一種快速獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化方法

2023-07-28 01:43:56 1

專利名稱：：一種快速獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化方法一種快速獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化方法
技術領域：
：本發明屬於植物基因工程
技術領域：
，具體說是建立了一種簡單、快速、高效地獲得大豆轉基因愈傷組織的方法，該方法在大豆生物技術相關領域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉化體系的建立等方面有廣泛的應用價值。
背景技術：
：:大豆(GlycinemaxL.)起源於我國，栽培歷史悠久，是人類主要植物性蛋白質來源之一，又是重要的家畜飼料和許多工業的原料，在醫學上也有很大價值，因而是一種非常重要的農作物。大豆的生產容易受到各種環境因素的影響，因此產量很不穩定，常規育種技術由於受到物種雜交不親和性以及不良基因性狀連鎖等因素的影響，在引入其他物種優良基因的同時也帶入了許多不良的基因，因而很難進一步利用。而利用大豆轉基因技術可以定向培育大豆優良品種，並將對大豆產量的提高和品質的改良起到重大的推動作用。自Hinchee等(1988)和McCabe(1988)分別用兩種轉化方法轉化大豆成功得到轉基因植株以來，雖然也相繼有這方面的報告，但是大豆轉化一直沒有突破性的進展，具體來說就是轉化效率低、操作流程繁瑣，並且實驗結果的重複性差。目前應用於大豆遺傳轉化的方法主要有根癌農桿菌介導法、基因槍法、真空抽濾法和花粉管導入法等，但其中獲得較為廣泛應用的只有根癌農桿菌介導法和基因槍法。農桿菌介導的大豆遺傳轉化與其它方法比起來具有經濟、操作簡單、能夠準確、完整地將T-DNA以單拷貝或低拷貝的形式插入到受體基因組中等優點，因此仍然是大豆遺傳轉化的首選方法。利用農桿菌介導大豆遺傳轉化選用的外植體通常是分生能力較強，能夠在分生區的細胞整合外源基因到受體細胞的染色體中，如子葉節、胚尖、下胚軸、萌動的子葉等外植體，以子葉節外植體進行轉化是傳統的方法，這一系統由Hinchee等利用Peking無菌苗子葉節為外植體首次獲得大豆轉基因植株，之後Olhoft等報告在共培養階段添加L-半胱氨酸等抗氧化劑可以使轉化率有顯著的提高。近年來用成熟的大豆胚尖、下胚軸和萌動的子葉做外植體進行轉化也有許多成功的報告。雖然大豆的遺傳轉化取得了一定的進展，但是利用這些外植體進行轉化存在外植體的製備比較煩瑣、轉化植株中嵌合體較多、後期篩選的工作量大等諸多問題一直制約著轉化效率的提高。植物的愈傷組織(callus)原指植物體的局部受到創傷剌激後，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，可起源於植物體任何器官內各種組織的活細胞。在組織培養中，將植物器官或組織(如芽、莖尖、根尖、下胚軸或花葯)的一部分切下來，在無菌的條件下放在適當的人工培養基上進行培養，這些器官或組織就會進行細胞分裂，形成一團沒有分化的薄壁細胞，叫做愈傷組織。從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經歷三個時期啟動期、分裂期和分化期。啟動期指細胞準備進行分裂的時期。外源植物生長激素對誘導細胞開始分裂效果很好。分裂期是指外植體細胞經過誘導以後脫分化，不斷分裂、增生子細胞的過程。分裂期的愈傷組織細胞分裂快，結構疏鬆，顏色淺而透明。分化期是指在分裂的末期，細胞內開始出現一系列形態和生理上的變化，從而使愈傷組織內產生不同形態和功能的細胞。愈傷組織在適合的光照、溫度和一定的營養物質與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產生出植物的各種器官和組織，進而發育成一棵完整的植株。愈傷組織在快繁技術、單倍體育種以及人工種子的製備等有廣泛的應用價值。隨著生物技術的發展，基因工程給人類帶來了許多社會和經濟效益。許多研究者通過在植物細胞中轉入外源基因來調控作物的農藝生產性狀，進一步達到改善作物品質和提高產量的目的。如高越峰等(2001)將高賴氨酸蛋白基因轉入水稻的愈傷組織通過再生獲得了賴氨酸含量大大提高的轉基因水稻植株；Fernandoetal.(2005)將crylC基因轉入玉米幼胚愈傷組織獲得了抗病性強的轉基因玉米；邢莉萍等(2008)將小麥類甜蛋白基因轉化小麥的愈傷組織獲得了抗白粉病的轉基因小麥植株。此外，通過轉基因手段可以在愈傷組織中增強某種關鍵酶基因的表達水平來提高有用次生代謝產物的含量，如姜楠等(2009)通過農桿菌介導大豆子葉節細胞獲得了異黃酮合成酶基因高表達的大豆轉基因愈傷組織。