噬菌體tsp4dna解旋酶和編碼這種解旋酶的多核苷酸的製作方法
2023-07-16 03:26:36 1
專利名稱：噬菌體tsp4 dna解旋酶和編碼這種解旋酶的多核苷酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及噬菌體TSP4 DNA解旋酶和編碼解旋酶的多核苷酸，屬於生物技術領域。
背景技術：
解旋酶，即分離核酸雙鏈的一類酶，它參與所有生物的大部分的細胞途徑。其催化的核心反應一般是非常保守的。解旋酶在分解核酸雙鏈(DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA)的同時伴隨著核苷三磷酸(NTP，通常是ATP)的水解。解旋酶參與細胞中大多數核酸代謝過程，包括染色體和質粒的複製，轉錄，翻譯，DNA的重組修復以及RNA的加工等。生物體內有許多有解旋酶功能的酶類，原核方面，目前至少12個假定的解旋酶在大腸桿菌的基因組中被鑑定出來了 ；真核方面，釀酒酵母中編碼解旋酶相關蛋白的基因超過基因組的2%，由此可推測解旋酶對於細胞的生存發展起著重要的作用。通過進行蛋白胺基酸序列的比較，可以將解旋酶分五大類，其中最龐大的是I和 II解旋酶超家族(SFI和SFII)，這兩類解旋酶中大多數具有3』-5』極性，其中包含七個 (I，Ia，II，III，IV，V，和VI)所謂的解旋酶特徵基序(motif)；在這兩個超家族中，較保守的AIPase的特徵序列Walker A和B序列是I和II基序，在SFI和SF II蛋白中，其他基序並不是高度保守。SF3解旋酶通常來源於DNA或RNA病毒，僅含有I，II和III三個保守基序，其他解旋酶數目較少，如五Coli中的DnaB-Iike的六聚解旋酶自成一類；第五類解旋酶，蛋白較小，其中包含細菌中的終止轉錄Mio因子。目前對於解旋酶解開DNA雙螺旋的機制還不是很清楚，但是所有的解旋酶還是具有某種共同的特徵，具體表現在解開雙螺旋和在單鏈上進行移動。有報導解旋酶的機制可以分為被動(passive)和主動(aetive)兩種形式。被動形式認為解旋酶與ssDNA是被動的相互作用並且移動方向不確定；而目前通常認為多聚解旋酶採用主動機制進行解旋，它與dsDNA和ssDNA都能結合。現在大家普遍認可的解旋酶作用模型是「active roling」和 "inchworm，，模型。高溫菌噬菌體TSP4為感染高溫菌菌株Thermus TC16的噬菌體，李秋鵬的碩士論文(昆明理工大學，2009)中對該噬菌體基因組進行了初步的解析，並公布了 TSP4的DNA解旋酶的部分序列，但僅有這部分序列，解旋酶結構不完整，無活性。所有生物都有相當數量的基因編碼解旋酶，主要是由於它們在複製、重組、修復、 轉錄、翻譯、剪接、mRNA編輯、染色體重建、轉運和降解時所起的重要功能所致，因此解旋酶也成為了科學界研究的一個熱點。目前發展的一種依賴解旋酶等溫PCR技術，其原理是模擬生物體的DNA複製，在 PCR體系中加入解旋酶，省去了高溫變性的步驟，使PCR反應在一個溫度下進行。因此這種 PCR技術可以回歸在一個水域鍋中進行，使PCR反應不依賴於PCR儀來進行。但是由於目前克隆表達出來的解旋酶大部分是來自常溫微生物，其穩定性和耐熱性不是很好，影響著PCR 的反應效率，因此從高溫微生物中尋找耐熱的解旋酶是解決上述問題的一個重要途徑。棲熱菌作為高溫菌的模式生物，其噬菌體的研究也日益增多，從棲熱菌噬菌體中獲得耐熱的解旋酶在依賴解旋酶等溫PCR技術領域具有重要價值。
發明內容
本發明旨在提供TSP4噬菌體DNA解旋酶，即包含有SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物；該DNA解旋酶分離自高溫噬菌體TSP4，包括其保守性變異多肽、多肽的活性片段。本專利提供了完整的高溫菌噬菌體TSP4解旋酶的基因及其蛋白質序列。本發明中所述多肽、類似物或衍生物的胺基酸序列具有與SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列至少70%的相同性。本發明中所述DNA解旋酶具有SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列。本發明的另一個目的是提供編碼TSP4噬菌體DNA解旋酶的多核苷酸，其包含選自下組中的一種
(a).編碼具有SEQID NO. 1所示胺基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷
酸；
(b).與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；或
(c).與(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。本發明中所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO. 1所示胺基酸序列。本發明中所述多核苷酸序列包含有SEQ ID N0. 2中200-451位的序列或SEQ ID N0. 2中1-1409位的序列。本發明的另一個目的是提供含有編碼DNA解旋酶的多核苷酸的重組載體，其是由前文所述的多核苷酸與質粒、病毒或運載體表達載體構建而成的重組載體。將本發明的解旋酶蛋白序列進行保守區域預測，發現有多個保守結構域。其中 150 360 aa屬於P-Ioop NTPase超家族成員。並且在165 aa、187 aa和沘5 aa附近有保守的ATP結合位點；在165 aa附近Walker A基序，在觀5 aa為Walker B基序。P-Ioop NTPase超家族成員的一個特點就是含有三磷酸腺苷的結合位點，分別叫做Walker A基序(GxxxxGK[S/T]，其中χ代表任何殘基)和Walker B基序(hhhh[D/E], 其中h代表疏水殘基)。其中Walker A基序和Walker B基序分別結合ATP、GTP和Mg2+， 這是解旋酶的重要保守區域分布情況。本發明的有益效果
