豬心中提取肌紅蛋白的方法及含有其的人總抗氧化狀態試劑盒與流程
2023-07-27 14:08:46 4
本發明涉及生物化學、檢測試劑領域，具體涉及的是一種採用硫酸銨沉澱、疏水層析兩步法從新鮮豬心中快速提取獲得高純度肌紅蛋白，通過噴霧乾燥技術製成乾粉，並將其應用於製備人總抗氧化狀態(TAS)試劑盒，檢測人總抗氧化狀態的技術；具體的為一種豬心中提取肌紅蛋白的方法及含有其的人總抗氧化狀態試劑盒。
背景技術：
：活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)主要包括羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫。在機體的正常生理代謝過程中會產生活性氧，同時一些環境因子例如紫外照射、吸菸、汙染等也會誘導活性氧的產生。自由基會引起DNA損傷從而導致突變，還能使蛋白質、核酸等大分子交聯進而影響細胞正常功能，同時自由基作為代謝中間產物，其強反應能力可使細胞中的多種物質發生氧化，誘導氧化應激，參與早老性痴呆、帕金森病等諸多疾病的病理過程。目前研究人機體抗氧化能力主要通過分析機體某種特定抗氧化成分和(或)自由基代謝產物的變化，如脂質過氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、穀胱甘肽(GSH)、抗壞血酸、維生素E等。而這種通過體外檢測某組分中單一的抗氧化成分變化的方式並不能準確反映機體抗氧化水平。總抗氧化狀態(TotalAntioxidantStatus,TAS)反映機體維持氧化-抗氧化狀態平衡的能力。文獻報導表明，機體的總抗氧化狀態與糖尿病、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化、風溼性關節炎、肝損傷、早老性痴呆、癌症等多種疾病有著密切的關係，因此測定機體血漿、血清、尿液等成分中總的抗氧化物質濃度，具有非常重要的生物學和臨床意義，有利於更全面地評估機體抗氧化狀態，掌握機體的防禦能力，為實施抗氧化輔助治療提供依據，以期有效地預防疾病和控制相關疾病的惡化。肌紅蛋白(Myoglobin，MB)由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成的結合蛋白，是肌肉內儲存氧的蛋白質。MB特有的結構使得其非常有利於氧的儲存和運輸，但正是這種富氧狀態使其極易受到自由基的攻擊，被氧化。氧化狀態的MB可以通過偶聯催化ABTS形成激活態ABTS，即ABTS+，ABTS+呈藍色，在600nm處有吸收峰，而體內的抗氧化物質能夠抑制該反應的產生，通過其抑制的大小判斷機體的抗氧化能力。肌紅蛋白的輔基為血紅素，其由四個吡咯類亞基組成一個環，環中心為一個亞鐵離子，該物質結構的特殊性和複雜性使得目前通過基因工程方式表達獲得的重組肌紅蛋白存在產量低、穩定性差等問題，限制了其在TAS試劑盒中的應用。目前有文獻報導，可採用兩次柱層析法對豬心肌、沙丁魚肌肉等動物組織中的肌紅蛋白進行提取，但該方法繁瑣，提取效率不高；也有報導稱從野牛心肌、馬屬動物心肌中提取的肌紅蛋白穩定性好，但缺點是原材料難以獲得、成本高，無法滿足試劑盒的批量生產需求。技術實現要素：本發明針對上述不足，提出了一種豬心中提取肌紅蛋白的方法，該方法產量高，提取成本低，獲得的肌紅蛋白具有良好的穩定性，能應用到TAS試劑盒中，以檢測機體血清、尿液等成分中總的抗氧化物質濃度，同時原材料來源豐富，容易獲得，可滿足試劑盒的批量生產需求。