一種富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測方法
2023-07-27 05:57:41 1
專利名稱：一種富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測方法
技術領域：
本發明屬於食品分析領域，涉及一種測定富硒酵母中硒蛋氨酸的高效液相色譜 (HPLC)方法。
背景技術：
功能性酵母指篩選適宜的酵母菌種，通過控制其生長環境，使酵母在生長過程中富集培養基中的某類營養素並經酵母體內代謝轉化為某類人群需要的特殊活性物質。目前國內最成熟的功能性酵母產品為富硒酵母，其選用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，並在生產中向培養基中加入亞硒酸鹽等無機硒製劑，酵母獲取無機硒後將其轉化為主要以硒蛋氨酸形式存在的有機硒(有機硒指與生物大分子結合或參與生物大分子合成的硒)；又因有機硒較無機硒更易被人體吸收利用，副作用更少，富硒酵母因此成為當代富硒營養補充劑生產中最佳的原料。硒蛋氨酸不僅是富硒酵母中含量最豐富的硒化物，含硒量佔酵母總硒含量 60-80%，其同時也是研究證實的生物有效性最高的硒化物。硒蛋氨酸被人體吸收後或先經轉硒途徑轉化為硒半胱氨酸，再經β -裂解酶還原為硒化氫，氫化硒則或作為活性前體參與體內硒蛋白合成，或經生物甲基化反應生成單甲基硒、雙甲基硒及三甲基硒後被排出體外；或當硒蛋氨酸攝入過量時，經Y-裂解酶還原形成活性硒中間體甲基硒醇(CH3SeH)； 或隨機地取代蛋氨酸參與機體蛋白質的合成，其取代頻率依賴於食物中硒蛋氨酸和蛋氨酸的比例；或作為硒的儲存形式在機體攝入硒量減少時以蛋白降解的方式將硒釋放出來，並通過轉硒途徑或Y-裂解反應參與含硒酶的合成。研究認為，因硒元素與硫元素的性質相近，酵母從環境中攝取硒元素後可將其作為硫元素的替代用於蛋氨酸的生物合成進而生成硒蛋氨酸，取代的頻率取決於酵母體內硒的濃度。富硒酵母中硒蛋氨酸的濃度是其質量和營養價值的一個重要反應，這就需要對富硒酵母中的硒蛋氨酸進行分離分析和定量檢測。由於富硒酵母基質複雜且硒蛋氨酸容易被氧化，增加了其中硒蛋氨酸的萃取難度和檢測難度。目前研究上普遍採用HPLC-ICP-MS法、HPLC-ESI-MS/HPLC-ESI-MS/MS法對富硒酵母進行硒的形態分析，對儀器設備條件要求嚴苛，實驗成本昂貴，難以適應實驗室常規檢測要求，方法不易普及。因此，研究並建立一種準確、簡便、經濟、且易於推廣的富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測方法十分必要。引證文獻1.Aleksandra Polatajko, Magdalena Sliwka-Kaszynska, Mihaly Dernovics, Rafal Ruzik, Jorge Ruiz Encinar and Joanna Szpunar. A systematic approach to selenium speciation in selenized yeast[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry,2004,19(1) :114-120.2. H. Chassaigne, C. C. Chery, G. Bordin, A. R. Rodriguez. Development of new analytical methods for selenium speciation in selenium-enriched yeast material[J], Journal of Chromatography A,976(2002),409-422.
3. Susan M. bird，Peter C Uden, Julian F. Tyson, Eric Block， Eric Denoyer.Speciation of Selenoamino Acids and Organoselenium Compounds in Selenium—enriched Yeast Using High-performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, July 1997, Vol. 12(785-788).4.Laura Hinojosa Reyes，Jorge Ruiz Encinar,Juan Manuel Marchante-Gayon, JoseIgnacio Garcia Alonso，Alfredo Sanz-Medel. Selenium bioaccessibility assessment in selenized yeast after 「in vitro，，gastrointestinal digestion using two-dimensional chromatography and mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，1110 (2006) 108-116.5. Zoyne Pedrero, Yolanda Madrid. Novel approaches for selenium speciation in foodstuffs and biological specimens :A review [J]. Analytica Chimica Acta 634(2009)135-152.6.Johann Far，Hugues Preud』 homme，Ryszard Lobinski.Detection and identification of hydrophilic selenium compounds in selenium-rich yeast by size exclusion-microbore normal-phase HPLC with the on-line ICP-MS and electrospray Q-TOF-MS detection[J]. Analytica Chimica Acta 657(2010) 175-190·7. Peter C. Uden, Harriet Totoe Boakye, Chethaka Kahakachchi, Julian F. Tyson. Selective detection and identification of Se containing compounds-review and recent developments[J]. Journal of Chromatography A， 1050(2004)85-93.8. Erik H. Larsen，Marianne Hansen，Teresa Fan，Martin Vahl. Speciation of selenoamino acids， selenonium ions and inorganic selenium by ion exchange HPLC with mass spectrometric detection and its application to yeast and algae [J]. J. Anal. At. Spectrom.，2001，16，1403-1408·9. L Hino josa. Reyes, F. MorenoSanz, P. HerreroEspi lez，J. M. Marchante-Gayon, J.I.Garcia Alonso, A.Sanz-Medel.Biosynthesis of isotopically enriched selenomethionine application to its accurate determination in selenium-enriched yeast by isotope dilution analysis HPLC-ICP-MS[J]. J. Anal. At.Spectrom.，2004，19，1230-1235.10. Corinne Casiot，Veronique Vacchina，Hubert Chassaigne，Joanna Szpunar, Martine Potin-Gautier, Ryszard Lobinski . An approach to the identification of selenium species in yeast extracts using pneumatically-assisted electrospray tandem mass spectrometry[J]. Anal. Commun. ,1999,36,77-80.11. Corinne Casiot，Joanna Szpunar, Ryszard Lobifiski，Martine Potin-Gautier. Sample preparation and HPLC separation approaches to speciation analysis of selenium in yeast by ICP-MS[J]. J. Anal. At. Spectrom.，1999，14， 645-650.12.Erik H. Larsen，Jens Sloth，Marianne Hansena，Sven Moesgaard. Seleniumspeciation and isotope composition in 77Se_enriched yeast using gradient elution HPLC separation and ICP-dynamic reaction cell-MS[J]. J. Anal. At. Spectrom.,2003, 18,310-316.