在功能基因的研究中，利用轉基因愈傷組織可以避免葉綠素自發螢光的幹擾來研究目的基因編碼蛋白的定位，如夏玉鳳(2006)建立了一個可以利用菸草的轉基因愈傷組織研究目的蛋白亞細胞定位的體系。目前，關於大豆轉基因愈傷組織的轉化體系的研究很少，在現有的幾篇報導中都使用大豆無菌苗子葉節作外植體，外植體的製備繁瑣，轉化效率低，並且在轉化的外植體只能誘導出一塊獨立的轉基因愈傷組織。另外，以前的研究在外植體的取材上也僅僅限於國外幾個比較容易轉化的大豆品種，而利用轉基因愈傷組織獲得具有穩定遺傳轉化大豆植株的研究在國內外也屬空白，因此在很大程度上制約著大豆基因工程的發展。而建立一個簡單、快速、高效地獲得轉基因愈傷組織的轉化體系，不僅對於大豆功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測有重要的理論意義，而且對於大豆基因工程、細胞工程、代謝工程和高效大豆遺傳轉化體系的建立有重要的現實意義。
發明內容本發明目的是解決現有的獲得大豆轉基因愈傷組織的技術體系中，因外植體製備繁瑣，轉基因愈傷組織誘導效率低，外源基因難以轉化大豆受體細胞以及轉基因愈傷組織的純合困難，使得轉化工作強度大，實驗流程長，並且獲得的轉化愈傷組織難以滿足研究和應用的需求等問題，提供一種新的簡單、快速、高效地獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化方法。本發明通過以下技術方案實現簡單、快速、高效地獲得大豆轉基因愈傷組織，具體包括以下步驟第一步外植體的製備將成熟的大豆種子經過氯氣燻蒸2.5-5小時後轉於含有0.8-1.5mgL—16-BA的無菌水中，2『C黑暗條件下萌發10-18小時後去除種皮、子葉、原葉和胚根，剩餘的下胚軸切段作為待轉化的外植體。第二步農桿菌工程菌液的製備及浸染將含有外源基因的農桿菌LBA4404(農桿菌LBA4404購自中國科學研究院微生物研究所)單菌落接種於YEP液體培養基中，28t:、200rpm振蕩12小時，然後以1/100的比例擴大培養，待菌液的濃度達到0D6。。=0.8時，4°C、4000rpm離心12分鐘，收集菌體並重懸於液體浸染培養基中至0D6。。=0.5，將製備好的外植體浸泡於菌液中浸染30分鐘。第三步外植體與農桿菌共培養外植體經過農桿菌浸染後用無菌濾紙吸乾表面多餘的菌液，然後切口向下平鋪於表面蓋有無菌濾紙的半固體共培養基上，24t:黑暗條件下培養3天。第四步轉基因愈傷組織的誘導將共培養3天的外植體切口向下轉入轉基因愈傷組織誘導培養基上，於25°C、光照強度100Em—2s—^光周期16h光/8h暗的條件下培養10天。第五步轉基因愈傷組織的篩選及繼代待轉基因愈傷組織初步形成後，將其轉入轉基因愈傷組織篩選培養基上，兩周後將其從外植體的兩端切下，轉入相同的轉基因愈傷組織篩選培養基上繼續篩選，以後每隔兩周，便將形成的轉基因愈傷組織切成2mm的小塊，轉入新鮮的轉基因愈傷組織篩選培養基上繼代培養一次來保持轉基因愈傷組織的旺盛生長。在本發明中，所述的農桿菌浸染下胚軸切段使用的液體浸染培養基組分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—工，NaH2P04H2015mgL—、KIO.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo。4*2H200.025mgL—、CoCl2*6H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—、鹽酸妣B多醇l.OmgL—、鹽酸硫銨素10mgL一、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL-、乙醯丁香酮O.04gL—、pH5.4。所述農桿菌與外植體共培養的半固體共培養基組分如下KN03250mgL一1，CaCl2*2H2015mgL—、MgS。4*7H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—1，NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS04*7H202.78mgL—、肌醇100mgL一、煙酸l.OmgL一1，鹽酸吡眵醇1.OmgL—、鹽酸硫銨素10mgL—、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL—、L_半胱氨酸0.4gL—、DTT0.15gL-、Na2S2030.25gL-、乙醯丁香酮0.04gL—、瓊脂粉5gL-、pH5.4。