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為：一種豬心中提取肌紅蛋白的方法，主要步驟包括：1)將新鮮豬心去除脂肪和結締組織之後，加入破碎緩衝液，用組織勻漿機快速勻漿，並用高速冷凍離心機離心，去除沉澱，獲得粗提液；2)粗提液中加入硫酸銨，攪拌，室溫下沉澱0.5-1.5h後，用高速冷凍離心機離心，保留上清；3)在上清液中加入硫酸銨至飽和狀態，室溫下沉澱2h以上，並用高速冷凍離心機離心，棄去上清，獲得沉澱；4)沉澱用含硫酸銨的緩衝液復溶至原體積(此處的原體積為：步驟(1)中破碎緩衝液的體積)，過濾待上樣；5)疏水填料裝柱後，用含硫酸銨的緩衝液平衡，平衡結束後上樣，上樣完畢後，繼續平衡至無蛋白流出，然後用含有硫酸銨的緩衝液洗脫，根據洗脫峰收集目的蛋白；6)收集得到的目的蛋白通過SDS-PAGE檢測純度後，加入保護劑通過噴霧乾燥技術製備乾粉。本發明主要採用硫酸銨沉澱和疏水層析方法提取肌紅蛋白，硫酸銨沉澱具有適應性廣、對蛋白無損傷、原料成本低等優點；同樣疏水層析是一步純化，快速分離，具有處理時間短、生產成本低等優點，將二者結合使用，可快速、簡單地從豬心中提取獲得高純度的肌紅蛋白。通過上述純化方法，獲得的高純度肌紅蛋白，對其進行產量、純度等分析顯示：1000g豬心可以提取獲得2g天然肌紅蛋白，回收率50％以上，經SDS-PAGE分析發現，所提取的肌紅蛋白純度可達95％以上。該方法具有原材料易得、成本低、方法簡單、無需複雜設備、經濟實惠、提取得率高等優點，可實現批量生產。上述所用緩衝液為磷酸緩衝液、Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩衝液、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩衝液、MOP(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)緩衝液、硼酸鹽緩衝液中的一種或幾種，使用濃度為1mM～1000mM，且pH範圍在6～9.5之間。其中各個步驟中所使用的緩衝液可以不一致，但為了操作簡易一般整個過程使用同種緩衝液；上述所用硫酸銨質量濃度為：1)粗提液中為40-60％，此步驟通過鹽析作用，讓疏水性強的蛋白質形成沉澱，離心加以去除；2)復溶沉澱、平衡緩衝液中為30-40％，在此濃度條件下，肌紅蛋白具有一定的疏水性，可以和疏水填料結合；3)洗脫緩衝液為15-25％，在此濃度條件下，肌紅蛋白疏水性減弱，可與疏水填料解離，從而被洗脫下來。上述所用疏水填料為苯基、丁基、辛基、異丙基中的一種。為市售產品，比如西安恆成生物科技有限公司銷售的產品編號為13-0132-(01～06)的苯基類的疏水填料，產品編號為13-0132-(01～06)的13-0231-(01～06)的丁基類的疏水填料等等。上述噴霧乾燥所用保護劑為海藻糖、玉米糊精、玉米澱粉、阿拉伯樹膠中的一種或幾種，以目的蛋白收集液的體積計算，保護劑使用的質量濃度為0.1％～10％，保護劑的加入可保護肌紅蛋白在噴霧乾燥高溫處理過程中不發生變性、聚集、沉澱，同時能有效增大噴霧乾燥受熱面積，有利於噴霧乾粉的形成。本發明還提供一種含有上述肌紅蛋白的人總抗氧化狀態(TAS)試劑盒，該試劑盒由試劑1和試劑2組成：試劑1為：緩衝液5～1000mM(mmol/L)2,2』-重氮-雙-(3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽)(ABTS、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽)10～1000μM(10-6mol/L)肌紅蛋白1～100g/L防腐劑0.01～2g/L；試劑2為：過氧化氫(H2O2)2～100mM。