發明內容
本發明開發了一種富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測方法，該方法採用丹磺醯氯柱前衍生高效液相色譜-螢光法(HPLC-FLD)檢測富硒酵母中硒蛋氨酸，從而為富硒酵母的營養與質量評價提供了一種便利、有效的手段。本方法具有準確、經濟、簡便、靈敏度高、重複性好、 精密度高等特點。本發明提供一種富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測方法，包括(1)採用物理方法破壞富硒酵母的細胞壁，稱取0. Ig富硒酵母粉末於玻璃瓶中，加入 5mL 0.05-1.0% DTT (w/v)0.05mol/L 磷酸緩衝液(pH7. 4)，40mg 鏈黴蛋白酶，於 37°C搖床振搖反應Mh，待酶解液冷卻至室溫，向酶解液中加入蛋白沉澱劑，充分混勻後於 3000rpm離心lOmin，取上清液分析；(2)取200 μ L上清液，加入1. 80mL碳酸鈉緩衝液，ImL 6000mg/L丹磺醯氯溶液，於60°C水浴衍生池，加入0. ImL 20mg/mL鹽酸甲胺溶液結束衍生反應，於避光處靜置 15min ；(3)高效液相色譜對衍生液進行組分分離，螢光檢測器檢測，採用外標法計算硒蛋氨酸的含量衍生後的富硒酵母酶解液經微孔濾膜過濾後進樣測定。所述的高效液相色譜儀採用C18柱Q50mmX 4. 6mm,粒徑5 μ m)，柱溫度30°C ；進樣量10 μ L ；梯度洗脫，洗脫程序如表 1 表1梯度洗脫程序
權利要求
1. 一種富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測方法，其特徵在於(1)採用物理方法破壞富硒酵母的細胞壁，稱取0.Ig富硒酵母粉末於玻璃瓶中，加入 5mL 0. 05mol/L 磷酸緩衝液(pH7. 4)含 0. 05-1. 0% DTT (w/v)，40mg 鏈黴蛋白酶，於 37°C搖床振搖Mh，待酶解液冷卻至室溫，向酶解液中加入蛋白沉澱劑，充分混勻後於3000rpm離心lOmin，取上清液分析；(2)取200μ L上清液，加入1. SmL碳酸鈉緩衝液，ImL 6000mg/L丹磺醯氯衍生溶液，於 60°C水浴衍生濁，加入0. ImL 20mg/mL鹽酸甲胺溶液結束衍生反應，於避光處靜置15min，；(3)高效液相色譜對衍生液進行組分分離，螢光檢測器檢測，採用外標法計算硒蛋氨酸的含量衍生後的富硒酵母酶解液經微孔濾膜過濾後進樣測定。所述的高效液相色譜儀採用C18柱O50mmX4. 6mm，粒徑5 μ m)，柱溫度30°C ；進樣量10 μ L ；梯度洗脫，洗脫程序如表1 表1梯度洗脫程序時間(min)A (%)B (%)流速(mL/min)0.0086.014.01.05.0080.020.01.019.0074.125.91.023.0073.526.51.030.0073.027.01.038.0057.043.01.041.0032.068.01.045.0032.068.01.047.0014.086.01.052.0014.086.01.0注A為IOmM磷酸緩衝液N, N-二甲基甲醯胺，pH6. 55) ；B為乙腈，表中流動相比例均為體積百分比；硒蛋氨酸出峰時間29 31min。
2.如權利要求1所述方法，其特徵在於步驟(1)中，所述細胞物理破壁方法是指液氮冷凍後研缽研磨破壁方法；
3.如權利要求1所述方法，其特徵在於步驟(1)中，所述磷酸緩衝液中DDT的濃度為 0. 05-1. 0%，最佳濃度為0. 1%。
4.如權利要求1所述方法，其特徵在於步驟(1)中，所述蛋白沉澱劑為0.ImL 1. 5g/ mL亞鐵氰化鉀和0. ImL 3g/mL乙酸鋅。
5.如權利要求1所述方法，其特徵在於步驟⑵中，所述衍生條件為加入ImL碳酸鈉緩衝液，ImL 6000mg/L丹磺醯氯衍生溶液，於60°C水浴衍生池。
全文摘要
本發明公開了一種富硒酵母中硒蛋氨酸的檢測方法，屬食品分析技術領域。主要步驟如下(1)酶解富硒酵母中結合型硒蛋氨酸(SeMet)；(2)以丹磺醯氯為衍生劑對硒蛋氨酸進行衍生化處理；(3)高效液相色譜-螢光法對衍生液組分分離與測定，採用外標法計算樣品中硒蛋氨酸的含量。本發明通過對酶解條件及衍生過程的參數進行優化，解決了富硒酵母中硒蛋氨酸的提取及衍生的技術難題，建立了一種檢測富硒酵母中硒蛋氨酸的HPLC-FLD方法，為富硒酵母的質量評價提供了一種準確、簡便、經濟的有效方法。
文檔編號G01N30/02GK102288693SQ20111017771
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者熊正河, 鍾其頂, 韋淑毅, 高洪波 申請人:中國食品發酵工業研究院