所述的轉基因愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基+蔗糖30gL—^2，4-D2.OmgL—丄+6-BA0.5mgL—丄+MES0.6gL—丄+潮黴素10mgL—丄+瓊脂粉7gL—、pH5.8。所述的轉基因愈傷組織篩選培養基為MS基本培養基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—^6-BA0.5mgL—一MES0.6gL—一潮黴素50mgL—,瓊脂粉7gL—、pH5.8。本發明同時提供了用上述方法獲得的大豆轉基因愈傷組織在大豆生物技術相關領域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉化體系的建立中的應用。例如在檢測目的基因啟動子活性的應用利用一個與大豆葉片衰老相關的類受體蛋白激酶基因(GmSARK)啟動子與GUS報告基因構建獲得"啟動子_目的基因"的融合基因，將其轉化大豆下胚軸切段外植體獲得了在愈傷組織中GUS基因高表達的大豆GmSARK::GUS轉基因愈傷組織。本發明的優點和積極效果本發明選用國內主栽的大豆優良品種"中黃13"的下胚軸切段為外植體，利用農桿菌介導的方法可以將外源基因整合到大豆受體細胞的基因組中，通過對轉化細胞進行轉基因愈傷組織的誘導和篩選，從而建立了一個簡單、快速、高效地獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化體系。該轉化體系適用於我國主栽大豆優良品種，打破了目前國內外在大豆轉基因愈傷組織的轉化研究中僅僅使用國外幾個較容易轉化的大豆品種的瓶頸；該轉化體系的外植體製備比較簡單，不需要轉化前培養大豆無菌苗製備外植體，成熟的大豆種子在無菌水中浸泡10-18小時後就可以獲得下胚軸切段外植體，並且不必對外植體做精細的傷口處理，因此要比傳統的大豆轉基因愈傷組織轉化體系中所用的子葉節外植體的製備省時省力；利用該轉化系統，轉基因愈傷組織的轉化效率高，通過對轉基因愈傷組織GUS報告基因的檢測統計外源基因轉化效率高達87.7%，組織化學染色同時表明GUS報告基因在下胚軸切段外植體的上下兩端能同時各自獨立地誘導出轉基因愈傷組織。因此該大豆轉基因愈傷組織的轉化方法具有較廣泛的適用性和高效性。圖1是大豆轉基因愈傷組織的轉化流程。(a)大豆下胚軸切段外植體的製備過程；(b)農桿菌浸染大豆下胚軸切段後外植體與農桿菌共培養；(c)外植體共培養後轉入含有10mgL—^朝黴素的轉基因愈傷組織誘導培養基；(d)轉基因愈傷組織初步形成後轉入含有50mgL—1潮黴素的轉基因愈傷組織篩選培養基上篩選2周。圖2是轉基因愈傷組織在含有50mgL—1潮黴素的轉基因愈傷組織篩選培養基上篩選2周後GUS的染色結果，左為對照(CK)，右為轉基因愈傷組織(TR)。圖3是將GmSARK::GUS融合基因轉化大豆下胚軸切段誘導的轉基因愈傷組織在轉基因愈傷組織篩選培養基上篩選4周的GUS染色結果。(a)染色前的愈傷組織，左為對照(CK)，右為轉基因愈傷組織(TR);(b)對應GUS染色後的愈傷組織，左為對照(CK)，右為轉基因愈傷組織(TR)。具體實施方式實施例1:大豆轉基因愈傷組織的獲得1、大豆下胚軸切段外植體的製備挑選健康成熟的"中黃13"大豆種子，放入含有氯氣(由10mlNaC10和1ml濃HCl反應生成)的密閉容器內燻蒸2.5-5小時(此範圍內的具體時間變動對結果無顯著影響)後浸泡於含有lmgL—16-BA(取0.8、1.5mgL—16_BA的濃度對結果無顯著影響)的無菌水中，消毒好的大豆在28t:黑暗條件下萌發10-18小時(此範圍內的具體時間變動對結果無顯著影響)，用io號手術刀片去除種皮和一片子葉，然後去除另外一片子葉和原葉，最後切掉胚根(圖la)，將製備好的外植體收集到一個含有少量無菌水的培養皿中待浸染。2、農桿菌工程菌液的製備及浸染從YEP固體培養基(見附錄1)平板上用接種環挑取含有雙元表達載體pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司)質粒的農桿菌LBA4404(購自中國科學研究院微生物研究所)單菌落接種於5mlYEP液體培養基(見附錄2)中[雙元表達載體pCAMBIA1301轉化農桿菌LBA4404參見IKfgen和Willmitzer(1988)的方法]，在28。C環境下200rpm振蕩12小時。然後以1/100的比例第二次擴大培養，待菌液的濃度達到0D6。。=0.8時，4000rpm，4t:離心12分鐘，收集菌體，重懸於液體浸染培養基LIM(見附錄3)，然後將製備好的外植體浸泡於農桿菌菌液中30分鐘。3、外植體與農桿菌共培養外植體經過農桿菌浸染後用無菌濾紙吸乾表面多餘的菌液，然後切口向下平鋪於表面蓋有無菌濾紙的半固體共培養基CCM(見附錄4)上(圖lb)，24t:黑暗條件下培養3天。