通過測定PPARδ激活作用篩選物質的方法和藥劑的製作方法

2023-07-27 16:42:01 1

專利名稱：通過測定PPARδ激活作用篩選物質的方法和藥劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過測定激活過氧化物酶體增殖物激活受體δ(peroxisome proliferator activated receptorδ，PPARδ)的作用來篩選具有產熱促進作用的物質的方法，以及含有具有產熱促進作用的化合物的藥劑，該藥劑具有PPARδ激活作用。另外，本發明涉及一種能專一性地增強線粒體功能中的解偶聯蛋白(UCP)導致的解偶聯呼吸或在線粒體內膜中質子洩漏(以下一般稱之為質子洩漏)的藥劑，線粒體是使用脂肪酸和丙酮酸作為底物的能量代謝(呼吸)細胞內的細胞器。另外，本發明涉及抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、以及減少內臟積累脂肪的藥劑或抑制內臟積累脂肪的藥劑。
背景技術：
體內的能量代謝調節系統，包括食物攝取調節系統和能量消耗調節系統。能量消耗調節系統參與兩種類型的能量消耗，即用於基礎代謝以便維持生命的能量消耗，和其他能量消耗。在後一種情況下的主要能量消耗是非戰慄產熱(nonshivering thermogenesis，nST)，它是產熱的，並且，它的功能意義是在出生之後即刻、在接觸寒冷期間以及在冬眠結束時保持體溫等，以及通過消耗由於吃得過多而產生的多餘能量，從而抑制肥胖和糖脂代謝疾病等。特別是在恆溫的哺乳動物和鳥類中，尤其是小型動物中，nST對於保持體溫來說是重要的。在誘導nST的機制中，線粒體中的質子洩漏，即細胞呼吸鏈的電子轉運系統和ATP合成的參與是重要的。
在褐色脂肪組織(BAT)中，在線粒體膜中存在一種被稱為解偶聯蛋白(UCP1)的特殊蛋白，其分子量為32kD，並且包括大約300個胺基酸。該蛋白具有使ATP合成與褐色脂肪細胞(BA)的呼吸鏈的電子轉運系統解偶聯的作用。UCP1包括一種結構域的三次重複的結構，該結構域包括大約100個胺基酸，並且每一個結構域具有兩個跨膜部位，一共6個部位。所述跨膜區構成了線粒體膜上的通道。
UCP1是轉運質子的載體。由UCP1和其他成分構成的質子通道具有按照電化學梯度使質子自由穿透，以釋放熱量的功能。這就是nST。就是說，nST通過經質子通道的質子滲透導致所述解偶聯，並且，所述解偶聯減弱了ATP合成，激活了線粒體內的呼吸，從而保持ATP與ADP的比例恆定。結果，大量脂肪和糖被氧化以產生熱量。
UCP1的生理學作用是在出生之後即刻、在接觸寒冷期間等情況下保持體溫，並且，用轉基因小鼠進行的研究，業已證實了它參與肥胖的抑制。在各種肥胖模型中，UCP1表達減弱這一事實，表明了UCP1與肥胖發生、發展和持續的相關性。例如，業已證實，在BAT減少的轉基因小鼠中，在沒有過量進食的情況下出現了肥胖(Lowell等，Nature，366，740-742(1993))。另外，在小鼠中觀察到了身體脂肪的減少，和對由於高脂肪食物所導致的飲食誘導的肥胖的抗性，其中通過將UCP1基因插入脂肪專一性基因aP2的啟動子，強制所述小鼠表達大量的UCP1(Kopecky等，J.Clin Invest，96，2914-2923(1995))。另外，在UCP1表達被抑制到1/3的小鼠體內，觀察到了在暴露於寒冷的環境時體溫保持功能的減弱、由於身體脂肪的增加而導致的肥胖和胰島素抗性(Lowell B.B.等，Nature，366，740-742(1993))。另外，UCP1剔除小鼠是不耐寒的(Enerback S.等，Nature，387，90-94(1997))。如上文所述，通過動物實驗業已了解到UCP1作為產熱分子在體溫調節和能量消耗方面具有重要作用，並且與肥胖密切相關。
UCP1表達的數量，主要是由核內基因轉錄水平調控的，而UCP1基因表達隨cAMP濃度的提高而加強(齋藤等，最新醫學，52，1095-1096(1997))。
大約20-40％的細胞內能量消耗被認為是通過線粒體內膜上的質子洩漏而產生的。另外，在具有很少BAT的成年人和其他動物中，大部分nST被認為是在骨骼肌和白色脂肪組織(WAT)中產生的。基於上述事實，一直認為UCP存在於除了BAT以外的組織中。有兩個研究小組在1997年連續報導了來自除了BAT以外的組織的UCP2的cDNA克隆(Fleury等，Nature Genet，15，269-272(1997)；Gimeno等，Diabetes46，900-906(1997))。
