聚乙二醇－滅活疫苗黏膜免疫劑的製作方法

2023-07-28 03:04:41

專利名稱：聚乙二醇－滅活疫苗黏膜免疫劑的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫製劑。具體涉及聚乙二醇濃縮滅活病毒疫苗製備黏膜免疫劑。
背景技術：
為預防病毒性感染的呼吸道疾病，如嚴重急性呼吸道綜合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)、病毒性流感及病毒性禽流感等，發展疫苗是十分迫切的需要。鑑於SARS病毒和流感病毒等可在組織細胞中培養，並可達到較高滴度，目前國內外均首選研究滅活疫苗。有研究表明，由於某些病毒發病機理中可能有抗體增強反應(antibody enhancement)，IgG抗體可能在此階段中產生不良反應；某些病毒的全病毒疫苗(如流感病毒)注射難以誘生局部免疫反應等現象。因此，經病毒自然感染途徑進行局部鼻黏膜免疫方式，漸受重視。鼻腔黏膜血管和淋巴管豐富，經局部鼻腔免疫，疫苗易於進入局部淋巴組織，誘導局部免疫應答。經鼻腔免疫可以主要誘生局部IgA抗體，可阻斷病毒經呼吸道侵入人體，有效防治呼吸道病毒病的發生和發展。在其他微生物感染，如HIV等已證明局部黏膜免疫可誘生局部免疫應答及一定量的血清抗體。
藥用級聚乙二醇(PEG)產品無毒、無刺激、具有良好的水溶性，其系列產品應用領域廣泛，可作為藥劑的輔料。隨著新藥的不斷開發，其用途越來越廣，常用作藥物載體，分散增溶劑等。已有研究利用聚乙二醇改造醫藥產品中的蛋白質-多肽類藥物，如α與β幹擾素、白介素等，經聚乙二醇改造的蛋白質-多肽類藥物的結構可延長藥物作用時間，減少用藥次數，而大大降低使用成本。改良型PEG-幹擾素是一種更為有效的B肝治療藥物，與標準幹擾素比較，每周只需注射1次，且接受PEG-幹擾素治療者的顯效反應率要高出一倍左右。聚乙二醇化藥逐漸增多，如PEG化喜樹鹼、PEG化紫杉醇、PEG化多肽類藥物和PEG化抗高血壓藥物等。
局部鼻黏膜免疫一般採用滴鼻或噴霧給藥。滴鼻疫苗以在鼻腔局部滯留時間較長而吸收良好為佳，同時疫苗病毒的濃度高而體積小並有利於疫苗製劑的穩定，且對鼻黏膜不產生刺激作用。目前進行的研究的疫苗控釋製劑主要是微球或其它微粒製劑，通過材料的選擇和包裹程度，可控制疫苗釋放速度。

發明內容
本發明的目的是提供一種增強穩定性和免疫原性的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑。具體涉及聚乙二醇濃縮滅活病毒疫苗製備黏膜免疫劑。
本發明聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑採用藥用級分子量4000～10000的聚乙二醇，濃縮、純化滅活病毒液及製備疫苗，利用聚乙二醇作為免疫佐劑對滅活疫苗蛋白修飾、連接，增強疫苗的穩定性和免疫原性。
本發明所述的疫苗可以是蛋白疫苗或亞單位疫苗，所述的滅活病毒可以是經呼吸道感染的病毒，如流感病毒、SARS冠狀病毒等。
本發明通過下述方法和步驟進行，採用20-35％藥用級聚乙二醇按1∶2～1∶5的比例，加入已滅活的病毒培養液，按常規方法孵育24～72小時，經聚乙二醇連接的病毒通過高速離心濃縮純化，病毒沉澱物溶解於磷酸緩衝鹽水使濃縮50～200倍，即製成粗製滅活病毒黏膜免疫製劑。
本發明聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑其中聚乙二醇的使用濃縮可根據不同疫苗進行調節。
本發明的優點在於採用聚乙二醇不僅作為疫苗濃縮和純化的製劑，而且可作為疫苗的緩釋劑以延長疫苗在鼻腔的滯留時間，提高鼻黏膜吸收，且對局部鼻黏膜和纖毛無損傷。同時聚乙二醇將滅活疫苗蛋白連接的作用，具有增強免疫應答的佐劑作用，特別是對黏膜免疫疫苗製劑，不僅可誘生局部免疫應答產生分泌型IgA抗體，而且可誘導全身免疫應答，血清中出現保護性抗體。
本發明將聚乙二醇(藥用級)作為滴鼻病毒疫苗緩釋液，能增強疫苗的穩定性，同時增強疫苗的免疫原性，特別是增強局部黏膜免疫應答，具有佐劑樣的作用。