4、轉基因愈傷組織的誘導將共培養3天的外植體切口向下轉於轉基因愈傷組織誘導培養基CIM(見附錄5)上(圖lc)，25°C、100iiEm—2s—1光照強度、16h光/8h暗的光周期條件下培養10天。5、轉基因愈傷組織的篩選及繼代待轉基因愈傷組織初步形成後，將其轉入轉基因愈傷組織篩選培養基CSM(見附錄6)篩選兩周(圖ld)，兩周後將其從外植體的兩端切下，轉入相同的轉基因愈傷組織篩選培養基上繼續篩選，以後每隔兩周，便將形成的轉基因愈傷組織切成2mm的小塊，轉入新鮮的轉基因愈傷組織篩選培養基上繼代培養一次來保持轉基因愈傷組織的旺盛生長。實施例2:大豆轉基因愈傷組織轉化效率試驗選用我國主栽的"中黃13"大豆品轉化，按照實施例1中介紹的獲得大豆轉基因愈傷組織的方法將含有GUS報告基因的雙元表達載體pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司)質粒的農桿菌LBA4404(農桿菌LBA4404購自中國科學研究院微生物研究所)浸染大豆下胚軸切段[雙元表達載體pCAMBIA1301轉化農桿菌LBA4404參見H6fgen和Wfillmitzer(1988)的方法]，外植體經過共培養後在轉基因愈傷組織誘導培養基CIM(見附錄5)誘導10天，待轉基因愈傷組織初步形成後將其轉入轉基因愈傷組織篩選培養基CSM(見附錄6)篩選2周，通過統計GUS報告基因陽性率確定外源基因的轉化效率以及在一個外植體兩端同時形成轉基因愈傷組織的轉化效率。GUS組織化學染色參考Bl咖e和Grierson(1997)的方法，染色時間為6小時，愈傷組織中的藍色為報告基因GUS組織化學染色，表明外源基因已經整合到受體細胞的染色體中並表達，結果見表1。表l結果顯示，供試的"中黃13"大豆品種有較高的轉化效率，轉化效率高達87.7%，遠遠高於目前所報導的大豆轉基因愈傷組織的轉化效率。另外，目前在誘導大豆轉基因愈傷組織的研究中通常使用子葉節作外植體，結果只能在子葉節處誘導出一塊愈傷組織，而本發明所使用的下胚軸切段外植體能夠在其兩端同時形成兩塊獨立的轉基因愈傷組織(圖2)，轉化效率為75.8%，說明本發明在農桿菌介導大豆轉基因愈傷組織轉化方法的獨特性和高效性。表1大豆轉基因愈傷組織的轉化效率試驗i纖批次浸染外植GUS陽性愈傷轉化效率外植體兩端的愈傷組外植體兩端同時形體數組織的外植(%)織都顯示GUS陽性的離基因愈傷組織體數外植體數的轉化效率(%)1676191.15277.62544583.34074.13706288.65375.7平均87.775.8注(1)轉化效率=GUS陽性愈傷組織的外植體數/浸染外植體數X100%;(2)外植體兩端同時形成轉基因愈傷組織的轉化效率=外植體兩端的愈傷組織都顯示GUS陽性的外植體數/浸染外植體數X100%8實施例3:大豆轉基因愈傷組織的獲得在目的基因啟動子活性檢測中的應用選用我國主栽的"中黃13"大豆品種做實驗材料，按照實施例1中介紹的獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化方法將含有"GmSARK啟動子-GUS"融合基因的農桿菌LBA4404(農桿菌LBA4404購自中國科學研究院微生物研究所)浸染大豆下胚軸切段外植體[GmSARK啟動子序列GeneBank登錄號AY870314;"GmSARK動子-GUS"融合基因的構建參見本實驗室李鵬麗等(李鵬麗，馬媛媛，李小平，張麗文，王勇，王寧寧.大豆類受體蛋白激酶基因rlpk2啟動子克隆及初步分析.植物生理與分子生物學學報，2006，32:315319.)的方法；rlpk2後被命名為GmSARK;"GmSARK啟動子-GUS"融合基因轉化農桿菌LBA4404參見H6fgen和Willmitzer(1988)的方法]，經過轉基因愈傷組織的誘導和篩選，利用Blume和Grierson(1997)組織化學染色的方法，檢測篩選4周後轉基因愈傷組織中GmSARK啟動子驅動的GUS基因是否能夠表達。只有染色後呈現藍色的愈傷組織中才有GUS報告基因的表達，也代表著GmSARK啟動子在該愈傷組織中具有活性。染色時間為6小時，將材料的染色結果掃描成圖片後保存。染色結果如圖3:光周期16h光/8h暗條件下，在轉化"GmSARK啟動子-GUS報告基因"融合基因的大豆轉基因愈傷組織中有很強的GUS活性，這與本實驗室前期研究GmSARK啟動子在微型番茄Micro-Tom的轉基因愈傷組織有很高活性的結果是一致的[李鵬麗，馬媛媛，李小平，張麗文，王勇，王寧寧.大豆類受體蛋白激酶基因rlpk2啟動子克隆及初步分析.植物生理與分子生物學學報，2006，32:315319.(rlpk2後被命名為GmSARK)]。