一種中藥組合物在製備破壞細菌生物膜的藥物中的應用的製作方法
2023-07-27 22:01:31
一種中藥組合物在製備破壞細菌生物膜的藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種中藥組合物在製備破壞細菌生物膜的藥物中的應用，屬於中藥領域，由連翹、金銀花、板藍根、大黃、廣藿香等藥味組成，本發明藥物可以破壞細菌生物被膜，殺滅細菌。
【專利說明】一種中藥組合物在製備破壞細菌生物膜的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於中藥領域，具體涉及一種中藥組合物的應用。
【背景技術】
[0002]細菌生物膜是指細菌在不利於其生長的環境下，通過自身產生的胞外多糖被膜多聚物相互粘連形成的細菌群落。目前認為99%的細菌以生物膜的形式存在。人類感染疾病，80%涉及細菌生物膜。
[0003]細菌生物被膜(B1film，BF)中水分含量可高達97%，除了水和細菌外，BF還含有大分子多聚物，如蛋白質、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等，同時還含有吸附的營養物質和代謝產物。BF具有極強的耐藥性及免疫逃避性，針對BF形成的藥物滲透屏障，採取了聯合用藥，用一種藥物破壞BF，用另一種藥物進入BF殺菌，由於BF的頑固性，用藥量難以控制，用量低，難以去除BF，會產生耐藥性，用藥量高，又會涉及藥物的毒性問題。因此，目前還沒有有效的藥物破壞細菌生物膜。
【發明內容】
[0004]本發明目的是提供一種中藥組合物在製備破壞細菌生物膜的藥物中的應用，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成:
連翹210-280 金銀花210-280 板藍根210-280大黃45-55 廣藿香75-100綿馬貫眾210-280紅景天75-100 薄荷腦5.5-8.5 麻黃75-100 苦杏仁75-100 魚腥草210-280 甘草75-100 石膏 210-280。
[0005]作為優選方式，所述中藥組合物由下列重量份的原料藥製成:
連翹210 金銀花280板藍根210大黃45廣藿香100 綿馬貫眾280紅景天75薄荷腦5.5麻黃75 苦杏仁100 魚腥草210 甘草100石膏280。
[0006]或
連翹280 金銀花210板藍根280大黃55廣藿香75 綿馬貫眾210紅景天100薄荷腦8.5麻黃100 苦杏仁75 魚腥草280 甘草 75石膏 210。
[0007]或
連翹258 金銀花258板藍根258大黃50廣藿香88 綿馬貫眾258紅景天88薄荷腦8 麻黃85苦杏仁85 魚渥草255 甘草 85石骨 255。
[0008]本發明還提供了所述中藥組合物的活性成分由以下步驟製成:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，淨選；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，乾燥，得幹膏粉，備用；
步驟(5)所得幹膏粉、步驟(2)所得揮髮油與薄荷腦共同構成該中藥組合物的活性成分。
[0009]本發明藥物的劑型為膠囊劑、片劑、散劑、口服液、丸劑、酊劑、糖漿劑、栓劑、凝膠齊U、噴霧劑或注射劑。
[0010]為使上述劑型能夠實現，需在製備這些劑型時加入藥學可接受的輔料，例如:填充齊?、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括:澱粉、預膠化澱粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括:澱粉、預膠化澱粉、微晶纖維素、羧甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括:硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化矽等；助懸劑包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，澱粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括:糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括:甜味劑及各種香精；防腐劑包括:尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質包括:PEG6000，PEG4000，蟲蠟等(範碧亭《中藥藥劑學》，上海科學出版社.1997年12月第I版.各劑型記載的輔料)。
[0011]其中膠囊劑的製備方法，是由以下步驟製成:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，淨選；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，乾燥，得幹膏粉，備用；
(6)將步驟(5)所得幹膏粉加入適當藥學上可接受的輔料制粒；
(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮髮油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝入膠囊，即得。
