鈣離子結合蛋白的提純方法
2023-07-11 13:23:16
專利名稱：鈣離子結合蛋白的提純方法
技術領域：
本發明涉及一種通過陽離子交換法提純鈣離子結合蛋白的方法。更加具體地說，本發明涉及一種純化鈣離子結合蛋白的方法，其包含使所述的蛋白與陽離子交換載體在鈣離子的存在下接觸，使所述的蛋白被吸附到該陽離子交換載體上，隨後洗滌，從該陽離子交換載體上洗脫下所述的蛋白，並且由這種方法獲得的鈣離子結合蛋白基本上不含有汙染物。
譬如，已知一種利用陰離子交換色譜提純的獨特方法，其中二價的陽離子結合蛋白被吸附在陰離子交換樹脂上，並且隨後用二價陽離子洗脫下來從而特異性地純化所述二價陽離子結合蛋白，如日本專利公開號200180/1990所公開的。按照這種方法，螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)被加入到含有二價陽離子結合蛋白的溶液中以首先除去二價離子。隨後，所得的溶液與陰離子交換樹脂如MonoQ接觸，使二價陽離子結合蛋白被吸附到陰離子交換樹脂上。最後，加入氯化鈉和氯化鈣從陰離子交換樹脂上洗脫下二價陽離子結合蛋白。然而，大多數的天然蛋白在生理條件下帶有負電荷，因此許多汙染物而不是感興趣的蛋白被優先吸附到陰離子交換樹脂上，由此妨礙了所需蛋白的有效純化。所以，這種通過使所需蛋白吸附在陰離子交換樹脂上的提純方法優選用於少量的蛋白溶液或提純過程的後期。
日本專利公開號258286/1995公開了一種通過陰離子交換法純化鈣離子結合維生素K依賴性蛋白的方法，其中向含有維生素K依賴性蛋白的溶液中加入氯化鈣且令所得的溶液經過陰離子交換樹脂，從被汙染蛋白中分離出所需的蛋白。然而，這種方法的缺陷在於必須使大體積的含有所需蛋白的餾份經過樹脂，因此後續操作變得煩瑣，尤其是當以大規模進行時。
膜聯蛋白V，一種鈣離子結合蛋白，是不帶有糖鏈的約34kDa分子量的簡單蛋白，其具有生理活性，如抗凝活性、角膜上皮伸展活性和磷脂酶A2抑制活性。已知膜聯蛋白V分布在不同的組織中並且在包括人胎盤在內的活機體中分泌(Chem.Pharma.Bull.，38，1957-1960，1990)。膜聯蛋白V被稱作鈣離子結合蛋白，因為它具有通過鈣離子結合脂質膜的能力。
業已從人體或動物的器官中提取出膜聯蛋白V(日本專利公開號174023/1987)。然而，現今，它可以在大腸桿菌和酵母中利用基因重組技術生產(日本專利公開號20095/1989和219875/1991)。
在含膜聯蛋白V的溶液用沉澱法、膜過濾法和離心法的預處理之後，膜聯蛋白V按照慣例通過硫酸銨分級、陰離子交換色譜、疏水色譜和親和色譜的聯合來提純(Jurgen Romisch等，Biochem.J.272，223-229，1990；T.R.Hawthorne等，Journal of Biotechnology 36，129-143，1994)。
如上所述，對於在工業規模中使用，常規方法在成本、效率和操作性的立場上看都成問題。
本發明的目的在於提供一種以簡便和有效的方式、從含有鈣離子結合蛋白和汙染物的液體樣本中無需任何預處理(如加入螯合劑)分離和純化鈣離子結合蛋白的方法。
本發明的另一目的在於提供通過本發明的方法獲得的高純度的膜聯蛋白V。
在該情況中，本發明人研究達到了上述目的並且發現膜聯蛋白V，一種鈣離子結合蛋白，在氯化鈣的存在下和約中性的pH下吸附到SP-瓊脂糖陽離子交換載體上。本發明人還發現，膜聯蛋白V對SP-瓊脂糖陽離子交換載體的吸附尤其是在鈣離子的存在下發生，但在非鈣離子的其他二價離子(如鎂離子)的存在下很少觀察到吸附。鑑於這些發現，本發明人將氯化鈣加入到大量的產膜聯蛋白V的細胞的勻漿中，這些細胞通過基因重組技術生產並且使所得的勻漿與用含有氯化鈣的氯化銨緩衝液平衡的SP-瓊脂糖陽離子交換載體接觸。衝洗之後，洗脫是通過降低或消除氯化鈣水平進行或利用含有氯化鈉的氯化銨緩衝液在鈣離子的存在下進行，以便連續純化出具有高純度的膜聯蛋白V。而且，通過在pH 9.0下進行所述的陽離子交換色譜可以成功地除去痕量的殘餘蛋白酶。
所以，本發明涉及一種通過陽離子交換色譜利用SP-瓊脂糖陽離子交換載體在氯化鈣的存在下純化天然或通過基因重組技術生產的鈣離子結合蛋白的方法。