該實驗結果也進一步驗證了本發明的適用性、可靠性和高效性。該大豆轉基因愈傷組織轉化體系的建立，在大豆生物技術相關領域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉化體系的建立提供了一條新的途徑。附錄1、YEP固體培養基成分蛋白腖10gL—、酵母膏10gL-、NaCl5gL—、瓊脂粉15gL-、pH7.0。2、YEP液體培養基成分蛋白腖10gL—、酵母膏10gL—、NaCl5gL—、pH7.0。3、LM(液體浸染培養基)大量營養成份細3250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—1;微量營養成份KIO.075mgL—SHsBOa0.3mgL—SMnSO**4H201.OmgL—SZnSO**7H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、鐵鹽Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—1;有機營養成份肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—、鹽酸吡哆醇1.OmgL—、鹽酸硫銨素10mgL—1;植物激素6-BA2.OmgL—、IBA0.2mgL—1;附加成份蔗糖30gL-、MES0.6gL-、乙醯丁香酮0.04gL-1;pH5.4。4、CCM(半固體共培養基)大量營養成份細3250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—1;微量營養成份KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—、ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—1;鐵鹽Na2-EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—1;有機營養成份肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—1，鹽酸吡哆醇1.OmgL—1，鹽酸硫銨素lOmgL—1;植物激素6-BA2.OmgL-、IBA0.2mgL-1;附加成份:蔗糖30gL—、MES0.6gL-、0.04gL-1乙醯丁香酮，O.4gL—^-半胱氨酸，0.15gL—力TT，0.25gL—Aa^A,凝固劑瓊脂粉5gL—、pH5.4。5、CIM(轉基因愈傷組織誘導培養基)MS基本培養基，蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—、6-BA0.5mgL—、MES0.6gL—、潮黴素lOmgL—、頭孢黴素400mgL—、瓊脂粉7gL—、pH5.8。6、CSM(轉基因愈傷組織篩選培養基)MS基本培養基，蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—、6-BA0.5mgL—、MES0.6gL—S潮黴素50mgL—、頭孢黴素400mgL—、瓊脂粉7gL—、pH5.8。7、MS基本培養基成分大量營養成份NH4N031650mgL—、KN031900mgL—、CaCl22H20440mgL—、MgS047H20370mgL—、KH2P04170mgL—1;微量營養成份KIO.83mgL—^H^C^6.2mgL—、MnS。4*4H2022.3mgL—、ZnS04*7H208.6mgL—、Na2Mo042H200.25mgL—、CuS045H200.025mgL—、CoCl26H200.025mgL—1;鐵鹽Na2-EDTA2H2037.3mgL—、FeS047H2027.8mgL—1;有機營養成份肌醇lOOmgL—、煙酸O.5mgL—、鹽酸吡哆醇O.5mgL—、鹽酸硫胺素0.lmgL—、甘氨酸2mgL—、[OO78]參考文獻高越峰，荊玉祥，沈世華，田世平，匡廷雲，SamuelS.M.SUN.高賴氨酸蛋白基因導入水稻及可育轉基因植株的獲得.植物學報，2001，43:506511.黃培堂，等譯.《分子克隆實驗指南》(第三版)，北京科學出版社，2002.姜楠，王東，崔徵，鄭英秀.異黃酮合成酶基因高表達的大豆轉基因愈傷組織的研究瀋陽藥科大學學報，2009，26:6368.李鵬麗，馬媛媛，李小平，張麗文，王勇，王寧寧.大豆類受體蛋白激酶基因rlpk2啟動子克隆及初步分析.植物生理與分子生物學學報，2006，32:315319.夏玉鳳.用於蛋白亞細胞定位研究的菸草愈傷組織培養條件優化，河北師範大學學報，2006，30:343345.邢莉萍，王華忠，蔣正寧，倪金龍，曹愛忠，於玲，陳佩度.