人UCP2表現出與人UCP1的59％的同源性，並且像UCP1那樣形成了具有6個跨膜區的通道，並且它具有嘌呤核苷酸結合位點。UCP2與UCP1的不同之處在於，它是在系統組織中廣泛表達的，在肺和胰腺中是以特別高的濃度表達的，並且在心臟、肝臟、大腦、腎臟、睪丸、WAT、BAT和骨骼肌中也檢測到了表達。
至於UCP2功能，在食用高脂肪飲食的小鼠體內，觀察到在附睪周圍的脂肪組織中UCP2基因表達的上調。不過，據報導，UCP2剔除小鼠在寒冷條件下，在體溫保持功能方面是正常的(Arsenijevic D.等，Nature Genet，26，387-388(2000))。另外，在上述UCP1剔除小鼠中觀察到了褐色脂肪組織中UCP2的表達得到充分上調，這種現象被認為是代償作用，並且所述小鼠不耐寒(Enerback，F.等，Nature，387，90-94(1997))。另外，業已證實UCP2能通過改變胰腺β細胞中細胞內ATP濃度，抑制胰島素分泌(Zhang C.-Y.等，Cell，105，745-755(2001))。對於糖尿病治療來說，這是一種不利的特徵。如上文所述，對於UCP2來說，到目前為止，與能量消耗/肥胖的關係尚未搞清楚，儘管業已證實了其質子通道的解偶聯功能。
體內的多餘能量，最初主要是作為內臟脂肪積累的(特別是作為腸繫膜脂肪)。與其他部位的脂肪(特別是皮下脂肪)相比，內臟脂肪容易受到脂肪動員(adipokinetic)作用，快速地分解和消耗。內臟脂肪(肥胖)被認為是導致與生活方式相關的疾病(成年人疾病)的多重危險因素。其原因是從WAT中的白色脂肪細胞(WA)中分泌的脂肪酸通過門靜脈直接流入肝臟，促進了胰島素耐受性和脂肪合成，其結果是，誘導了糖耐受性異常、高血壓和高血脂，並且，這些疾病最終並發導致動脈硬化。因此，預計抑制內臟脂肪的積累和減少內臟脂肪的積累，能有效預防與生活方式相關的疾病(如成年人的糖尿病)的發生，並且治療所述疾病。
過氧化物酶體增殖物激活的受體(PPAR)在它的結構等方面被認為是核受體(核激素受體)超家族的一員。到目前為止，業已鑑定了三種類型的PPAR亞型，這三種亞型是PPARα，PPARδ(又稱為NUC-1、PPARβ或FAAR)和PPARγ，並且業已克隆了它們的基因(cDNA)(Lemberger等，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.，12，335-363(1996))。
據報導，貝特(fibrate)藥劑對三種類型PPAR中的PPARα具有配體作用，在臨床上表現出對血清甘油三酯含量的很強的降低作用(Forman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，4312-4317(1997))。
PPARγ主要是在脂肪組織中表達的，並且據報導，PPARγ是與調控脂肪細胞分化密切相關的因子(Tontonoz等，Genes andDevelopment，8，1224-1234(1994)；和Tontonoz等，Cell，79，1147-1156(1994))。各種類型的噻唑烷二酮衍生物，在非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的動物模型中表現出降血糖作用，並且預期可以作為NIDDM的新型治療劑，它具有胰島素抗性解除作用。最近的研究證實了噻唑烷二酮衍生物還具有作為PPARγ的配體的作用，並且能專一性地激活PPARγ(Lehman等，J.Biol.Chem.，270，12953-12956(1995))。
不過，尚未搞清楚PPARδ的生理學功能(Willson等，J.Med.Chem.，43(4)，527-550(2000))。WO97/28149披露了一種具有血液HDL提高作用的PPARδ配體，而WO99/04815披露了施用PPARδ受體激活物質能夠降低膽甾醇含量。不過，沒有說明或暗示PPARδ和產熱促進作用與PPARδ和解偶聯蛋白之間的相關性。
另外，已知諸如花生四烯酸、卡巴前列環素(carbaprostacyclin，cPGI)、L-165041(4-(3-(2-丙基-3-羥基-4-乙醯-苯氧基)丙氧基)-苯氧基乙酸)的不飽和脂肪酸，能增強UCP2的表達(The Journal ofBiological Chemistry，Vol.276，No.14，Issue of April 6，pp.10853-10860，2001)。不過，沒有有關UCP1和PPARδ之間的相關性的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種篩選具有產熱促進作用的物質的方法，以及含有所述物質作為有效成分的藥劑。本發明的進一步的目的是提供一種抗糖尿病藥劑，抗肥胖藥劑和用於減少內臟脂肪積累或抑制內臟脂肪積累的藥劑。