本發明獲得的DNA解旋酶，通過實驗證明可以作為PCR擴增DNA反應體系的添加物，提高DNA的解鏈效率，以達到提高擴增效率的結果，能實現提高PCR擴增DNA片段的效率，也可用於等溫PCR技術中，在恆溫條件下實現DNA擴增的一種技術，這個反應體系中的的關鍵成分也是DNA解旋酶。
圖1是同位素標記法測解旋酶酶活原理圖。(右圖中「+ 」表示添加解旋酶，「_」表示不添加解旋酶，本圖表示在添加解旋酶的情況下，標記的探針從質粒DNA上脫離)
圖2是解旋酶基因tsp4-h42保守結構域分析示意圖，圖中顯示解旋酶的重要Motif，包括 ATP 結合位點、Walker A 和 Walker B。圖3是解旋酶基因tsp4_h42的克隆片段及相關酶切圖譜。M為Marker， 泳道1為tsp4-h42基因PCR產物，其大小為1224bp，泳道2為pET_23b質粒，泳道3為tsp4-h42-pET-23b質粒，泳道4為pET_23b質粒雙酶切電泳結果，泳道5為 tsp4-h42-pET-23b雙酶切電泳結果。圖4是解旋酶基因tsp4_h42表達蛋白的SDS-PAGE分析檢測電泳圖，其分子量約為46490道爾頓。圖5是重組解旋酶ATP酶活的測定示意圖。1為對照緩衝液+ dsDNA+ ATP + Mg2+ ，2為重組解旋酶+ATP，3為重組解旋酶+ dsDNA + ATP，4為重組解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+，解旋酶同時具有ATP酶的活性，通過定磷法測定磷酸根的釋放，從而證明解旋酶活性的存在，同時證明解旋酶的活力需要Mg2+的激活。圖6是重組解旋酶tsp4_h42的DNA解旋活性檢測圖。(圖中的「 + 」和「_」分別表示「添加」和「不添加」右側對應的反應物)，在重組tsp4-h42解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+ 同時存在的條件下，tsp4-h42解旋酶表現出雙鏈DNA解旋活力。圖7是重組解旋酶tsp4_h42的DNA解旋活性的原子力顯微鏡觀察圖。在重組解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+同時存在的條件下，tsp4-h42解旋酶表現出將雙鏈DNA解旋， 形成複製泡和複製叉這兩種典型的DNA解旋形態。
具體實施例方式實例1 :DNA解旋酶的克隆和表達
一、TSP4噬菌體DNA解旋酶基因的擴增，(以噬菌體TSP4DNA為模板)
(1)TSP4噬菌體DNA解旋酶基因擴增所用引物序列如下 正向引物5，- CATATGACGGACATAAAGCTGGAG -3，
反向引物5，- CTCGAGGGTAAGAGAGAAATCAAAGTT -3，
(2)擴增體系如下
表1 擴增反應體系組分
權利要求
1.噬菌體TSP4DNA解旋酶，其特徵在於它包含有SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.根據權利要求1所述的DNA解旋酶，其特徵在於所述多肽、類似物或衍生物的胺基酸序列具有與SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列至少70%的相同性。
3.根據權利要求1所述的DNA解旋酶，其特徵在於具有SEQID NO. 1所示的胺基酸序列。
4.一種編碼權利要求1所述DNA解旋酶的多核苷酸，其特徵在於所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a).編碼具有SEQID NO. 1所示胺基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b).與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；或(c).與(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。
5.根據權利要求4所述的多核苷酸，其特徵在於所述多核苷酸編碼具有SEQID NO. 1 所示胺基酸序列。
6.根據權利要求4所述的多核苷酸，其特徵在於所述多核苷酸序列包含有SEQID N0. 2中200-451位的序列或SEQ ID N0. 2中1-1409位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特徵在於它是由權利要求4-6中的任一權利要求所述多核苷酸與質粒、病毒或運載體表達載體構建而成的重組載體。
全文摘要
本發明公開了噬菌體TSP4 DNA解旋酶和編碼這種解旋酶的多核苷酸，該DNA解旋酶分離自高溫噬菌體TSP4，此DNA解旋酶是PCR技術中的關鍵DNA解旋酶，可提高PCR技術擴增DNA片段的效率，以達到提高擴增效率的目的。
文檔編號C12R1/92GK102304500SQ20111024799
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者季秀玲, 張琦, 李秋鵬, 林連兵, 薛寒, 魏雲林 申請人:昆明理工大學