本發明還涉及天然或由基因重組技術生產的、因而通過本發明的方法獲得的鈣離子結合蛋白。
圖2表示對於下面物質的凝膠過濾色譜的結果(a)陽離子交換色譜之前的樣品，(b)經過陽離子交換色譜的級份，和(c)洗滌後從陽離子交換色譜洗脫出的級份。
圖3表示對於洗滌後從陽離子交換色譜洗脫出的級份的凝膠過濾色譜的結果。
圖4表示膜聯蛋白VI從SP-瓊脂糖的洗脫模式。
圖5是一張表示膜聯蛋白VI的SDS-PAGE的結果的相片，第1道BioRad預染色的標記蛋白；磷酸化酶B(116,000)，BSA(80,000)，卵清蛋白(52,500)，碳酸酐酶(34,900)，大豆胰蛋白酶抑制劑(29,900)，溶菌酶(21,800)；第2道膜聯蛋白VI標準品；第3道用DEAE-Toyopearl(樣品)洗脫；第4道SP-瓊脂糖，5號級份；第5道7號級份；第6道9號級份；第7道16號級份；第8道，51號級份；第9道54號級份；和第10道57號級份。
圖6表示凝集因子X從SP-瓊脂糖的洗脫模式。
圖7是一張表示凝集因子X的SDS-PAGE的結果的照片。第1道BioRad預染色的標記蛋白；磷酸化酶B(116,000)，BSA(80,000)，卵清蛋白(52,500)，碳酸酐酶(34,900)，大豆胰蛋白酶抑制劑(29,900)，溶菌酶(21,800)；第2道市售凝集因子X；第3道4號級份；第4道7號級份；第5道11號級份；和第6道12號級份。
在此所用的陽離子交換載體包括，但不限於，SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖、CM-纖維素、SE-纖維素、S-Spherodex、SP-Spherosil等，它們全部都可以商購。其中，優選使用SP-瓊脂糖。
與載體接觸的蛋白溶液的量可以根據該溶液的濃度或載體的吸附能力而變化。在SP-瓊脂糖的情況中，例如，可以使用0.1-30g/L的蛋白載體。優選使用15-20g/L的蛋白載體。
在與陽離子交換載體吸附時的流速可以是1-150cm/小時，優選15-100cm/小時，更優選50-80cm/小時。另一方面，在從陽離子交換載體洗脫被吸附蛋白時的流速可以是1-150cm/小時，優選30-100cm/小時，更優選30-80cm/小時。
可以用來吸附或從陽離子交換載體洗脫的緩衝液包括任何離子交換色譜中常用的緩衝液，包括氯化銨緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液和Tris-HCl緩衝液。其中，優選使用氯化銨緩衝液。緩衝液的濃度可以在5-100mM的範圍內，優選10-40mM。緩衝液可以在pH 5-10下使用，優選在pH 8-9.5下，這些條件下可以除去蛋白酶。更優選地，使用20mM(約pH 9.0)氯化銨緩衝液。
作為鈣離子的來源，可以使用任何可以產生鈣離子的物質，包括氯化鈣、碳酸鈣，優選氯化鈣。
當將大量的氯化鈣加入到組織或細胞或血漿的勻漿中時，疏水蛋白或高分子量化合物有時會由於鹽析沉積。所以，鈣離子可以優選以不但使鈣離子結合蛋白結合到並從陽離子交換載體分離而且在含有鈣離子結合蛋白的液體樣品中不形成沉澱的量使用。
為了使鈣離子結合蛋白吸附到陽離子交換載體上，鈣離子可以以5-100mM的濃度優選使用。更加優選地，可以使用濃度為10-30mM的鈣離子。在與緩衝劑聯合用來吸附到和自陽離子交換載體洗脫時，可以優選使用含有20mM氯化鈣的20mM氯化銨緩衝液(pH 9.0)。
可以通過消除或降低緩衝液中的鈣離子水平或者加入其他除鈣離子之外的抗衡離子，或採用這兩種方法，把被吸附的鈣離子結合蛋白從載體上洗脫下來。抗衡離子包括Na+、Li+、K+離子等。優選地，可以通過向氯化銨緩衝液中加入1-500mM，更優選50-500mM，特別更優選50-300mM氯化鈉進行洗脫，首選向含有20mM氯化鈣的20mM氯化銨緩衝液(pH 9.0)中加入200mM氯化鈉。或者，只要通過降低氯化鈣水平至低於5mM就可以從載體上洗脫下被吸附的鈣離子結合蛋白。
本發明的方法，甚至在單獨使用時，也可以提供80％或更高純度的鈣離子結合蛋白的純化。然而，它與其它提純方法聯合使用時將可以更加有效。譬如，在含有鈣離子結合蛋白的液體樣品被不溶性物質汙染的情況中，適宜在本發明的方法之前進行預處理以除去此類物質，例如離心、鹽析、膜過濾等。