本發明上述試劑盒中的緩衝液為為磷酸緩衝液、Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩衝液、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩衝液、MOP(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)緩衝液、硼酸鹽緩衝液中的一種或幾種，且pH範圍在5.5～8.5之間。本發明上述試劑盒中的防腐劑為疊氮化合物、硫柳汞、PC系列防腐劑中的一種或幾種。本發明中的TAS試劑盒，可用於檢測和評估機體血清、血漿、尿液、唾液、細胞裂解液等成分的總抗氧化狀態。本發明的試劑盒，由於肌紅蛋白具有良好的穩定性，可以配製成液體試劑，在37℃條件下可穩定15d左右，在4℃條件下可穩定1年左右，試劑盒性能指標基本保持不變；同時肌紅蛋白來源於豬心，提取工藝簡單、提取得率高，生產成本低，解決了從馬屬動物心肌、骨骼肌提取的高成本問題，有效降低試劑盒的生產成本，產生良好的經濟效益。本發明的優點及有益效果：1、本發明通過硫酸銨沉澱、疏水層析作用直接從新鮮豬心中提取肌紅蛋白，原材料易得、提取步驟簡單、提取率高、生產成本低、易實現產業化。2、通過上述提取方法，可獲得純度達95％以上的天然肌紅蛋白，穩定性良好，可應用於TAS試劑盒中，TAS試劑盒37℃條件下可穩定15d左右，在4℃條件下可穩定1年左右。3、通過本發明中的TAS試劑盒，各方面性能滿足要求，能用於檢測機體血清、尿液等成分中總的抗氧化物質濃度，評估總抗氧化狀態。附圖說明圖1本發明實施例1的SDS-PAGE圖譜。圖2本發明實施例2的SDS-PAGE圖譜。具體實施方式：下面結合具體實例進一步闡述本發明，但不是對本發明的限制，在本發明的精神和權力保護範圍內所做的任何修改，都將納入本發明的保護範疇。實例1：從豬心中提取肌紅蛋白1)將500g新鮮豬心去除脂肪和結締組織之後，加入1000ml50mM磷酸緩衝液pH8.0，用組織勻漿機快速勻漿5min後，高速冷凍離心機12000rpm離心40min，去除沉澱，獲得粗提液；2)粗提液中加入佔粗體液體質量40％的硫酸銨固體，輕微攪拌，待溶解完全，室溫下沉澱1h後，用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，棄去沉澱，保留上清液；3)在上清液中繼續加入硫酸銨固體至飽和狀態，輕微攪拌，待溶解完全，室溫下沉澱2h後，用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，棄去上清，獲得沉澱；4)沉澱用含30％硫酸銨的緩衝液復溶至1000ml，用0.45μm濾膜過濾以致澄清；5)將200ml苯基疏水填料裝入層析柱中，用3000ml30％硫酸銨的100mM磷酸緩衝液pH8.0平衡，平衡結束後上樣，上樣完畢後，繼續平衡至無蛋白流出，然後用含有15％硫酸銨的100mM磷酸緩衝液pH8.0洗脫，根據洗脫峰收集目的蛋白；6)通過SDS-PAGE檢測收集液中目的蛋白的純度，電泳結果表明純度不低於95％(圖1)，將收集液根據體積加入2％阿拉伯樹膠，通過噴霧乾燥技術製備乾粉，其中噴霧乾燥條件為進口溫度150℃、噴霧速度100ml/h。