靈芝孢子粉多糖、生產方法和用途的製作方法

2023-06-27 04:22:21 2

專利名稱：靈芝孢子粉多糖、生產方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術從中藥材中提取的多糖同系混合物，特別是涉及從經微波軟化處理的靈芝孢子粉中提取的靈芝孢子粉多糖LzPS-1、其生產方法和用途。
背景技術：
靈芝是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱，具有扶正固本等功效，被《本經》稱為上品。近年來，隨著靈芝人工栽培技術的發展，規模收集其生殖細胞—孢子的難題得到了解決，這就對其化學成分及藥用價值的研究開發提供了穩定的原料來源。據報導，靈芝孢子具有降血糖作用[章靈華，等.中草藥，1993，24(5)246]，能夠調節肌體免疫功能[章靈華，等.中國免疫學雜誌，1994，10(3)169]，對磷酸肌酸激酶(CPK)在免疫性肌炎大鼠肌肉中的下降及血清中的上升也有拮抗作用[劉耕陶.中國藥理通訊，1993，9(3)4]，臨床試用治療萎縮性肌強直等疑難疾病有較滿意效果。[侯翠英，等.植物學報，1988，30(1)66]。文獻報導，[趙東旭，等.中草藥，1999，30(4)305]，靈芝孢子化學成分有蛋白質、胺基酸類、糖肽類、維生素類、胡蘿蔔素、甾醇類、三萜類、生物鹼類、脂肪酸類、內酯和無機離子等。孢子粉生藥和破壁孢子粉中多糖成分的研究已有報導，而對微波軟化處理過的孢子粉中多糖的研究尚未見報導。

發明內容
本發明要解決的問題是提供一種靈芝孢子粉多糖LzPS-1及其生產方法和用途，一種包含靈芝孢子粉多糖LzPS-1的靈芝孢子粉總糖。
本發明是從經微波軟化處理的靈芝孢子粉中提取獲得的多糖，其結構為
其中n＝2～4，Glcp為吡喃型葡萄糖，α-Glcp(1→為非還原末端葡萄糖，→3)β-Glcp(1→為1，3連接的葡萄糖，→6)β-Glcp(1→為1，6連接的葡萄糖，→3，6)β-Glcp(1→為1，3，6連接的葡萄糖，→4)β-Glcp(1→為1，4連接的葡萄糖。
本發明的靈芝孢子粉多糖或總糖是通過如下方法製備的將經微波軟化處理的靈芝孢子粉用水浸泡，採用有機溶劑沉澱，透析或膜分離，濃縮乾燥獲得總多糖。靈芝孢子粉總糖經分級沉澱，再經離子交換柱和凝膠柱層析純化得靈芝孢子粉多糖純品LzPS-1。
該多糖經完全酸水解、還原、乙醯化和GC分析，結果表明它由葡萄糖一種單糖組成。由HPLC分析測得其分子量範圍為5000～11000。其譜圖數據如下面所述δ(ppm)1H-NMR5.33、5.32為α-Glcp(1→，4.77～4.69為→3)β-Glcp(1→，4.53～4.47為→6)β-Glcp(1→、→3，6)β-Glcp(1→、→4)β-Glcp(1→。13C-NMR103.93～103.80為→3，6)β-Glcp(1→，→4)β-Glcp(1→、→6)β-Glcp(1→，103.54為→3)β-Glcp(1→，100.42為α-Glcp(1→。
從LzPS-1甲基化、還原、乙醯化衍生物的GC-MS圖譜分析得知，LzPS-1含有碎片→3)β-Glcp(1→、→6)β-Glcp(1→、→3，6)β-Glcp(1→、α-Glcp(1→、→4)β-Glcp(1→其摩爾比為9∶2∶2∶2∶1。根據甲基化、NMR等分析，可以推斷LzPS-1具有以下的單元結構
其中n＝2～4本發明的製備方法包括將經微波軟化處理的靈芝孢子粉乾燥後，用水浸泡，採用有機溶劑沉澱，透析或膜分離，濃縮乾燥獲得靈芝孢子粉總糖。靈芝孢子粉總糖經分級沉澱，再經離子交換柱和凝膠柱層析純化可得靈芝孢子粉多糖純品LzPS-1。
具體來說，將經微波軟化處理的靈芝孢子粉，用水浸泡，其中靈芝孢子粉與水浸泡的重量比推薦是靈芝孢子粉∶水＝1∶10～15，尤其推薦用10～12倍重量或更多的水，浸泡24～36小時。所述水推薦為無離子水。浸泡液的pH值推薦保持在5.0～8.0。
過濾，濾液經或不經濃縮，用有機溶劑沉澱後離心。離心所得沉澱用水溶解，推薦用1～5倍重量的水溶解。
離心，上清液透析或膜分離，透析時間推薦為24～72小時，透析用透析膜、透析袋，其孔徑推薦截留分子量在1000以下，尤其推薦截留分子量為500。
濃縮乾燥獲得總糖，其中乾燥或減壓濃縮溫度推薦低於60℃進行，最好採用低溫真空濃縮或冷凍乾燥，例如在30～60℃乾燥或濃縮，壓強推薦控制在0.08～0.1M Pa。
所述靈芝孢子粉總糖加水溶解，其中推薦1～5倍重量的水溶解。然後用乙醇分級沉澱，經DEAE-Cellulose柱層析，用無離子水洗脫後收集，再經Sephadex凝膠柱純化，最後採用冷凍乾燥獲得靈芝孢子多糖純品LzPS-1純度可達到96％以上。
前述的用有機溶劑沉澱，所述有機溶劑推薦與水互溶的有機溶劑，可以是低碳鏈的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推薦丙酮，例如用2～6倍體積的75％～95％的丙酮；沉澱時間推薦為12～72小時。
經生物活性試驗，研究結果表明靈芝孢子粉多糖LzPS-1具有較好的抑制S180肉瘤和Lewis肺癌的效果，並具有增強免疫活性的作用。本發明提取的靈芝孢子粉總糖或純品可用於製備抗腫瘤和增強免疫活性的藥物。
本發明首次從經微波軟化處理的靈芝孢子粉中提取靈芝孢子粉多糖LzPS-1。本發明的提取分離方法簡便，產率高和適於工業化生產。本發明取得到的靈芝孢子粉總糖或純品能夠有效的用於製備抗腫瘤和增強免疫活性的藥物。