除了上述方法以外，多種色譜方法的其它提純過程，包括陰離子交換色譜、疏水色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜、吸附色譜等，可以與本發明的方法一起進行以提供更高純度的鈣離子結合蛋白。本發明的方法可以在上述方法的任何階段使用。優選地，當把含有鈣離子結合蛋白的樣品預處理除去不溶性物質之後，可以採用本發明的方法並且進而進行陰離子交換色譜。更加具體地說，將通過陽離子交換色譜獲得的含膜聯蛋白V級分上樣到Q-瓊脂糖柱上，該柱用含有50mM氯化鈉的10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)平衡，並且衝洗後，用濃度自50mM-500mM氯化鈉的線性梯度進行洗脫，得到具有非常高純度的膜聯蛋白V。
通過本發明方法純化的鈣離子結合蛋白通常包括膜聯蛋白I、II、III、IV、V、VI和VII，但可以是任何具有結合鈣離子的能力的蛋白，如凝集因子X。
本發明的方法可以有效地應用於得自天然或通過遺傳工程化產生鈣離子結合蛋白的動物的血液、體液和組織勻漿，以及細胞勻漿和重組細胞的培養上清液，包括植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和動物細胞。優選地，本發明的方法可以應用在生產鈣離子結合蛋白的重組酵母細胞中。更加優選地，本發明的方法可以應用在產生膜聯蛋白V的酵母細胞的細胞勻漿或培養上清液中。
由此製備的膜聯蛋白V，具有特有的生理活性，可以單獨或與藥學可接受載體、稀釋劑、穩定劑或防腐劑一起配製為藥物製劑成為任何常規劑型，例如注射劑、滴眼劑、口服製劑、栓劑等。
按照本發明，提供了一種純化具有高純度鈣離子結合蛋白的有效方法。還提供了通過本發明的方法獲得的基本上不含有汙染物的鈣離子結合蛋白。
按照本發明的方法，大多數在生理條件下帶有負電荷的蛋白經過陽離子交換載體，然而可以與鈣離子形成複合物的鈣離子結合蛋白優先吸附到載體上。因此，本發明的方法能夠一次性處理大量的樣品同時不會損害陽離子交換載體對汙染蛋白而不是所需蛋白的吸附能力。
從人胎盤cDNA文庫(Clontech Laboratories，Inc.)，通過免疫篩選利用抗膜聯蛋白V單克隆抗體分離出帶有膜聯蛋白V結構基因的噬菌體。隨後從噬菌體製備DNA並用限制性內切酶EcoRI消化產生片段，其隨後插入到pUC118運載體的EcoRI位點構建pMKT7。(2)表達質粒的構建質粒pMKT7用限制性內切酶NcoI和SacI消化，並且通過瓊脂糖電泳分離含有膜聯蛋白V結構基因的DNA片段。合成連接體的加入使該DNA片段的兩個末端轉化為XhoI和BamHI位點。將所得的DNA片段插入到表達運載體pPS1的XhoI和BamHI位點以構建表達運載體pAPCPBI。(3)重組酵母細胞的製備通過醋酸鋰技術用表達質粒pAPCPBI轉化宿主酵母細胞(啤酒糖酵母AH22)。轉化之後，分離出現在不含有亮氨酸的瓊脂培養基上的克隆並且測定表達水平。選擇那些具有高表達水平的克隆並重複鋪板在瓊脂培養基上，分離克隆並且測定表達水平，得到具有穩定性的重組酵母細胞。實施例1重組膜聯蛋白V的純化(1)產膜聯蛋白V的重組酵母細胞的培養在28℃下將產膜聯蛋白V的重組酵母細胞在2L合成選擇培養基上培養3天。隨後將重組酵母細胞接種在88L選擇培養基中並且在28℃下培養2天。隨後將重組酵母細胞轉移至810L的半合成培養基(40g蔗糖，5g酵母提取物，5g硫酸銨和0.5g硫酸鎂七水合物，在1L培養基中)並且在28℃下繼續培養24小時。(2)純化之前大量膜聯蛋白V的預處理大量培養溶液經0.1μm膜濾器過濾收集重組酵母細胞，其用French壓式細胞勻漿器進行物理上的破裂。破裂的細胞混懸液用膜濾器過濾並用超濾器濃縮濾液。向濃縮物中加入乙酸以便等電沉澱(pH9.0)。所形成的沉澱用膜濾器過濾除去沉澱。隨後，濾液的pH用氨調至9.0，隨後用超濾器再次濃縮該濾液(預處理溶液)。