豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗及其製備方法
2023-07-27 23:59:21 3
專利名稱：豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種基因工程疫苗，尤其是一種豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗及其製備方法。
背景技術：
養殖業的迅速發展，在最大程度上得益於科技的進步，但同時也帶來了隱患。科技的進步使養殖業向集約化和工廠化發展，畜禽對病原微生物的易感性增加，病害頻繁發生， 交叉感染，混合感染嚴重，在生產上造成很大的經濟損失。近年來，隨著養豬業的發展，大型集約化豬場的相繼出現，疾病問題也接踵而至， 各種畜禽疾病頻繁發生，由於各養殖場的技術力量參差不齊，診斷檢測設備也很有限，導致許多臨床獸醫在用藥方面較為混亂，濫用和無針對性的用藥問題成為普遍現象。如此就進一步促使細菌耐藥株不斷產生，畜禽疾病的預防和治療更加困難，甚至治療無效。眾所周知，病毒性傳染病至今尚未有效的治療辦法，一旦爆發，只能立即剖殺、隔離。近幾年來因各種疾病死亡的畜禽至少佔飼養總數的8 10%。因此對於烈性傳染病重在預防。目前病毒性傳染病主要靠疫苗接種預防和治療，為此我國投入了大量人力、財力開發各種疫苗產品， 對控制疾病流行起到了關鍵作用。針對目前國內養殖業的用藥狀況，迫切需要研製一種豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，以滿足廣大養殖業和臨床獸醫需求。豬偽狂犬病(PRV)和豬細小病毒病(PPV)均是引起豬繁殖障礙的主要病原，PRV和 PPV引起的疾病在我國有很高的感染率和發病率，給養豬企業造成了巨大的經濟損失。此外，兩者在臨床上混合感染的現象也多有報導。傳統的常規疫苗在這兩種疾病的預防控制中起到了一定的作用，但是各種疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗存在發生重組及毒力返強的潛在威脅，滅活疫苗免疫效果不穩定等。為了更好的控制PRV和PPV感染， 急需研製一種更加安全有效的PRV-PPV 二價基因工程活載體疫苗。
發明內容
本發明目的在於提供一種安全有效的豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗。本發明還提供了該疫苗的製備方法。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案
一種豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，其主要材料由豬細小病毒的 VP2基因、豬偽狂犬病毒載體和VERO細胞等組成；該疫苗由豬細小病毒的VP2基因與豬偽狂犬病毒載體重組，再經病毒篩選而得。所述豬細小病毒的VP2基因是由豬細小病毒通過PCR擴增而得；所述豬偽狂犬病毒載體為基因缺失載體。上述基因工程活載體疫苗的製備方法，包括如下步驟
①以豬細小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴增豬細小病毒VP2基因；
②將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中，得到PCK-VP2質粒；③將構建的PCK-VP2質粒與偽狂犬病毒PRV基因組共轉染VERO細胞；
④篩選得到豬細小病毒病-豬偽狂犬病重組病毒PCK-VP2-PRV。然後對篩選得到的病毒進行純化和鑑定、對重組病毒進行生物學特性研究及病毒滴度的測定、用重組病毒進行動物實驗。目前我國的養豬業養殖環境差、疫病交叉感染嚴重，生豬免疫力低下，在大量使用抗生素等化學藥品後，造成豬肉肉質欠佳、藥物殘留嚴重。這一系列問題不僅給我國的養豬業帶來了巨大損失，影響我國的生豬出口，也為廣大人民群眾的健康埋下了隱患。研製豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗疫苗，將利於提高我國農村生豬的養殖水平， 改善養豬業的現狀。本發明通過採用基因工程、細胞工程等先進技術，研發豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，利用偽狂犬病毒(PRV)作基因表達載體，將具有良好免疫原性的豬細小病毒(PPV) VP2基因插入該載體中使其毒力相關基因缺失而構建重組載體，將該重組載體與偽狂犬病毒基因組重組進而得到重組病毒。該疫苗的生產技術具有安全、穩定、可規模化等優點，疫苗能夠達到良好的預防效果。本疫苗的研製和應用，開拓了生物醫藥研發的新方向，使新一代動物生物製品更加安全、廉價、使用方便，有利於促進我國生豬養殖業的發展，造福廣大人民，對促進社會和經濟進步意義重大，具有很好的社會和經濟效益。
圖1為VP2基因PCR擴增產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖，圖1中M為Mark2000，1-6 為VP2基因PCR產物；