[0012]其中顆粒劑的製備方法，是由以下步驟製成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，淨選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，乾燥，得幹膏粉，備用；
(6)將步驟(5)所得幹膏粉加入適當藥學上可接受的輔料制粒；
(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮髮油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
[0013]所述細菌為耐甲氧西林耐藥菌。
[0014]所述耐甲氧西林耐藥菌為大腸桿菌、肺炎克雷伯菌。
[0015]本發明藥物的其他劑型按比例稱取原料藥後，採用常規的製備方法製備，例如，範碧亭《中藥藥劑學》(上海科學出版社1997年12月第I版)記載的製備工藝，製成藥劑學可接受的常規劑型。
[0016]本發明的各藥味的範圍是經過優化篩選的，超出權利要求1中連翹210-280 金銀花210-280 板藍根210-280大黃45-55廣藿香75-100綿馬貫眾210-280紅景天75-100 薄荷腦5.5-8.5麻黃75-100 苦杏仁75-100 魚腥草210-280 甘草75-100石膏210-280的範圍，藥物的作用效果不明顯。
[0017]為證實本發明藥物組合物破壞細菌生物膜的作用效果，用實施例製得的膠囊劑，進行了如下實驗:
I材料和方法 1.1材料
1.1.1菌株
大腸桿菌(Escherichia coli, ATCC 25922)，肺炎克雷伯菌。
[0018]藥品製備及分組
注射用青黴素鈉，80萬單位，華北製藥生產，批號X1108105。甲氧西林鈉鹽(methicillin sodium salt),購自 Sigma 公司，批號 1371696V。
[0019]本發明藥物膠囊內容物，由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供，批號111006，每克含生藥9.78g，進行離體實驗時，配置成內容物粉末，按以下方法將其分為三部分:
(I)乙酸乙酯提取物(YSYZ):反覆用乙酸乙酯適量溶解10g內容物粉末，離心4分鐘，轉速1000轉/分，取上清，至所收集的乙酸乙酯上清肉眼觀為無色透明。水浴80°C (稍高於乙酸乙酯的沸點)加熱至蒸乾，並用乙醇溶解備用。(2)殘渣水提物(CZ):100g內容物粉末乙酸乙酯提取後剩餘的藥殘渣用純水定溶於500ml容量瓶中水浴80°C加熱2小時，充分溶解反覆離心藥液，除去藥渣1000轉/分離心4分鐘。將澄清藥液蒸乾以同體積培養基溶解備用。(3)總水提液(ZS):將10g內容物粉末用純水定溶於500ml容量瓶中水浴80°C加熱，反覆離心(1000轉/min，4min)取上清藥液，將藥液蒸乾，以同體積含葡萄糖0.25%培養基溶解備用。
[0020]藥物濃度及分組:(I)抗生素組共10個濃度，為青黴素或甲氧西林，濃度範圍20?0.04 μ g/ml。(2) YSYZ 組共 10 個濃度，濃度範圍為 6370 μ g/ml ?12.4 yg/mL.(3)CZ組共10個濃度，濃度範圍為12275(Γ239.75 μ g/ml。(4) ZS組共10個濃度，濃度範圍為 173000?237.89 μ g/ml。
[0021]主要試劑與儀器
胰蛋白腖、酵母提取物(英國OXOID公司)，TSB、TSA培養基(美國BD公司)，氯化鈉(國藥集團)，結晶紫(美國AMRESC0公司)，微生物活性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)，Matrix染色劑、LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability 試劑盒(美國 Molecular Probes 公司)，戊二醛(上海化學試劑公司)，自動洗板機(美國伯騰儀器有限公司)，恆溫恆溼培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋)、超淨臺、恆溫搖床、恆溫水浴鍋，分光光度計、酶標儀(美國伯樂公司)，雷射共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。
[0022]方法
1.2.1細菌常規培養大腸桿菌:LB培養基，37°C常規培養。
[0023]肺炎克雷伯菌:LB培養基，37°C常規培養。
[0024]微孔板法檢測本發明藥物對細菌生物膜形成的影響
將YSYZ、CZ、ZS和青黴素(或甲氧西林)分別用含0.25%葡萄糖的培養液於96孔平底培養板進行倍比稀釋，每孔加入搖床過夜培養的菌液(37°C，280轉/分)，稀釋菌液使其孔中濃度達到0D600=0.05，陰性對照以同體積含糖培養液代替藥物。每個濃度作3個復孔，將板子置於37°C培養24小時。染色前用洗板機以0.9%生理鹽水將培養的96孔板清洗2次，洗去孔中未粘附的細菌。以結晶紫(CV)和細菌生物活性染色試劑盒(WST)分別染色後用酶標儀分別對每孔BF的生物總量和活菌量進行測定。
[0025]微孔板法檢測本發明藥物對成熟細菌生物膜的作用
細菌於搖床過夜培養(37°C，280轉/分)，將用含0.25%葡萄糖的培養液稀釋好的菌液加入96孔板，使孔中濃度達到0D600=0.05，以37°C在恆溫箱中培養成熟細菌生物膜，24h後，棄去上清，將稀釋好的藥物加入孔中繼續培養於37°C培養24h，以CV染色和WST檢測方法用酶標儀分別對每孔的生物總量和活菌量進行測定。