圖1是靈芝孢子總糖的HPLC圖。儀器為Shimadzu CLASS-VP V5.032。分析柱為BIOSEP-S4000，洗脫液雙蒸水，流速1mL/min，檢測器RI，主峰含量69％。

圖2是靈芝孢子多糖LzPS-1的HPLC圖。分析柱為BIOSEP-S4000，洗脫液雙蒸水，流速1mL/min，檢測器RI，分析得到單一對稱峰，主峰含量96％。

圖3是HPLC法測定多糖分子量的標準葡聚糖(Sigma)的1gMw與Rt標準曲線圖，線性方程為1gMw＝8.47877-0.33031Rt(r＝-0.9996)。通過線性方程計算表明LzPS-1分子量範圍為5000～11000。
圖4是靈芝孢子多糖LzPS-1的紅外光譜圖。儀器為Bio-Rad FTS-185。890cm-1為β構型的特徵吸收，840cm-1為α構型的特徵吸收，1078cm-1、1039cm-1為吡喃環的特徵吸收。
圖5是靈芝孢子多糖LzPS-1的1H-核磁共振(NMR)圖譜。1H-NMR5.33、5.32為α-Glcp(1→，4.77～4.69為→3)β-Glcp(1→，4.53～4.47為→6)β-Glcp(1→、→3，6)β-Glcp(1→、→4)β-Glcp(1→。
圖6是靈芝孢子多糖LzPS-1的13C-核磁共振(NMR)圖譜。13C-NMR103.93～103.80為→3，6)β-Glcp(1→，→4)β-Glcp(1→、→6)β-Glcp(1→，103.54為→3)β-Glcp(1→，100.42為α-Glcp(1→。
圖7是靈芝孢子多糖LzPS-1的GC-MS圖譜中的GC圖譜。其表明有5個碎片峰。

圖8為Rt＝15.71min的碎片質譜圖，說明含有α-Glcp(1→。
圖9為Rt＝18.76min的碎片質譜圖，說明含有→3)β-Glcp(1→。
圖10為Rt＝18.98min的碎片質譜圖，說明含有→4)β-Glcp(1→。
圖11為Rt＝19.60min的碎片質譜圖，說明含有→6)β-Glcp(1→。
圖12為Rt＝22.57min的碎片質譜圖，說明含有→3，6)β-Glcp(1→。
具體實施例方式
實施例1將經微波軟化處理過的乾燥靈芝孢子粉100g，用1升無離子水室溫浸泡24小時，過濾。濾液50℃減壓濃縮至200～300毫升。然後用95％的乙醇沉澱，乙醇終濃度為85％，沉澱24小時。離心，沉澱用200～300毫升水溶解，離心，無離子水透析48～72小時。50℃減壓濃縮後冷凍乾燥，即獲得靈芝孢子總糖LzPS1.5g，純度為69％。
實施例2將經微波軟化處理過的乾燥靈芝孢子粉100g，用1升無離子水80～90℃水煮1小時，過濾。濾液50℃減壓濃縮至200～300毫升。然後用95％的乙醇沉澱，乙醇終濃度為85％，沉澱24小時。離心，沉澱用200～300毫升水溶解，離心，無離子水透析48～72小時。50℃減壓濃縮後冷凍乾燥，即獲得靈芝孢子總糖LzPS2.1g，純度為67％。
實施例3靈芝孢子總糖LzPS 1g加水150毫升溶解，在攪拌下加入2倍95％的乙醇，過夜，離心後沉澱用50毫升水溶解，經無離子水透析24小時，離心，減壓濃縮，冷凍乾燥後得到第一級分LzPS-a 0.26g純度為68％，上清液加入3倍95％乙醇同上處理得到第二級分LzPS-b 0.20g純度為76％，上清液加入5倍95％乙醇同上處理得到第三級分LzPS-c 0.21g純度為70％，上清液加入7倍95％乙醇同上處理得到第四級分LzPS-d 0.18g純度為88％。
實施例4LzPS-c經DEAE-Cellulose柱層析精製，純度可達96％。具體的分離方法先將玻璃柱(3.5cm×20cm)用0.05mol/LNaHCO3平衡24小時，再稱取LzPS-c50mg，溶於2～3mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱，用無離子水洗脫，流速為10mL/15min，每管收集10mL，大約14～20管為吸收峰。收集後經無離子水透析48小時，減壓濃縮，冷凍乾燥後獲得27mg靈芝孢子多糖純品LzPS-1，純度可達到96％。若需進一步提高純度，可採用Sephadex凝膠柱做進一步純化。
實施例5靈芝孢子多糖的生物活性研究我們對靈芝孢子總多糖送檢生物活性測定，其結果如下1.不同劑量靈芝孢子總多糖(LzPS)對小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效實驗