圖2為構建的重組質粒PCK- VP2酶切鑑定結果，圖2中M為Mark，1為構建的重組質粒，2為重組質粒雙酶切鑑定；
圖3為重組病毒PCK-VP2-PRV的酶切鑑定結果，圖3中M和4為Mark, 1-3為重組病毒的BamHI和Kpn I雙酶切；
圖4為重組病毒PCK-VP2-PRV的PCR鑑定結果，圖4中M為Mark，1-2為重組病毒的 PCR鑑定。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明進行詳細說明，但本發明的保護範圍不限於此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例所用LB液體培養基組成為1% 胰蛋白腖、1%氯化鈉和0. 5%酵母提取物；LB固體培養基組成為1%胰蛋白腖、1%氯化鈉、 0. 5%酵母提取物和1. 5%瓊脂。實施例1
一種豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗的製備方法，其包括如下步驟 ①以豬細小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴增豬細小病毒VP2基因，具體為 根據Anal. Ranz等報導的豬細小病毒NADL-2株病毒基因組序列設計了一對包含其結構蛋白VP2基因的PCR引物，上遊引物Pl帶有BamH I酶切位點，下遊引物P2帶有Kpn I 酶切位點。引物委託寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列如下
Pl 5' -TT GGA TCC ATG GCA ACC TCA CCA CC-3'(劃線處為 BamH I 酶切位點)
4P2 5' -TACA GGT ACC GTA AAC ACA TGA GAG CTTG-3『(劃線處為 Kpn I 酶切位點) 以PI、P2為引物，以豬細小病毒NADL-2株病毒基因為模板進行PCR擴增，PCR反應採用50 μ L反應體系，在50 μ L反應體系中加入10XPCR buffer 5 μ L，dNTP 2yL，模板 1口1^，上、下遊引物各14 1^，Taq酶0. 5 μ L，滅菌水39. 5 μ L，總體積50 μ L。反應參數為 95°C預變性5min後進入循環，95°C變性lmin，52°C退火50S，72°C延伸1. 5min, 35個循環後，72°C再延伸lOmin，擴增得到1780bp，結果見圖1。 ②將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中，得到PCK-VP2質粒，具體為
用BanHI和Kpn I將PCR擴增回收的VP2基因及目的載體PCK (購於三博遠志生物技術有限公司)雙酶切，然後進行連接，ΙΟμ 連接體系如下
權利要求
1.一種豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，其特徵在於，其主要材料由豬細小病毒的VP2基因、豬偽狂犬病毒載體和VERO細胞組成；該疫苗由豬細小病毒的VP2 基因與豬偽狂犬病毒載體重組，再經病毒篩選而得。
2.如權利要求1所述的基因工程活載體疫苗，其特徵在於，所述豬細小病毒的VP2基因是由豬細小病毒通過PCR擴增而得；所述豬偽狂犬病毒載體為基因缺失載體。
3.權利要求1或2所述基因工程活載體疫苗的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟①以豬細小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴增豬細小病毒VP2基因；②將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中，得到PCK-VP2質粒；③將構建的PCK-VP2質粒與偽狂犬病毒PRV基因組共轉染VERO細胞；④篩選得到豬細小病毒病-豬偽狂犬病重組病毒PCK-VP2-PRV。
全文摘要
本發明涉及一種豬細小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，其主要材料由豬細小病毒的VP2基因、豬偽狂犬病毒載體和VERO細胞組成；該疫苗由豬細小病毒的VP2基因與豬偽狂犬病毒載體重組，再經病毒篩選而得。具體方法如下先以豬細小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴增豬細小病毒VP2基因；然後將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中得PCK-VP2質粒；再將構建的PCK-VP2質粒與偽狂犬病毒PRV基因組共轉染VERO細胞；最後篩選得到豬細小病毒病-豬偽狂犬病重組病毒PCK-VP2-PRV。試驗證明其在仔豬體內具有良好的免疫保護性。
文檔編號C12N15/869GK102266557SQ20111020315
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者吳寧鵬, 張遂平, 李奇, 李明魁, 楊慧敏, 王菊萍, 邵豔華, 郭芳茹 申請人:河南亞衛動物藥業有限公司