(3)陽離子交換色譜(通過降低或消除氯化鈣水平洗脫)向預處理溶液中加入氯化鈣溶液得到20mM的終濃度並且經過使用SP-瓊脂糖(Pharmacia)的陽離子交換色譜。具體地說，將添加了氯化鈣的預處理溶液加載在用20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)平衡的柱上，該緩衝液含有20mM氯化鈣和50mM氯化鈉。用緩衝液洗滌後，該柱子進一步用含20mM氯化鈣的20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)洗滌。隨後，用20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)洗脫膜聯蛋白V。(4)陽離子交換色譜(通過提高氯化鈉水平洗脫)如步驟(3)所述，向預處理溶液中加入氯化鈣溶液達到20mM的終濃度，並且隨後用SP-瓊脂糖進行陽離子交換色譜。具體而言，將添加有氯化鈣的預處理溶液加載在用20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)平衡的柱子上，該緩衝液含有20mM氯化鈣和50mM氯化鈉。用緩衝液洗滌後，通過從50mM至最多300mM的氯化鈉的濃度的線性梯度和20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)洗脫出膜聯蛋白V，該緩衝液含有20mM氯化鈣(吸附和洗脫時的流速56.7cm/小時)。
圖2分別表示下列物質通過凝膠過濾色譜獲得的洗脫模式(a)陽離子交換色譜之前的樣品，(b)經過陽離子交換色譜的級份，和(c)從陽離子交換色譜洗脫出的級份。進行凝膠過濾色譜，其中將20μL樣本上樣至用10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.2)平衡的TSKge1 G3000SW×1(7.8mm(ID)×30cm)，該緩衝液中含有0.14M NaCl，流速為125.6cm/小時。對於從陽離子交換色譜洗脫出的級分的凝膠過濾色譜的結果如表1所示，其中純度是由洗脫模式獲得。(5)陰離子交換色譜(與常規技術對比)對預處理溶液進行陰離子交換色譜。將預處理溶液加載在用10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)平衡的Q-瓊脂糖(Pharmacia)柱上，該緩衝液含有50mM氯化鈉。衝洗後，通過從50mM至最多300mM的氯化鈉濃度的線性梯度洗脫出膜聯蛋白V。洗脫級分的凝膠過濾色譜的結果如表1所示。
在用其它純化方法進一步提純之後測定由常規技術獲得的膜聯蛋白V和通過本發明的方法獲得的膜聯蛋白V的抗凝活性。以與日本藥典(第13版，900-901頁)中有關肝素鈉的定量法相同的方式進行抗凝活性的測定。計算抗凝活性，其中由1mg的標準樣本(通過常規技術提純的膜聯蛋白V)引起的凝集時間的延長被定義為一個單位(U)。所以，觀察到通過本發明的方法獲得的膜聯蛋白V沒有失活(表1)。
表1
實施例2重組膜聯蛋白V的純化按照實施例1所述純化的重組膜聯蛋白V，但在步驟(4)的陽離子交換色譜中，所不同的是，用含有20mM氯化鈣和50mM氯化鈉的20mM檸檬酸鹽緩衝液(pH6.0)代替含有20mM氯化鈣和50mM氯化鈉的20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)，並且用20mM檸檬酸鹽緩衝液(pH6.0)代替50mM至最多300mM的氯化鈉的線性梯度濃度和含有20mM氯化鈣的20mM氯化胺緩衝液(pH9.0)。流速也改變為在吸附時是15.6至54.6cm/小時並且洗脫時為39cm/小時。