本發明的發明人關注的是由nST對體內能量消耗調節系統的刺激而產生的產熱促進作用。他們試圖促進線粒體的解偶聯呼吸，促進BAT線粒體中的質子洩漏(相對nST組織而言是比較小的)，促進WAT線粒體中的質子洩漏，並且促進UCP1(解偶聯蛋白的同系物)的功能，由此提高它們的效率。
本發明的發明人為了解決上述問題進行了深入的研究，發現卡巴前列環素(cPGI6，9α-亞甲基-11α，15S-二羥基-prosta-5E，13E-二烯-1-酸)和伊洛前列素(Iloprost，5-{(E)-(1S，5S，6R，7R)-7-羥基-6-[(E)-(3S，4RS)-3-羥基-4-甲基-5-辛-6-烯]-雙環[3.3.0]-3-亞辛基}戊酸)(它們是非專一性PPAR配體)，在骨骼肌細胞或脂肪細胞中具有UCP1表達促進作用。
這一新的發現與以下發現組合在一起貝特化合物和Wy14643(它們是PPARα的配體)，以及噻唑烷二酮化合物(它們是PPARγ的配體)，幾乎不表現UCP1表達促進作用。根據這一組合發現，本發明人推測PPARδ主要參與UCP1表達促進作用，並且他們還對具有PPARδ激活作用的化合物做了進一步的研究。
結果，通過使用人類或嚙齒類動物的骨骼肌細胞或脂肪細胞進行的實驗，他們發現具有PPARδ激活作用的物質表現出UCP1表達促進作用。
另外，基於UCP基因的表達是由PPARδ調控這一事實，本發明的發明人證實了可以通過測定PPARδ激活作用，篩選具有產熱促進作用的物質，它能增強UCP1基因的表達並且促進nST功能。
因此，本發明包括以下主題(1)篩選具有產熱促進作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
(2)篩選具有促進線粒體的解偶聯呼吸作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
(3)篩選具有促進線粒體內膜質子洩漏作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
(4)篩選能增加UCP1在含有線粒體的細胞中的表達量的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
(5)篩選能促進脂肪酸β氧化作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
(6)如上述(1)-(5)中任一項的篩選物質的方法，該方法利用了報導基因。
(7)如第(6)項中的篩選具有產熱促進作用的物質的方法，該方法包括下面①-③的步驟①讓具有PPARδ激活作用的物質與能表達UCP1基因的細胞接觸和/或導入所述細胞，②測定UCP1基因在所述細胞中的表達量，和③篩選能提高所述UCP1基因在所述細胞中的表達量的化合物。
(8)如第(7)項中的篩選方法，其中能表達UCP1基因的細胞是脂肪細胞或骨骼肌細胞。
(9)如第(7)項中的篩選方法，其中能表達UCP1基因的細胞是脂肪細胞。
(10)具有產熱促進作用的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
(11)促進線粒體的解偶聯呼吸的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
(12)促進線粒體內膜中的質子洩漏的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
(13)提高UCP1在含有線粒體的細胞中的表達量的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
(14)促進脂肪酸β氧化的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
(15)如上述(10)-(14)中任一項的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質是非專一性PPAR配體或PPARδ配體。
(16)如上述(10)-(14)中任一項的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質是卡巴前列環素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙醯基-3-羥基-2-丙基苯氧基)-丙氧基)苯乙酸。