[0026]抑菌率的半抑制率的計算
半抑制率(IC50)為IC50為50%抑制濃度時所對應的濃度，實驗應用1git法將數據進行處理，算出藥物IC50值。
[0027]雷射共聚焦觀察藥物對生物膜的影響
藥物對S.a細菌生物膜形成的影響:細菌於搖床培養過夜(37°C，280轉/分)，同時在小皿中加入Iml藥液和Iml稀釋的菌液，使菌液濃度達0D600=0.05，所加入的青黴素/甲氧西林小皿中終濃度為20μ g/ml，ZS為173000 μ g/ml。將小皿置於37°C培養24小時後棄去上清，用0.9%生理鹽水小心清洗兩次，去掉未粘附細菌，加入200 μ I matrix染料，同時以1.5 μ Ι/ml濃度分別加入PI和Syto9染色，將標本染色30min，在雷射共聚焦上觀察，P1、Syto9、matrix 所需的激發波長分別為 488nm、559nm、559nm。
[0028]藥物對成熟S.a細菌生物膜的影響:細菌於搖床培養過夜(37°C，280轉/min)，在小皿中加入Iml藥液和Iml稀釋的菌液，使菌液濃度達0D600=0.05，所加入的青黴素/甲氧西林小皿中終濃度為20μ g/ml，ZS為173000 μ g/ml。將小皿置於37°C培養24小時後棄去上清，後加入藥物再於37°C培養24小時。染色前，用0.9%生理鹽水小心清洗兩次，加入三種染色劑染色30分鐘後，於雷射共聚焦上觀察。
[0029]掃描電鏡觀察藥物對生物膜的影響
將大小5mmX 5mm的載玻片放入24孔板，每孔一個，孔中菌液0D600值為0.05，將玻片於37°C培養24小時後，棄去培養液，取各藥物組最大濃度藥物加入其中，繼續於37°C培養24小時。取出載玻片，將樣本進行處理:(I)固定，前固定為使用4%戊二醛固定2小時，後固定為1%鋨酸固定液固定2小時，固定後，以PBS緩衝液漂洗2次，5分鐘/次，(2)梯度脫水，將樣本依次放入50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮、100%丙酮各15分鐘，進行梯度脫水，(3)用100%叔丁醇浸透樣本，放入-20°C冰箱30分鐘。(4)取出樣品真空冷凍乾燥儀乾燥4小時。(5)將乾燥好的樣品粘於樣品臺，將其噴金鍍膜，後於掃描電鏡下觀察。
[0030]透射電鏡觀察藥物對生物膜的影響
將細菌增菌菌液用培養液稀釋，使其0D600值為0.05，加入離心管中以37°C培養24小時後，棄去管中一半上清，分別加入藥物，取各藥物組最大濃度，繼續培養24小時。將樣本離心，8000轉/分，10分鐘。樣品按下列步驟處理:(I)前固定4%戊二醛固定彡2小時。固定完畢，用PBS緩衝液漂洗3次，5分鐘/次(2)後固定1%鋨酸固定液固定I?2小時。固定完畢，用PBS緩衝液漂洗3次，5分鐘/次。(3)梯度脫水:依次經50%丙酮脫水15分鐘，70%丙酮15分鐘，90%丙酮15分鐘，100%丙酮I O分鐘脫水兩次。(4)梯度浸透:依次經丙酮2:1包埋劑2小時，丙酮1:1包埋劑2小時，純包埋劑2小時。(5)包埋操作:將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中孔頂，然後置烤箱烘乾，依次在烤箱37°C加溫12小時，450C 12小時，60°C 24小時，形成包埋塊。(6)將樣本切成超薄切片(5 μ m)後在透射電鏡下觀察。
[0031]結果
2.1本發明藥物對大腸桿菌生物膜的影響
(I)微孔板法檢測本發明藥物對大腸桿菌生物膜的影響
為觀察本發明藥物對大腸桿菌生物膜生物總量和活菌數的影響，行CV和WST染色後測量，結果分別見圖1和圖2。
[0032]圖1中，與對照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響。
與對照組相比，CZ (122750^15343.75 μ g/ml),ZS (86500、21625 μ g/ml)，能夠減少大腸桿菌生物膜形成過程中的生物總量以及活菌數。從半抑制率(IC50)看，CZ組抑制效果最佳，其對生物總量IC50為58188 μ g/ml，對活菌數IC50為56528 μ g/ml。
[0033]乙醇溶劑對照組中一些濃度對BF中活菌數的抑制具統計學意義，但從IC50看，抑制作用不明顯。
[0034]本發明三藥物組中，CZ組效果相對最好，能抑制大腸桿菌BF形成階段的生物總量(CV)0
[0035]圖2中，與對照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響。
[0036]可以看到，與對照組相比，YSYZ、CZ、ZS對成熟大腸桿菌生物膜生物總量及和活菌數無明顯抑制作用。青黴素(2.5、0.041 μ g/ml)對生物膜內活菌數有影響。本發明藥物三個藥物組對成熟大腸桿菌BF抑制效果均不明顯。
[0037](2)雷射共聚焦觀察本發明藥物對大腸桿菌生物膜的影響
為研究本發明藥物對大腸桿菌細菌生物膜厚度和成分，即活菌、死菌、胞外基質的作用情況，對生物膜進行活(syto-9)、死菌(PI)及細菌外基質(matrix)螢光染色後，雷射共聚焦下觀察生物膜形態及螢光強度，結果分別如圖3、圖4所示。
[0038]圖3示，與對照組相比抗生素組(青黴素，20 μ g/ml)活菌螢光強度和胞外基質螢光強度上升，ZS組，(173000 μ g/ml)胞外基質強度上升而活菌螢光強度、死菌螢光強度下降。
[0039]圖4示，與對照組相比，可以看出抗生素組(青黴素，20 μ g/ml)成熟BF中活菌、死菌、胞外基質染色螢光強度均有不同程度的增強；ZS組(173000 μ g/ml)胞外基質大幅上升，而活菌、死螢光強度大幅下降。