小麥類甜蛋白基因的轉化及轉基因植株的抗病性分析.作物學報，2008，34:349354.Bl咖eB，GriersonD.ExpressionofACCoxidasepromoter_gusfusionsintomatoandnicotianaplumbaginifoliaregulatedbydevelopmentalandenvironmentalstimuli.PlantJournal,1997，12:731746.FernandoH.Valicente，NewtonP.etal.TransformationofMaizeEliteLineswithcrylCaofBacillusthuringiensistoControlSpodopterafrugiperda.6thPacificRimConferenceontheBiotechnologyofBacillusthuringiensisanditsEnvironmentalImpact.2005,8183.HincheeMA，ConnorWardDV，NewellCA.etal.ProductionoftransgenicsoybeanplantsusingAgrobacterium-mediatedDNAtransfer.Bio/Technology，1988，6:915922.H6fgenR，WillmitzerL.StorageofcompetentcellsforAgrobacteriumtransformation.NucleicAcidsResearch，1988，16:9877.JeffersonRA.Assayingchimericgenesinplants:theGUSgenefusionsystem.PlantMolecularBiologyReporter,1987，5:387405.LiuHK，YangC，WeiZM.EfficientAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofsoybeansusinganembryonictipregenerationsystem.Planta，2004,219:10421049.LodhiMA，YeGN，WeedenNF，ReischBI.AsimpleandefficientmethodforDNAextractionfromgrapevinecultivars，VitisspeciesandAmpelopsis.PlantMolecularBiologyReporter,1994，12:6—13.LuoG.，HepburnA，WidholmJ.Asimpleprocedurefortheexpressionofgenesintransgenicsoybeancallustissue.PlantCellReports,1994，13:632636.McCabeDE，SwainWF，MartinellBJ，ChristouP.Stabletransformationofsoybean(Glycinemax)byparticleacceleration.Bio/Technology，1988，6:923926.OlthoftPM，SomerDA.L-cysteineincreasesAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliveryintosoybeancotyledonarynodecells.PlantCellReports,2001，20:706711.OlhoftPM，FlagelLE，DonovanCM.EfficientsoybeantransformationusinghygromycinBselectioninthecotyledonary_nodemethod.Planta，2003，5:723735.TrickHN，DinkinsRD，SantarnER，DiR，SamoylovV，MeurerCA，WalkerDR，ParrottWA，FinerJJ，CollinsGB.Recentadvancesinsoybeantransformation.PlantTissueCultureandBiotechnology,1997，3:926。