實例2：從豬心中提取肌紅蛋白1)將1000g新鮮豬心去除脂肪和結締組織之後，加入2000ml120mMTris緩衝液pH8.8，用組織勻漿機快速勻漿10min後，高速冷凍離心機12000rpm離心40min，去除沉澱，獲得粗提液；2)粗提液中加入50％的硫酸銨固體，輕微攪拌，待溶解完全，室溫下沉澱1h後用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，保留上清；3)在上清液中加入硫酸銨固體至飽和狀態，輕微攪拌，待完全溶解，室溫下沉澱2h後，用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，棄去上清，獲得沉澱；4)沉澱用35％硫酸銨150mMTris緩衝液pH8.5復溶至2000ml，0.45μm濾膜過濾後，準備上樣；5)將500ml辛基疏水填料，裝入層析柱中，用含35％硫酸銨的150mMTris緩衝液pH8.5平衡，平衡結束後上樣，上樣完畢後，繼續平衡至無蛋白流出，然後用含有25％硫酸銨的150mMTris緩衝液pH8.5洗脫，根據洗脫峰收集目的蛋白；6)通過SDS-PAGE檢測收集液中目的蛋白的純度，電泳結果表明純度不低於95％(圖2)，將收集液按體積加入5％海藻糖，通過噴霧乾燥技術製備乾粉，其中噴霧乾燥條件為進口溫度170℃，噴霧速度250ml//h。實例3：從豬心中提取肌紅蛋白1)將800g新鮮豬心去除脂肪和結締組織之後，加入1400ml，250mM.硼酸緩衝液pH7.2中，用組織勻漿機快速勻漿25min後，高速冷凍離心機8000rpm離心40min，去除沉澱，獲得粗提液；2)粗提液中加入60％的硫酸銨固體，輕微攪拌，室溫下沉澱1h後用高速冷凍離心機8000rpm離心40min，保留上清；3)在上清液中加入硫酸銨固體至飽和狀態，室溫下沉澱2h後用高速冷凍離心機7500rpm離心50min，棄去上清，獲得沉澱；4)沉澱用40％的飽和硫酸銨緩衝液復溶至1400ml，0.8μm濾膜過濾待上樣；5)將600ml丁基疏水填料裝柱後，用含40％硫酸銨的200mM硼酸鹽緩衝液pH7.2平衡3000ml，平衡結束後上樣，上樣完畢後，繼續平衡至無蛋白流出，然後用含有20％硫酸銨200mM硼酸鹽緩衝液pH7.2洗脫，根據洗脫峰收集目的蛋白；6)通過SDS-PAGE檢測收集液中目的蛋白的純度，電泳結果表明純度不低於95％(圖2)，將收集液中加入4％的玉米糊精，通過噴霧乾燥技術製備乾粉，噴霧乾燥條件為進口溫度120℃，噴霧速度80ml/h。獲得的肌紅蛋白SDS-PAGE電泳後條帶分析獲得的譜圖如附圖1-2所示，顯示條帶清晰，純度高，豬心中肌紅蛋白的分子量大小約在16.7KDa左右。實施例4：TAS試劑盒的製備將實施案例1、2、3中提取獲得的肌紅蛋白配製TAS試劑盒。試劑1為：100mMTris緩衝液，pH7.4200μMABTS20g/L肌紅蛋白1g/L疊氮鈉試劑2為：30mMH2O2試劑盒檢測條件為：RateA法，R1:R2:S＝250:50:5，主波長600nm，副波長405nm，讀數點22-32，反應向上。實施例5：TAS試劑盒的製備將實施案例1、2、3中提取獲得的肌紅蛋白配製TAS試劑盒。試劑1為：100mM磷酸緩衝液，pH6.8200μMABTS10g/L肌紅蛋白1g/L硫柳汞試劑2為：30mMH2O2試劑盒檢測條件為：兩點速率法，R1:R2:S＝210:80:10，主波長600nm，副波長405nm，讀數點25-35，反應向上。實施例6：TAS試劑盒性能檢測對實施例4中配置的TAS試劑盒的性能指標進行檢測。1)線性範圍測定：以維生素E代表抗氧化物質用於測定TAS試劑盒的線性範圍。將維生素E(VitaminE，VE)用生理鹽水稀釋一系列倍數，通過本發明製備的TAS試劑盒測定不同稀釋倍數下VE的濃度，每個點測3次，用其平均值計算線性係數。