(17)如(11)-(13)中任一項的藥劑，其中線粒體存在於骨骼肌、白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細胞中。
(18)如(11)-(13)中任一項的藥劑，其中線粒體存在於白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細胞中。
(19)抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內臟積累脂肪的藥劑或抑制內臟積累脂肪的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
(20)抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內臟積累脂肪的藥劑或抑制內臟積累脂肪的藥劑，其含有如(10)-(18)中任一項的藥劑作為有效成分。
附圖簡述

圖1表示通過PPARδ配體之外的各種類型的測試化合物在人類脂肪細胞中誘導的UCP1 mRNA表達量。
圖2表示通過PPARδ配體或各種類型的測試化合物在人類脂肪細胞中誘導的UCP2 mRNA表達量。
圖3表示通過PPARδ配體或各種類型的測試化合物在人類脂肪細胞中導致的游離脂肪酸β氧化作用的促進程度。
實施本發明的方式本發明的具有能專一性地增強nST組織的線粒體中質子洩漏等作用的藥劑，包括具有PPARδ激活作用的化合物或其衍生物作為有效成分。本發明的所述藥劑可以是上述有效成分本身或者是含有所述成分的合適的配合物、組合物或混合物。另外，具有PPARδ激活作用的化合物，表示能通過像「PPAR配體」那樣與PPAR結合，調控PPAR的靶基因的轉錄激活功能的化合物。所述化合物不局限於天然存在的化合物，而且還包括人工合成的化合物。
為了說明上述有效成分的作用，通過向實施例中所示的各種類型的骨骼肌細胞或脂肪細胞中添加各種類型的PPAR配體，測定UCP1的mRNA的數量。結果，證實了與測定的PPARα和PPARγ配體相比，PPARδ配體表現出UCP1的mRNA的明顯更大數量的表達。PPARδ配體的例子包括p-(3-(4-乙醯基-3-羥基-2-丙基苯氧基)-丙氧基)苯乙酸(YM-16638)，該配體作為具有例如降血液膽甾醇活性作用的化合物披露於WO9904815中。
可以使用報導基因，通過一種簡單方法，以很高的靈敏度確定一種物質的PPAR結合程度和/或激活程度。例如，以下方法是已知的使用融合蛋白表達載體的方法，該載體是通過將酵母轉錄因子GAL4的DNA結合結構域與PPAR的配體結合結構域融合而獲得的，以及使用一種動物細胞的方法，其中，業已轉導了含有與GAL4響應序列(GAL4結合元件)連接的報導基因的報導質粒(WO96/33724；Lehmann等，J.Biol.Chem.，270，12953-12956(1995)；和Willson等，J.Med.Chem.，39，665-668(1996))。使用報導基因的方法是按以下方式實施的首先，當測試化合物是諸如能結合或激活PPAR的物質時，該測試化合物與GAL4的PPAR的配體結合結構域結合。於是，與PPAR的配體結合結構域融合的GAL4的DNA結合結構域與報導質粒的GAL4響應因子結合，以便啟動所述報導基因的表達。通過測定由所述報導基因表達的蛋白的活性等，就是說通過檢測所述報導物活性，可以確定所述測試化合物是PPAR結合化合物或PPAR激活化合物，或者不是。
因此，在篩選能結合PPAR的未知配體時，或在確定一種測試化合物是否是PPAR結合配體的檢驗中，檢測和分離天然或人工合成的配體是可行的。另外，報導物活性的檢測可以根據本領域的技術，通過根據報導基因的類型，從染色、螢光、細胞活性中選擇的指標適當地完成。
另外，在本發明的篩選方法中，在上述系統中選擇性地增加以下步驟，以便檢測報導物活性(a)讓一種測試樣品與UCP1基因表達細胞接觸或導入該細胞，(b)測定UCP1基因在所述細胞中的表達量，和(c)篩選能增加UCP1基因在所述細胞中的表達量的化合物。
被用於篩選的「UCP1基因表達細胞」沒有特別限制，優選的是諸如白色脂肪細胞或褐色脂肪細胞的脂肪細胞或骨骼肌細胞。所述細胞可以是從動物組織中分離的原代培養細胞，或通過細胞的癌化或不死化製備的建立細胞系。作為脂肪細胞，例如，各種類型的脂肪細胞，如披露於以下實施例中的人類白色脂肪細胞、大鼠褐色脂肪細胞、3T3-L1(小鼠脂肪細胞)可以優選使用，而作為骨骼肌細胞，例如，各種類型的骨骼肌細胞，如SkMC(人骨骼肌細胞)和C2C12(小鼠骨骼肌細胞)可以優選使用。另外，UCP家族(解偶聯蛋白同系物)基因的例子包括UCP1基因、UCP2基因、UCP3基因、UCP4基因。