權利要求一種快速獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化方法，具體包括以下步驟第一步外植體的製備首先將成熟的大豆種子用氯氣燻蒸消毒2.5-5小時，然後將種子浸泡於含有0.8-1.5mgL-16-BA的無菌水中，28℃黑暗條件下萌發10-18小時之後，去除種皮、子葉、原葉和胚根，剩餘的下胚軸切段作為待轉化的外植體；第二步農桿菌工程菌液的製備及浸染將含有外源基因的農桿菌LBA4404單菌落接種於YEP液體培養基中，28℃、200rpm振蕩培養12小時；然後以1/100的比例擴大培養；待菌液的濃度達到OD600＝0.8後，4℃、4000rpm離心12分鐘收集菌體，並將菌體重懸於液體浸染培養基中至OD600＝0.5，將上步製備好的外植體浸泡於菌液中浸染30分鐘；第三步外植體與農桿菌共培養將第二步經過農桿菌浸染後的外植體用無菌濾紙吸乾表面多餘的菌液，然後切口向下平鋪於表面蓋有無菌濾紙的半固體共培養基上，24℃黑暗培養3天；第四步轉基因愈傷組織的誘導將第三步共培養3天的外植體切口向下轉於轉基因愈傷組織誘導培養基上，25℃、光照強度100μEm-2s-1、16h光/8h暗的光周期條件下培養10天；第五步轉基因愈傷組織的篩選及繼代待轉基因愈傷組織初步形成後，將其轉入轉基因愈傷組織篩選培養基上，兩周後將其從外植體的兩端切下，轉入相同的轉基因愈傷組織篩選培養基上繼續篩選，以後每隔兩周，便將形成的轉基因愈傷組織切成2mm的小塊，轉入新鮮的轉基因愈傷組織篩選培養基上繼代培養一次來保持轉基因愈傷組織的旺盛生長。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，第二步農桿菌浸染外植體使用的液體浸染培養基組分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—1，ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—、鹽酸吡哆醇1.OmgL—、鹽酸硫銨素lOmgL—、蔗糖30gL—、MES0.6gL—、6-BA2.OmgL—、IBAO.2mgL—、0.04gL—1乙醯丁香酮，pH5.4。3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，第三步農桿菌與外植體共培養的半固體共培養基組分如下KN03250mgL—、CaCl22H2015mgL—、MgS047H2025mgL—、(NH4)2S0413.4mgL—、NaH2P04H2015mgL—、KI0.075mgL—、H3B040.3mgL—、MnS044H201.OmgL—1，ZnS047H200.2mgL—、Na2Mo042H200.025mgL—、CoCl26H200.0025mgL—、CuS045H200.0025mgL—、Na2_EDTA3.73mgL—、FeS047H202.78mgL—、肌醇lOOmgL—、煙酸1.OmgL—1，鹽酸吡哆醇1.OmgL—1，鹽酸硫銨素lOmgL—、蔗糖30gL-、MES0.6gL-、6-BA2.OmgL—1，IBAO.2mgL—、L_半胱氨酸0.4gL—、DTT0.15gL—、Na2S2030.25gL—、乙醯丁香酮0.04gL—、瓊脂粉5gL—、pH5.4。4.根據權利要求l所述的方法，其特徵在於，第四步所述的轉基因愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—"+6-BA0.5mgL—"+MES0.6gL—^潮黴素lOmgL—^頭孢黴素400mgL—^瓊脂粉7gL—、pH5.8。5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，第五步所述的轉基因愈傷組織篩選培養基為MS基本培養基+蔗糖30gL—、2，4-D2.OmgL—"+6-BA0.5mgL—"+MES0.6gL—^潮黴素50mgL—^頭孢黴素400mgL—^瓊脂粉7gL—、pH5.8。6.權利要求1所述方法獲得的大豆轉基因愈傷組織在大豆生物技術相關領域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉化體系的建立中的應用。全文摘要一種快速獲得大豆轉基因愈傷組織的轉化方法，利用該方法可以成功解決外源基因難以導入大豆的難題。本發明以大憶豆下胚軸切段為外植體，用含有外源基因的根癌農桿菌浸染後共培養，將共培養後的外植體經過轉基因愈傷組織的誘導和篩選後統計轉基因愈傷組織的轉化效率高達87.7％。該轉化方法的外植體製備簡單、實驗流程短、轉化效率高。該大豆轉基因愈傷組織轉化體系的建立，在大豆生物技術相關領域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大豆基因工程、細胞工程、代謝工程以及大豆遺傳轉化體系的建立等方面有廣泛的應用價值。文檔編號C12N15/84GK101717786SQ20091022911公開日2010年6月2日申請日期2009年12月11日優先權日2009年12月11日發明者劉棟,常大松,王寧寧,石強,龔清秋申請人:南開大學