數據見表1：表1：不同稀釋倍數下，抗氧化物質(VE)濃度的測定結果稀釋倍數10.90.80.70.60.50.40.30.20.10測定濃度1(mM)2.562.212.031.781.551.190.950.720.500.260.07測定濃度2(mM)2.532.262.051.761.511.260.960.710.510.260.08測定濃度3(mM)2.562.312.041.701.581.291.050.780.540.230.07平均濃度(mM)2.552.262.041.751.551.250.990.740.520.250.08將表1中的測定濃度與稀釋倍數進行統計學分析，獲得相關線性方程為：Y＝2.502X+0.0201，R2＝0.9987，由此獲得本發明試劑盒的檢測線性範圍為0～2.5mM，符合說明書要求的0～2.2mM。2)精密度測定：利用TAS試劑盒分別連續檢測高低兩個不同濃度下的Ve，檢測次數為20次，計算CV值，用以表示精密度。數據如表2、表3：表2：高濃度抗氧化物質(VE)的連續檢測結果根據表2，經統計學分析，高濃度VE平均測值為2.237mM，標準差為0.0615mM，CV為2.75％，變異係數符合說明書要求5％，檢測精密度高。表3：低濃度抗氧化物質(VE)的連續檢測結果檢測次數12345678910濃度(mM)0.750.730.720.740.740.730.770.760.730.73檢測次數11121314151617181920濃度(mM)0.690.680.730.790.760.710.790.70.720.72根據表2，經統計學分析，低濃度VE平均測值為0.7345mM，標準差為0.02947mM，CV為4.01％，變異係數符合說明書要求5％，檢測精密度高。實施例7：TAS試劑盒性能檢測對實施例5中配置的TAS試劑盒的性能指標進行檢測。1)線性範圍測定：用維生素E代表抗氧化物質用於測定TAS試劑盒的線性範圍。將維生素E(VitaminE，VE)用生理鹽水稀釋一系列倍數，通過本發明製備的TAS試劑盒測定不同稀釋倍數下VE的濃度，每個點測3次，用其平均值計算線性係數。數據見表1：表1：不同稀釋倍數下，抗氧化物質(VE)濃度的測定結果稀釋倍數10.90.80.70.60.50.40.30.20.10測定濃度1(mM)2.552.232.021.781.531.220.960.740.520.250.06測定濃度2(mM)2.562.242.011.791.551.230.970.760.500.260.07測定濃度3(mM)2.542.221.991.771.511.220.970.730.490.230.06平均濃度(mM)2.552.232.011.781.531.220.970.740.500.250.06將表1中的測定濃度與稀釋倍數進行統計學分析，獲得相關線性方程為：Y＝2.501X+0.008，R2＝0.9986，由此獲得本發明試劑盒的檢測線性範圍為0～2.5mM，符合說明書要求的0～2.2mM。2)精密度測定：利用TAS試劑盒分別連續檢測高低兩個不同濃度下的Ve，檢測次數為20次，計算CV值，用以表示精密度。數據如表2、表3：表2：高濃度抗氧化物質(VE)的連續檢測結果根據表2，經統計學分析，高濃度Ve平均測值為2.235mM，標準差為0.0476mM，CV為2.13％，變異係數符合說明書要求5％，檢測精密度高。表3：低濃度抗氧化物質(VE)的連續檢測結果檢測次數12345678910濃度(mM)0.780.730.740.690.720.760.730.740.780.7檢測次數11121314151617181920濃度(mM)0.760.750.730.740.690.760.780.780.760.71根據表2，經統計學分析，低濃度Ve平均測值為0.7415mM，標準差為0.02925mM，CV為3.94％，變異係數符合說明書要求5％，檢測精密度高。綜上，依據本發明方法製備的TAS試劑盒，對抗氧化物質的檢測線性良好、範圍廣，變異係數低，精密度高，可滿足於機體抗氧化狀態的檢測。當前第1頁1 2 3