在本發明篩選方法的一個步驟中，讓測試樣品與能表達UCP1基因的細胞接觸和/或導入該細胞，並且測定UCP1基因的表達量。為了測定所述基因的表達量，可以使用本領域技術人員所熟知的各種類型的方法。所述基因表達的測定可以通過測定DNA、RNA或蛋白的量實現，例如，通過Northern印跡方法(Sambrook等，Molecular Cloning，201-206，(1987)，Cold Spring Harbor Laboratory)，RT-PCR方法(Shaffer等，Anal.Biochem.，190，292-296(1990))等。
當通過所述測定檢測到UCP1基因表達的顯著增強時，所述測試樣品的化合物就被認為具有促進nST功能的作用。UCP1的表達是在nST組織的細胞中的線粒體中燃燒脂肪或糖所必需的。不過，本發明的有效成分，具有顯著提高UCP1在上述組織的細胞中的表達量的作用。通過以上分子水平上的發現可以了解，本發明的藥劑能有效抑制內臟脂肪積累和減少內臟脂肪積累。
實際上，在實施例中，為了證實UCP(其表達是由PPARδ促進的)能夠發揮抑制或減少內臟脂肪積累的作用，就是說加速細胞內死亡和糖類的燃燒，將各種類型的PPAR配體添加到所述原代人脂肪細胞中，並且測定脂肪酸β氧化作用(已知這種氧化作用是脂肪酸燃燒促進作用的指標)。正如在實施例中具體示出的，對脂肪酸β氧化作用的促進，與UCP表達量成正比。在PPARδ配體中，對脂肪酸β氧化作用的促進最強。
本發明的藥劑具有提高內膜穿透型蛋白UCP1在諸如骨骼肌和脂肪的非戰慄產熱組織細胞的線粒體中的表達量的作用，它與nST相關，特別是與促進上述細胞的線粒體中的解偶聯呼吸、質子洩漏和產熱相關。本發明的藥劑包括具有PPARδ激活作用的化合物或它的衍生物作為有效成分，並且它具有高度表達UCP1的作用，其中，所述作用大大提高了UCP1在諸如上述脂肪和骨骼肌的nST組織中的細胞表達量。可以根據UCP1表達活性鑑定、分離和純化本發明的藥劑。通過作為有效成分化合由此獲得的物質，可以製備用於降低內臟脂肪積累量或用於抑制內臟脂肪積累的、特別是對抗肥胖具有顯著作用的藥劑。
本發明的藥劑可用於和治療肥胖，特別是治療哺乳動物(例如人類、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴、貓、馬、兔子等)或禽類的肥胖，因為它能促進能量代謝和脂肪代謝，並且降低血脂。另外，它還可用於預防或治療與肥胖並發的疾病(例如，成年人疾病，如糖尿病、高血壓、高血脂、動脈硬化或缺血性心臟病)等。
作為所述降低藥劑或抑制藥劑的載體，可以根據使用模式使用合適的填充劑、結合劑、增量劑、崩解劑、表面活性劑、防溼劑、賦形劑、稀釋劑等。藥劑的形狀可以根據使用目的適當地確定，並且沒有特殊限制。所述藥劑的例子包括固體藥劑(如片劑、顆粒、粉末、丸劑和膠囊)，液體藥劑，懸浮劑、乳劑等。通過這種方式獲得的抗糖尿病藥劑，抗肥胖藥劑，減少內臟積累脂肪的藥劑或抑制內臟積累脂肪的藥劑，優選是通過口服施用的。所述劑量是根據要治療的患者的症狀等適當確定的。因此，每天服用的劑量和次數等沒有特殊限制。
實施例下面將結合實施例對本發明作進一步的詳細說明，不過，本發明並不局限於這些實施例。在以下實施例中，每一種操作都是按照披露於「Molecular Cloning」中的方法進行的(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，除非另有說明。
藥劑對誘導UCP1和UCP2 mRNA在人類白色脂肪細胞中表達的影響(1)人類白色脂肪細胞的培養和RNA的製備人類脂肪細胞，來自皮下脂肪組織的未分化的冷凍原脂肪細胞(Cat.No.SP-F，Lot.No.L011399)是從美國ZenBio公司購買的。按照生產商的說明，在24孔平板上培養所述細胞，並且分化成脂肪細胞。將所培養的細胞用作人類白色脂肪組織衍生的脂肪細胞。具體地講，通過使用24孔平板在二氧化碳培養箱中，在37℃下在原脂肪細胞培養基中培養所述原脂肪細胞，直到達到鋪滿狀態。然後，將所述培養基更換成分化培養基，並且再繼續培養72小時，以便誘導分化。另外，將所述培養基更換成脂肪細胞培養基，並且進行14天培養，以便獲得完全分化的白色脂肪細胞。在以下條件下，對所述培養細胞進行進一步的培養。