[0040]本發明藥物對肺炎克雷伯的影響
(I)微孔板法檢測本發明藥物對肺炎克雷伯菌生物膜的影響
為觀察本發明藥物對肺炎克雷伯菌生物膜生物總量和活菌數的影響，行CV和WST染色法測量，結果分別見圖5、圖6。
[0041]圖5中，與對照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響。
[0042]與對照組相比，YSYZ(6370?3185μ g/ml)、CZ (122750^479.49 μ g/ml)、ZS(86500^675.78 μ g/ml)，能夠減少肺炎克雷伯菌生物膜形成過程中的活菌數，而各藥物組對生物總量無明顯抑制。從半抑菌率看，本發明藥物三種提取物對細菌生物膜活菌(WST)都有一定的抑制，其中CZ組對活菌數的IC50為3160μ g/ml，效果最佳。Fig 15中，乙醇溶劑一些濃度對照組對生物抑制作用也具統計學意義。
[0043]本發明藥物三個藥物組均對肺炎克雷伯BF中活菌數有抑制作用。其中YSYZ組和CZ組效果較好。
[0044]圖6中，與對照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響。
[0045]乙醇溶劑對照組對BF影響無統計學意義。與對照組相比，青黴素(1.25、
0.623 μ g/ml)對肺炎克雷伯菌生物膜生物總量有抑制作用。
[0046]YSYZ (6370^1592.5 μ g/ml),CZ (122750 μ g/ml),ZS (173000-86500 μ g/ml) CZ、ZS能夠減少活菌數。從半抑制率(IC50)看，CZ組效果相對差，而ZS較好，為208353 μ g/ml ο
[0047]本發明藥物三個藥物組中，從抑菌率看，YSYZ組因其乙醇溶劑對照組的陽性結果影響，對成熟BF抑制作用不突出，而ZS組抗生物膜作用相對較好，能抑制肺炎克雷伯BF活菌數(IC50 為 208353 μ g/ml)。
[0048](2)雷射共聚焦觀察本發明藥物對肺炎克雷伯菌生物膜的影響為研究本發明藥物對肺炎克雷伯菌生物膜厚度和成分，即活菌、死菌、胞外基質的作用情況，對生物膜進行活(syto-9)、死菌(PI)及細菌外基質(matrix)螢光染色後，雷射共聚焦下觀察生物膜形態及螢光強度，結果分別如圖7、圖8所示。
[0049]圖7中，與對照組相比，可以看出抗生素組(青黴素，20μ g/ml)BF活菌、死菌、胞外基質染色中均有下降。本發明藥物組(ZS,173000 μ g/ml )BF中活菌、死菌、胞外基質染色螢光強度大幅度下降。
[0050]圖8中，與對照組相比可以看出抗生素組(青黴素，20 μ g/ml)活菌、死菌、胞外基質螢光強度均有下降。本發明藥物組(ZS，173000 μ g/ml)活菌螢光強度大幅下降，死菌和胞外基質無明顯變化。
[0051]結論
本發明藥物主要表現在其對於生物膜厚度及細菌數量的抑制，可以抑制膜中活菌量和死菌量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052]圖1是各給藥組對大腸桿菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響；
圖2是各給藥組對成熟大腸桿菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響；
圖3是雷射共聚焦觀察藥物對大腸桿菌生物膜的影響；
圖4是雷射共聚焦觀察藥物對成熟大腸桿菌生物膜的影響；
圖5是各給藥組對肺炎克雷伯菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響；
圖6是各給藥組對成熟肺炎克雷伯菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對BF內活菌數的影響；
圖7是雷射共聚焦觀察藥物對肺炎克雷伯菌生物膜的影響；
圖8是雷射共聚焦觀察藥物對成熟肺炎克雷伯菌生物膜的影響。
【具體實施方式】
[0053]實施例1:
原料藥配方為:
連翹258g 金銀花258 g板藍根258 g大黃50 g廣藿香88 g 綿馬貫眾258 g紅景天88 g薄荷腦8 g麻黃85 g苦杏仁85 g 魚腥草255 g 甘草 85 g石膏 255g。
[0054]製備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，淨選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加6倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘渣棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時，第二次1.5小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次1.5小時，第二次I小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.10的清膏，加乙醇，調節至醇濃度為70%，冷藏放置24小時，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.15的清膏，噴霧乾燥，得幹膏粉，備用；
(5)將步驟(4)所得幹膏粉加入澱粉138克，用85%乙醇制粒；