圖3表示由陽離子交換色譜洗脫出的級分的凝集過濾色譜得到的洗脫模式。實施例3胎盤源膜聯蛋白VI的純化將除羊膜和臍帶以外的一個胎盤(約500g)切為小片，用2L生理鹽水衝洗，並且用碎肉機切碎。加入400mL的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)之後，其中含有5mM氯化鈣、0.1％Triton X-100和5mM苯甲脒，切碎物用旋轉混合器勻漿。該勻漿在10,000rpm下離心20分鐘收集沉澱，將其重新懸浮在300mL的含有50mMEDTA的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)並且勻漿。再次在10,000rpm下將該勻漿離心20分鐘並且回收上清液的提取物(約300mL)，向其中加入63g硫酸銨製成硫酸銨的30％飽和溶液。離心除去沉澱之後，向上清液中加入54g的硫酸銨(60％飽和硫酸銨)並且回收沉澱的膜聯蛋白VI級分。當鹽濃度提高至80％的硫酸銨的飽和度時，在所形成的沉澱中膜聯蛋白V可以優先被回收。
將用硫酸銨的60％飽和溶液形成的沉澱溶於50mM Tris-HCL緩衝液(pH7.4)並相對於相同緩衝液透析。使透析溶液(80mL)吸附在用相同緩衝液平衡的DEAE-Toyopearl(3×20cm)。用相同緩衝液洗滌之後，通過相同緩衝液(180mL)至含有0.3M NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)(180mL)的線性梯度(各級分4mL/管)進行洗脫。感興趣的膜聯蛋白VI洗脫在級分46-50中。這些膜聯蛋白VI級分相對於20mM氯化銨(pH9.0)透析，向其中加入氯化鈣製成最終含有20mM氯化鈣的20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)。透析溶液吸附至用20mM氯化銨緩衝液(pH9.0)平衡的SP-瓊脂糖FF(1.5×8cm)，該緩衝液含有20mM氯化鈣(圖4；級分1-15)。用相同緩衝液洗滌後，用補充有0.5M NaCl的相同緩衝液進行洗脫(圖4；級分45-70)。通過非還原性SDS-PAGE分析各階段的樣本並且結果如圖5所示。實施例4凝集因子X的純化市售凝集因子X(約1mg)相對於20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)透析，向其中加入十分之一量的200mM氯化鈣最終製成含有20mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)。該透析溶液吸附在用20mMTris-HCl緩衝液(pH8.0)平衡的SP-瓊脂糖FF(0.8×7cm)，該緩衝液含有20mM氯化鈣。用含20mM氯化鈣的20mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)洗滌之後，用含有0.3M氯化鈣的20mM Tris-HCl緩衝液(pH9.0)進行洗脫。在所有階段中，加入5mM苯甲脒(因為苯甲脒本身在A280具有UV吸收，洗脫模式不詳述；圖6)。通過非還原性SDS-PAGE分析各階段的級分，結果如圖7所示。
權利要求
1.一種利用陽離子交換載體從含有該蛋白的樣本中提取鈣離子結合蛋白的方法，其中所述的方法包含令該樣本與陽離子交換載體在鈣離子的存在下接觸，使該蛋白吸附在該交換載體上；並且通過降低或消除鈣離子的濃度和/或加入除鈣離子之外的抗衡離子從交換載體上洗脫下被吸附的鈣離子結合蛋白。
2.權利要求1的方法，其中該吸附步驟在5-100mM鈣離子的存在下進行。
3.權利要求2的方法，其中該吸附步驟在10-30mM鈣離子的存在下進行。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中該吸附步驟是在1-150cm/小時的流速下進行。
5.權利要求4的方法，其中該吸附步驟是在15-100cm/小時的流速下進行。
6.權利要求4的方法，其中該吸附步驟是在50-80cm/小時的流速下進行。
7.權利要求1的方法，其中該洗脫步驟是通過使鈣離子的濃度降低至小於5mM進行。
8.權利要求1的方法，其中該洗脫步驟是通過加入1-500mM的除鈣離子之外的抗衡離子進行。
9.權利要求1的方法，其中該洗脫步驟是通過加入50-500mM的除鈣離子之外的抗衡離子進行。
10.權利要求1的方法，其中該洗脫步驟是通過加入50-300mM的除鈣離子之外的抗衡離子進行。
11.權利要求1、8、9或10的方法，其中該抗衡離子選自Na+、Li+和K+。
12.權利要求1、7、8、9、10或11的方法，其中該洗脫步驟是以1-150cm/小時的流速進行。