將各種類型的測試化合物分別添加到培養基中，使它的最終濃度為10μM，並且將所述細胞培養6小時(n＝3)。所述測試化合物是PPARα配體必降脂(Bezafibrate)、WY14643、PPARδ配體YM-16638、PPARγ配體曲格列酮(Troglitazone)、羅格列酮(Rosiglitazone)、非專一性PPAR配體cPGI、伊洛前列素、β3腎上腺素能受體激動劑L755507。通過添加DMSO製備對照，它是所述測試化合物的溶劑，使它的最終濃度為0.5％，並且以與測試化合物相同的方式用它進行培養。對於每一種測試化合物或對照來說，回收培養的細胞，將它們懸浮在150微升的細胞裂解緩衝液(RLT溶液，由QIAGEN公司生產)中，然後裂解細胞，以便獲得細胞提取物。通過使用RNA製備試劑盒(商品名RNeasy總RNA試劑盒，由QIAGEN公司生產)按照該試劑盒所附帶的說明書，從所述細胞提取物中製備總RNA。
(2)UCP1 mRNA表達量的測定通過使用上面所獲得的總RNA(大約0.1微克)作模板，按下文所述方法進行實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，以便測定UCP1 mRNA表達量。
作為人UCP1基因的PCR引物，使用了兩種類型的寡核苷酸5』-AACCCACAGAGGTCGTGAAAG-3』(正向引物)和5』-CGTGTAGCGAGGTTTGATTCC-3』(反向引物)。作為PCR探針，使用了5』-CAGACTTCAAGCATAGAGCCATCTCCA-3』，所述探針是用一種螢光染料FAM標記過的。另外，G3PDH mRNA的測定是按照PEApplied Biosystems推薦的方法進行的，該測定是與2-Reporter Assay同時進行的。所述引物是由Amersham-Pharmacia Biotech公司化學合成的，而所述探針是由PE Applied Biosystems公司化學合成的(包括用所述螢光染料標記)。
通過使用待測定的製備的總RNA，上面所提到的引物和探針，以及通過商業渠道獲得的實時檢測PCR試劑盒(TaqMan EZ RT-PCR CoreReagent Kit(商品名)，由PE Applied Biosystems公司生產)製備表1所示的反應溶液，表中所示出的用量相應於一個反應試管。


將25微升如上製備的反應溶液放入PCR Perkin Elmer MicroampOptical Tuber(商品名，由PE Applied Biosystems公司生產)中，並且用一個蓋子密封所述試管。將該試管放在ABI PRISM 7700序列檢測系統(商品名，由PE Applied Biosystems公司生產)，並且在以下條件下進行反應。
在50℃下用50分鐘時間由UNG分解DNA汙染物，在60℃下進行逆轉錄處理10分鐘，並且在95℃下加熱2分鐘使UNG失活。在隨後的PCR反應中，在95℃下進行15秒鐘的變性處理，並且在58℃下進行90秒鐘的退火處理(循環次數40循環)。在該反應開始之後，通過實時處理自動確定螢光強度，以便測定UCP1 mRNA表達量。UCP1mRNA表達量是通過一種相對值表示的，該相對值是通過將被用作空白對照的參考樣品中的量設定為100，並且通過G3PDH mRNA表達量對所述值進行校正而計算的。
結果如圖1所示。PPARδ配體(具有激活PPARδ的作用的化合物)YM-16638能夠將UCP1 mRNA表達量提高到對照表達量的大約12倍。這表明，PPARδ配體能有效促進所述表達。由於該實驗證實了PPARδ配體能專一性地增強UCP1基因，很顯然，PPARδ配體對WAT的功能的促進作用，是由於PPARδ配體對WAT的直接作用。UCP1表達的顯著加強不僅出現在嚙齒類動物，而且還出現在人類的白色脂肪細胞中這一事實表明，PPARδ配體對於人類糖尿病和肥胖來說是極其有效的。
(3)UCP2 mRNA表達量的測定通過使用在上面的第(1)項獲得的總RNA(大約0.1微克)作模板，通過與上述第(2)項相同的實時聚合酶鏈式反應，測定UCP2 mRNA表達量。作為人類UCP2基因的PCR引物，使用了兩種類型的寡核苷酸5』-CGCCAAATGAGCTTTGCCT-3』(正向引物)和5』-GCCCTTGGTGTAGAACTGTTTGA-3』(反向引物)。作為PCR探針，使用了5』-TGTCCGCATCGGCCTGTATGATTC-3』。所述探針用一種螢光染料FAM標記。
結果如圖2所示。PPARδ配體(具有激活PPARδ的作用的化合物)YM-16638能夠將UCP2 mRNA表達量提高到對照表達量的大約2倍。