(6)將薄荷腦、步驟(2)所得揮髮油加入乙醇溶解，噴入步驟(5)所得顆粒，密閉，混勻，裝入1000粒膠囊，即得。
[0055]實施例2:
原料藥配方為:
連翹210 g 金銀花280 g板藍根210 g大黃45 g廣藿香100 g 綿馬貫眾280 g紅景天75 g薄荷腦5.5 g麻黃75 g 苦杏仁100 g 魚腥草210 g甘草100 g石膏280g。
[0056]製備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，淨選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加5倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘渣棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6倍量50%的乙醇提取2次，第一次3小時，第二次I小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次0.5小時，第二次2.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.15的清膏，加乙醇，調節至醇濃度為70%，冷藏放置24小時，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.20的清膏，噴霧乾燥，得幹膏粉，備用；
(5)將步驟(4)所得幹膏粉加入澱粉134克，用85%乙醇制粒；
(6)將薄荷腦、步驟(2)所得揮髮油加入乙醇溶解，噴入步驟(5)所得顆粒，按常規製劑方法製成片劑即得。
[0057]實施例3:
原料藥配方為:
連翹280 g 金銀花210 g板藍根280 g大黃55 g廣藿香75 g 綿馬貫眾210 g紅景天100 g薄荷腦8.5 g麻黃100 g苦杏仁75 g 魚腥草280 g甘草 75 g石膏 210g。
[0058]製備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，淨選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加8倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘渣棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用10倍量90%的乙醇提取2次，第一次I小時，第二次3小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次2.5小時，第二次0.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.12的清膏，加乙醇，調節至醇濃度為70%，冷藏放置24小時，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.13的清膏，噴霧乾燥，得幹膏粉，備用；
(5)將薄荷腦、步驟(2)所得揮髮油加入乙醇溶解，噴入步驟(4)所得幹膏粉，按常規製劑方法製成丸劑即得。
[0059]實施例4:
原料藥配方為:
連翹280g 金銀花210g板藍根280g大黃55g廣藿香75g 綿馬貫眾210g紅景天10g薄荷腦8.5g麻黃10g 苦杏仁75g 魚腥草280g 甘草 75g石膏 210g。
[0060]製備方法:
(一)提取工藝:
(1)按照上述處方量稱取中藥材，淨選，酌情碎斷；
(2)廣藿香加6倍量水提取揮髮油，提油時間4h，收集揮髮油，出油率為0.33 ±0.05%,提取液過濾後備用，殘渣棄去；
(3)連翹、炙麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時，第二次
1.5小時，提取液過濾，濾液合併，回收乙醇至無醇味,備用；
(4)金銀花、苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，第一次1.5小時，第二次I小時，提取液過濾，濾液合併同時加入步驟(2)廣藿香提油後的水溶液，濃縮成60°C測定相對密度為1.10清膏，加95%乙醇，邊加邊攪拌，至醇濃度70%，冷藏放置24小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，與醇提液合併，濃縮至濃縮成60°C測定相對密度為1.20稠膏，備用；
(二)製劑工藝:
(5)製劑配方為:步驟(4)所得稠膏335.5g 薄荷腦5g
步驟(2)所得廣藿香油0.2ml 糖粉342.5g 糊精514.0g
(6)制粒:將糖粉和糊精混合均勻，用稠膏作粘合劑制軟材，14目篩網制粒，60—65°C烘乾，10目篩網整粒；
(7)分裝:篩出細粉適量，將薄荷腦、廣藿香揮髮油加入適量乙醇，溶解，噴入細粉中，混合均勻，並與顆粒混合均勻，密閉半小時，裝袋，即得，以上處方可製成顆粒1000g。
【權利要求】
