL保守序列。
按照+2閱讀框，RSD130的蛋白質序列為GVSGKQRQR*RQQWPKRLQA*ARGSGRRNVKLPAATSTCQRL*QDHERSMHISSES*TCSQGLFHLQAIRRALHGATSETD*QSRDFRNQEG*WK*PQDRVEPYLRRTTHLRVEAKAEVGRQRNQRSSA*SSTLPTMVGGGYHV*PLGSP*PSGSPGAVFPGIRPGCP*CQAQACSH*WWQRSQYPLCQDTGRDADPKV*VKTKFSPFSWSYSRVVFPTP。
分析表明，含有LRR的LXXL保守序列。
按照+3閱讀框，RSD130的蛋白質序列為GSRENNGNGNGNNGQKDCKRKPEDLVAAMSNYQQQRPRVSAYDKIMNAQCTSHPNHKHAAKDCFIYKQFAEHYTAQLQKPTDRVGTSGTKKDDGNDHRTELNHIFGGPLTYVSKRKQKLADREINAVQPEVPRYLRWSEVAITFNRSDHPDRVVHPGRYSLVLDPVVRNVKLKHVLIDGGSALNILFAKILDEMQIPRSELKPSLAPFHGVIPG*SSQHP。
分析表明，含有NBS的KinaseIII型和LRR的LXXL及LXL保守序列。
e.與現有NBS-LRR序列比對，靶序列可能為一個新抗性基因。由於是根據NBS-LRR已公布的序列設計的簡併引物，所以進一步分析了靶序列和NBS-LRR序列的同源性。首先從NCBI上檢索到231條NBS-LRR序列，然後我們用Clustlw軟體對這231條序列進行多序列比對及聚類分析，結果顯示NBS-LRR的231條序列間存在差異，同源性很底，推斷可能為新基因。
上述分析表明，用抗性基因保守序列的引物從RSD130擴增的序列具有抗病基因的NBS區域的激酶1(Ploop環)和激酶III型的保守序列，可能為一個新的抗病基因。
(3)候選大片段克隆的功能補償鑑定。
上述候選RSD130可轉化大片段克隆轉化農桿菌LBA4404，採用農桿菌介導方法轉化水稻品種臺北309，獲得轉基因水稻植株(T0代)，並對T1代轉基因水稻進行了人工飼餵稻褐飛蝨試驗(圖6)。結果表明，轉基因水稻表現出明顯的抗性。
權利要求
1.一種利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法，其特徵在於，包括如下步驟a.建立供體植物可轉化大片斷基因組文庫；b.通過轉基因技術將可轉化大片斷基因組文庫導入受體植物，獲得全基因組突變體庫；c.通過對突變體庫的篩選、鑑定和遺傳分析，以及對大片段克隆的亞克隆、序列分析，克隆並獲得控制突變性狀的基因；d.對克隆的控制突變性狀的基因進行測序和功能補償分析。
2.根據權利要求1所述的利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法，其特徵在於，供體植物可轉化大片斷基因組文庫為雙元細菌人工染色體庫或可轉化人工染色體庫。
3.根據權利要求1所述的利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法，其特徵在於，轉基因技術選用農桿菌介導、基因槍、花粉管通道、穗頸注射中的任一種。
4.根據權利要求1所述的利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法，其特徵在於，供體植物為野生稻，受體植物為栽培稻，也包括供體植物、受體植物為稻屬以外的其它植物。
5.包括權利要求1所獲得的全基因組突變體庫。
6.包括權利要求1所克隆的控制突變性狀的基因。
7.包括權利要求1所篩選的農藝性狀得到改良的突變體在育種方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種利用全基因組基因敲入突變體庫克隆近緣植物有利基因的方法，它包括構建自野生稻衍生的可轉化大片斷基因組文庫，再通過農桿菌介導、基因槍、花粉管通道、穗頸注射等轉基因技術，將大片段基因導入栽培稻中，建立栽培稻全基因組基因敲入突變體庫，在構建突變體庫前可根據保守序列、分子標記等對大片段克隆進行篩選，通過突變體抗蟲、抗病等農藝性狀的鑑定，篩選出控制突變性狀的大片段克隆，大片段克隆再經亞克隆、功能補償及序列分析後，最終鑑定、克隆出控制突變性狀的基因。同時獲得重要經濟性狀得到改良的轉基因材料用於水稻品種改良。這一技術也適用於克隆其它植物有利基因。
文檔編號C12N15/82GK1769443SQ20051003118
公開日2006年5月10日 申請日期2005年1月21日 優先權日2005年1月21日
發明者曹孟良, 辜顯旺, 邢俊傑, 成志偉, 楊劍, 李亦群, 梁玲, 楊塞, 殷緒明, 張朝良, 袁隆平 申請人:湖南西城雜交水稻基因科技有限公司