試驗組與陰性對照組相比***p＜0.012.不同劑量靈芝孢子總多糖(LzPS)對小鼠S180肉瘤(腋皮下接種)療效實驗


試驗組與陰性對照組相比***p＜0.013.不同劑量靈芝孢子總多糖(LzPS)對荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影響

#為試驗組OD均值—效應對照組OD均值靶細胞OD均值＝0.817±0.05與陰性對照組相比***p＜0.014.靈芝孢子總多糖(LzPS)對大鼠降血糖活性實驗

權利要求
1.一種靈芝孢子粉多糖LzPS-1，其結構通式為 其中n＝2～4
2.如權利要求1所述的靈芝孢子粉多糖，其特徵是分子量範圍為5000～11000。
3.如權利要求1所述的靈芝孢子粉多糖，其特徵是由葡萄糖一種單糖組成。
4.如權利要求1所述的靈芝孢子粉多糖的生產方法，其特徵是用於提取多糖的靈芝孢子粉是靈芝孢子粉生藥預先經微波軟化處理。
5.一種包含權利要求1的靈芝孢子粉多糖LzPS-1的靈芝孢子粉總糖，其特徵是通過如下方法製備包括將經微波軟化處理過的乾燥靈芝孢子粉用水浸泡，用有機溶劑沉澱，沉澱用水溶解，上清液經透析或膜分離後，濃縮乾燥獲得總糖。
6.如權利要求1或5所述的靈芝孢子粉多糖的生產方法，其特徵是包括將經微波軟化處理過的乾燥靈芝孢子粉用水浸泡，用有機溶劑沉澱，沉澱用水溶解，上清液經透析或膜分離後，濃縮乾燥獲得總糖。
7.如權利要6所述的靈芝孢子粉多糖的生產方法，其特徵是靈芝孢子粉總糖加水溶解後，經分級沉澱、DEAE-Cellulose柱以及凝膠柱純化可得靈芝孢子粉多糖純品LzPS-1。
8.如權利要求6所述的靈芝孢子粉多糖的生產方法，其特徵是靈芝孢子粉與水浸泡的重量比靈芝孢子粉∶水＝1∶10～15，水浸泡時間24～36小時，浸泡液的pH＝5～8。
9.如權利要求6所述的靈芝孢子粉多糖的生產方法，其特徵是所述的有機溶劑是與水互溶的有機溶劑。
10.如權利要求6所述的靈芝孢子粉多糖的生產方法，其特徵是透析或膜分離採用的膜，其孔徑控制在截留分子量500～1000。
11.如權利要求1所述的靈芝孢子粉多糖，其特徵在於所述的靈芝孢子粉總糖或純品可以製備具有抗腫瘤和增強免疫功能的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種從經微波軟化處理過的中藥靈芝孢子粉中提取的多糖、其生產方法和用途。本發明採用水浸泡獲得靈芝孢子粉水提液，有機溶劑沉澱、沉澱用水溶解，上清液經透析或膜分離，濃縮乾燥獲得總糖，靈芝孢子粉總糖經分級沉澱和柱層析獲得靈芝孢子粉多糖LzPS－1，其化學結構為右式,其中n＝2～4。本發明方法工藝簡單、產率高，適宜工業化生產。經生物活性試驗表明，該靈芝孢子粉多糖無毒副作用，具有抗腫瘤及增強免疫功能的作用。
文檔編號A61P37/04GK1513881SQ0314185
公開日2004年7月21日 申請日期2003年7月25日 優先權日2003年7月25日
發明者呂龍, 田庚元, 王浩, 鄧軍娥, 張勁松, 呂 龍 申請人:中國科學院上海有機化學研究所, 中國科學院金屬研究所