圖1是免疫小鼠血清抗SARS冠狀病毒的中和抗體效價，圖2是PEG-滅活SARS病毒疫苗黏膜免疫劑免疫小鼠的氣管-肺盥洗液中抗SARS FITC-IgA的檢測結果。
具體實施例方式
實施例1 聚乙二醇濃縮滅活SARS冠狀病毒將藥用級聚乙二醇6000配製成35％聚乙二醇/1.75M NaCl。按1∶5量加入已滅活的SARS冠狀病(CGMCC No.0977)毒液，置4℃孵育24小時。離心13,000rpm，30分鐘。去除上清，沉澱物溶於磷酸緩衝液(0.01M PBS，PH7.2)，使病毒濃縮至100倍，得粗製滅活SARS冠狀病毒黏膜免疫製劑。
實施例2 聚乙二醇濃縮滅活裂解甲型流感病毒將藥用級聚乙二醇8000配製成30％聚乙二醇/1.75M NaCl。按1∶4量加入已滅活的裂解甲型流感病毒液，H3N3巴拿馬株(2003年國內應用的生產株)置4℃孵育24小時。離心13,000rpm，30分鐘。去除上清，沉澱物溶於磷酸緩衝液(0.01M PBS，PH7.2)，使病毒濃縮至50倍，得粗製滅活禽流感病毒黏膜免疫製劑。
實施例3 聚乙二醇增強滴鼻SARS冠狀病毒疫苗的免疫原性SARS冠狀病毒(G250)滅活疫苗，免疫劑量每隻小鼠50μg；PEG-SARS冠狀病毒滅活黏膜免疫製劑，免疫劑量每隻小鼠20μg，分別經滴鼻免疫Balb/c小鼠，每隔2周免疫1次，共免疫4次。第4次將強免疫後2周將小鼠處死，取血分離血清，並用磷酸緩衝液灌洗小鼠的氣管和肺。血清和氣管-肺灌洗液保存於-70℃，待檢。血清用於檢測抗-SARS冠狀病毒的中和抗體；氣管-肺灌洗液用於檢測抗-SARS冠狀病毒IgA(間接免疫螢光法)。結果顯示PEG-滅活疫苗滴鼻劑的免疫明顯高於滅活疫苗，(陰性結果，細胞不顯螢光)，血清中和抗體效價高於單獨滅活疫苗，更為有意義的是PEG-PEG-滅活疫苗滴鼻劑局部誘導的黏膜免疫應答(IgA)明顯高於單獨滅活疫苗以及氫氧化鋁-滅活疫苗，提示聚乙二醇通過使病毒顆粒之間連接可以增強疫苗的免疫原性，特別是增強局部黏膜免疫應答，具有佐劑樣的作用。此外，上述滅活病毒通過聚乙二醇連接後分子變大，蛋白穩定時間延長，4℃保存，半年後仍然具有免疫原性。
表1是間接免疫螢光檢測免疫小鼠氣管-肺灌洗液中抗-SARS冠狀病毒IgA。
表1Immunized The way ofMouseFluorescence intensity of IF-IgA*Groups inoculation numberSARSV-alum s.c. 2 - -SARSV i.n. 5 - - -- ±SARSV-CpG i.n. 5 ++ + +±±SARSV - i.n. 5 +++ +++ ++ + ±SARSV-PEG i.n. 5 ++ ++ ++ ++ ++
權利要求
1.聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是以藥用級分子量4000～10000的聚乙二醇，濃縮、純化滅活病毒，製成疫苗黏膜免疫劑。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是所述的滅活病毒是經呼吸道感染的病毒。
3.根據權利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是所述的滅活病毒是流感病毒或SARS冠狀病毒。
4.根據權利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是所述的疫苗可以是蛋白疫苗或亞單位疫苗。
5.根據權利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是所述的聚乙二醇濃度為20-35％，聚乙二醇∶滅活病毒培養液比例為1∶2～1∶5，滅活疫苗濃縮50～200倍。
6.根據權利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是所述的聚乙二醇作為滅活病毒疫苗的緩釋劑。
7.根據權利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是所述的聚乙二醇作為稀釋液和穩定劑。
8.根據權利要求1所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是所述的聚乙二醇為免疫佐劑。
9.根據權利要求1或4所述的聚乙二醇-滅活疫苗黏膜免疫劑，其特徵是其中聚乙二醇的使用濃縮可根據不同疫苗進行調節。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及一種聚乙二醇－滅活疫苗黏膜免疫製劑。本發明採用藥用級聚乙二醇，濃縮、純化滅活病毒液及製備疫苗，利用聚乙二醇作為免疫佐劑對滅活疫苗蛋白修飾、連接，增強疫苗的穩定性和免疫原性，及局部黏膜免疫應答。經動物實驗結果顯示，本發明能延長疫苗在鼻腔的滯留時間，提高鼻黏膜吸收，且對局部鼻黏膜和纖毛無損傷。免疫效果明顯高於滅活疫苗，4℃保存，半年後仍然具有免疫原性。
文檔編號A61K39/12GK1562367SQ20041001752
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月7日 優先權日2004年4月7日
發明者瞿滌, 聞玉梅, 姚忻 申請人:復旦大學