1.一種中藥組合物在製備破壞細菌生物膜的藥物中的應用，其特徵在於所述中藥組合物由下列重量份的原料藥製成: 連翹210-280 金銀花210-280 板藍根210-280大黃45-55 廣藿香75-100綿馬貫眾210-280紅景天75-100 薄荷腦5.5-8.5 麻黃75-100 苦杏仁75-100 魚腥草210-280 甘草75-100 石膏 210-280。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物由下列重量份的原料藥製成: 連翹210 金銀花280板藍根210大黃45廣藿香100 綿馬貫眾280紅景天75薄荷腦5.5麻黃75 苦杏仁100 魚腥草210 甘草100石膏280。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物由下列重量份的原料藥製成: 連翹280 金銀花210板藍根280大黃55廣藿香75 綿馬貫眾210紅景天100薄荷腦8.5麻黃100 苦杏仁75 魚腥草280 甘草 75石膏 210。
4.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物由下列重量份的原料藥製成: 連翹258 金銀花258板藍根258大黃50廣藿香88 綿馬貫眾258紅景天88薄荷腦8 麻黃85苦杏仁85 魚渥草255 甘草 85石骨 255。
5.根據權利要求1-4任一項所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物的活性成分由以下步驟製成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，淨選； (2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘洛棄去，濾液備用； (3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用； (5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，乾燥，得幹膏粉，備用； 步驟(5)所得幹膏粉、步驟(2)所得揮髮油與薄荷腦共同構成該中藥組合物的活性成分。
6.根據權利要求1-4任一項所述的應用，其特徵在於所述的藥物劑型為膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、口服液、丸劑、酊劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、噴霧劑或注射劑。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述膠囊劑是由以下步驟製成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，淨選； (2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘洛棄去，濾液備用； (3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用； (5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，乾燥，得幹膏粉，備用； (6)將步驟(5)所得幹膏粉加入適當藥學上可接受的輔料制粒； (7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮髮油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝入膠囊，即得。
8.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於顆粒劑的製備方法是由以下步驟製成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，淨選，酌情碎斷； (2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮髮油，提油時間4小時，收集揮髮油，備用；提取液過濾後，殘洛棄去，濾液備用； (3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時，提取液合併過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時，提取液合併過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油後的濾液合併，濃縮成在60°C時測定相對密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用； (5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合併，濃縮至在60°C時測定相對密度為1.15-1.20的清膏，乾燥，得幹膏粉，備用； (6)將步驟(5)所得幹膏粉加入適當藥學上可接受的輔料制粒； (7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮髮油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
9.根據權利要求1-4任一項所述的應用，其特徵在於所述細菌為耐甲氧西林耐藥菌。
10.根據權利要求1-4任一項所述的應用，其特徵在於所述耐甲氧西林耐藥菌為大腸杆囷、肺炎克雷伯囷。
【文檔編號】A61K33/06GK104367688SQ201310347948
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】王宏濤, 劉敏彥, 唐思文, 徐登峰 申請人:河北以嶺醫藥研究院有限公司