藥劑對人類白色脂肪細胞中游離脂肪酸β氧化的影響按與實施例1相同的方法製備人類完全分化的白色脂肪細胞，然後除去上清液，添加500微升培養基，該培養基是通過向脂肪細胞培養基中添加適量的油酸和棕櫚酸，使它們的濃度分別為0.67mM和0.33mM而製備的。將各種類型的測試化合物添加到所述培養基中，使它們的最終濃度為10μM，然後向每一個孔中添加[9，10(n)-3H]棕櫚酸(由Amersham Phamacia公司生產)，最終濃度為1μCi/毫升)，並且，在37℃下培養所述細胞48小時。所述測試化合物是PPARδ配體的YM-16638，PPARα配體的WY14643，β3腎上腺素能受體激動劑的L755507和PPARγ配體的Rosiglitazone。通過添加DMSO製備對照，DMSO是所述測試化合物的溶劑，使它的最終濃度為0.5％，並且以與測試化合物相同的方式培養。為了防止在培養期間由於細胞對[9，10(n)-3H]棕櫚酸的β氧化所產生的3H2O的蒸發，用由住友Bakelite公司生產的微型培養濾膜(MS-30055)對培養平板進行密封。
在培養48小時之後，將培養基的200微升上清液轉移到一個1.5毫升的Eppendorf管中，添加50微升50％的三氯乙酸，並且將該試管放在冰上保持30分鐘，以便產生沉澱，並且以15000rpm的速度離心該混合物10分鐘。然後，將沒有蓋子的1.5毫升Eppendorf管放入事先在它裡面放入了500微升蒸餾水的20毫升的玻璃瓶中，將上面所獲得的上清液的總量放入該Eppendorf管，並且用聚丙烯封裝蓋緊密密封所述玻璃瓶。在50℃下對所述玻璃瓶進行加熱18小時，以便所述玻璃瓶內部被3H2O飽和，在4℃下對所述玻璃瓶進行冷卻之後，再進行離心(1000rpm，1分鐘)。丟棄瓶中Eppendorf管中殘留的上清和Eppendorf管。向留在所述玻璃瓶中的含有3H2O的蒸餾水中添加5毫升液體閃爍混合物(Ultima Gold，由Packard公司生產)，並且在充分混合之後測定放射性。
結果如圖3所示。10μM的PPARδ配體YM16638將所述細胞的β氧化作用提高了30％。另一方面，10μM的PPARγ配體Rosiglitazone具有15％的增強作用，而10μM的PPARα配體WY14643和10μM的β3腎上腺素能受體激動劑L755507的β氧化，沒有表現出增強作用。以上結果表現出與在實施例1中觀察到的各種類型的PPAR配體對UCP1 mRNA表達的促進作用的良好的相關性。就是說，PPARδ配體通過促進UCP1基因表達提高了UCP1蛋白的數量，以便增強用游離脂肪酸作底物的β氧化。所述β氧化作用是UCP1的功能之一。這表明PPARδ配體能促進能量代謝，並且抑制或減少內臟脂肪積累。以上結果表明PPARδ配體能有效抗人類糖尿病和肥胖。
產業上利用的可能性本發明獲得了一種具有產熱促進作用等的物質，並且獲得了諸如抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內臟積累脂肪的藥劑或抑制內臟積累脂肪的藥劑的含有所述物質的藥劑。
序列表110帝人公司山岡一良高木健一郎片岡健一郎山本真則近西俊洋120通過測定PPARδ激活作用篩選物質的方法和藥劑130T-456150JP P2001-2165021512001-7-171606210121121212DNA213人工序列220
223人UCP1基因PCR的正向引物4001aacccacaga ggtcgtgaaa g 21210221121212DNA213人工序列220
223人UCP1基因PCR的反向引物4002cgtgtagcga ggtttgattc c 21210321127212DNA213人工序列
220
223人UCP1基因PCR的探針4003cagacttcaa gcatagagcc atctcca 27210421119212DNA213人工序列220
223人UCP2基因PCR的正向引物4004cgccaaatga gctttgcct 19210521123212DNA213人工序列220
223人UCP2基因PCR的反向引物4005gcccttggtg tagaactgtt tga 23210621124212DNA213人工序列220
223人UCP2基因PCR的探針4006tgtccgcatc ggcctgtatg attc 2權利要求
1.篩選具有產熱促進作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