13.權利要求12的方法，其中該洗脫步驟是以30-100cm/小時的流速進行。
14.權利要求12的方法，其中該洗脫步驟是以30-80cm/小時的流速進行。
15.權利要求1的方法，其中該陽離子交換載體選自SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖、GM-纖維素、SE-纖維素、S-Spherodex和SP-Spherosil。
16.權利要求1-15任一項的方法，其中該鈣離子結合蛋白選自膜聯蛋白I、II、III、IV、V、VI和VII。
17.權利要求1-16任一項的方法，其中樣本含有通過基因重組技術製備的鈣離子結合蛋白。
18.權利要求1-17任一項的方法，其中該吸附和洗脫步驟在pH5-10下進行。
19.權利要求18的方法，其中該吸附和洗脫步驟是在pH8-9.5下進行。
20.權利要求19的方法，其中該吸附和洗脫步驟是在pH 9下進行。
21.權利要求1的方法，其中該吸附步驟是在10-30mM鈣離子的存在下在pH8-9.5下以15-100cm/小時的流速進行；洗脫步驟是在30-80cm/小時的流速下通過使鈣離子的濃度降低至小於5mM或通過加入50-300mM的選自Na+、Li+和K+的抗衡離子進行；該陽離子交換載體是SP-瓊脂糖；鈣離子結合蛋白是膜聯蛋白V；該樣本含有通過基因重組技術製備的膜聯蛋白V；和除去樣本中的蛋白酶。
22.權利要求1的方法，其中該吸附步驟是在10-30mM鈣離子的存在下在pH8-9.5下以15-100cm/小時的流速進行；洗脫步驟是在30-80cm/小時的流速下通過使鈣離子的濃度降低至小於5mM或通過加入500mM的選自Na+、Li+和K+的抗衡離子進行；該陽離子交換載體是SP-瓊脂糖；鈣離子結合蛋白是膜聯蛋白VI；該樣本含有天然膜聯蛋白VI；和除去樣本中的蛋白酶。
23.一種利用陽離子交換載體從含有所述蛋白的樣本中提純鈣離子結合蛋白的方法，其中該方法包含使該樣本與陽離子交換載體在鈣離子的存在下接觸，使該蛋白被吸附在該載體上。
24.權利要求23的方法，其中該方法是在5-100mM鈣離子的存在下進行。
25.權利要求24的方法，其中該方法是在10-30mM鈣離子的存在下進行。
26.權利要求23-25任一項的方法，其中該方法是以1-150cm/小時的流速進行。
27.權利要求26的方法，其中該方法是以15-100cm/小時的流速進行。
28.權利要求26的方法，其中該方法是以50-80cm/小時的流速進行。
29.權利要求23的方法，其中該陽離子交換載體選自SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖、CM-纖維素、SE-纖維素、S-Spherodex和SP-Spherosil。
30.權利要求23-29任一項的方法，其中該鈣離子結合蛋白選自膜聯蛋白I、II、III、IV、V、VI和VII。
31.權利要求23-30任一項的方法，其中樣本含有通過基因重組技術製備的鈣離子結合蛋白。
32.權利要求23-31任一項的方法，其中該方法在pH5-10下進行。
33.權利要求32的方法，其中該方法是在pH8-9.5下進行。
34.權利要求33的方法，其中該方法是在pH9下進行。
35.一種通過權利要求1-34任一項的方法獲得的高純度的鈣離子結合蛋白，其通過凝膠過濾色譜分析測定呈單峰。
全文摘要
本發明涉及一種通過陽離子交換方法提純鈣離子結合蛋白的方法，利用該方法方便和有效地從含有鈣離子結合蛋白和汙染物的液體中分離和提純出鈣離子結合蛋白而無需任何預處理，例如加入螯合劑。更加具體地，該方法包含，在鈣離子結合蛋白的提純過程中，使該蛋白在鈣離子的存在下被陽離子載體吸附，衝洗並洗脫。通過這種方法得到的鈣離子結合蛋白基本上不含有任何雜質。
文檔編號C07K14/47GK1392878SQ01802811
公開日2003年1月22日 申請日期2001年7月18日 優先權日2000年7月21日
發明者溝上寬, 古川真一, 菅原敬信, 恩智達文, 小松一浩, 小柳智, 吉崎榮男 申請人:財團法人化學及血清療法研究所, 興和株式會社