2.篩選具有促進線粒體的解偶聯呼吸作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
3.篩選具有促進線粒體內膜質子洩漏作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
4.篩選能增加UCP1在含有線粒體的細胞中的表達量的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
5.篩選能促進脂肪酸β氧化作用的物質的方法，其特徵在於測定PPARδ激活作用。
6.權利要求1-5中任一項的篩選物質的方法，該方法利用了報導基因。
7.權利要求6的篩選具有產熱促進作用的物質的方法，該方法包括下面(1)-(3)的步驟(1)讓具有PPARδ激活作用的物質與能表達UCP1基因的細胞接觸和/或導入所述細胞；(2)測定UCP1基因在所述細胞中的表達量；(3)篩選能提高所述UCP1基因在所述細胞中的表達量的化合物。
8.權利要求7的篩選方法，其中能表達UCP1基因的細胞是脂肪細胞或骨骼肌細胞。
9.權利要求7的篩選方法，其中能表達UCP1基因的細胞是脂肪細胞。
10.具有產熱促進作用的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
11.促進線粒體的解偶聯呼吸的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
12.促進線粒體內膜中的質子洩漏的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
13.提高UCP1在含有線粒體的細胞中的表達量的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
14.能促進脂肪酸β氧化的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
15.權利要求10-14中任一項的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質是非專一性PPAR配體或PPARδ配體。
16.權利要求10-14中任一項的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質是卡巴前列環素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙醯基-3-羥基-2-丙基苯氧基)-丙氧基)苯乙酸。
17.權利要求11-13中任一項的藥劑，其中線粒體存在於骨骼肌、白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細胞中。
18.權利要求11-13中任一項的藥劑，其中線粒體存在於白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細胞中。
19.抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內臟積累脂肪的藥劑或抑制內臟積累脂肪的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質作為有效成分。
20.抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內臟積累脂肪的藥劑或抑制內臟積累脂肪的藥劑，其含有權利要求10-18中任一項的藥劑作為有效成分。
全文摘要
本發明提供了一種篩選包含具有PPARδ激活作用的化合物的產熱促進物質；含有所述化合物的藥物；以及具有抗糖尿病、抗肥胖或減少內臟積累脂肪作用的藥物。本發明提供一種藥劑，其包含具有激活過氧化物酶體增殖物激活的受體PPARδ的作用的化合物，並且具有促進非戰慄產熱(nST)，特別是促進在脂肪組織等的細胞中的線粒體解偶聯呼吸或線粒體內膜中的質子洩漏，和提高UCP1表達量的作用；本發明也提供含有上述化合物的抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑和減少內臟積累脂肪的藥劑。另外，本發明還提供了通過測定PPARδ激活作用篩選化合物的方法。
文檔編號G01N33/50GK1533504SQ02814450
公開日2004年9月29日 申請日期2002年7月17日 優先權日2001年7月17日
發明者山岡一良, 高木健一郎, 片岡健一郎, 山本真則, 近西俊洋, 一郎, 則, 洋 申請人:帝人株式會社