脂蛋白相關磷脂酶a2定量檢測試劑盒及製備、操作方法

2023-08-04 16:32:21

脂蛋白相關磷脂酶a2定量檢測試劑盒及製備、操作方法
【專利摘要】本發明涉及一種體外診斷試劑製備領域，屬於生物【技術領域】，具體涉及一種脂蛋白相關磷脂酶A2定量檢測試劑盒及製備、操作方法，包含磁分離試劑、酶反應物、底物溶液、稀釋液、緩衝液、校準品、質控品和清洗液，所述磁分離試劑為含有標記有抗Lp-PLA2單克隆抗體的磁性微球，所述酶反應物為含有鹼性磷酸酶標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體，所述底物溶液為酶促化學發光底物溶液，所述校準品及質控品為含有Lp-PLA2抗原的BSA蛋白溶液。本發明還包括其製備和操作方法。本發明的有益之處在於：具有更高的檢測靈敏度和特異性，並達到了較佳的性能參數；與普通酶聯免疫技術相比，縮短了臨床檢測時間；與化學發光法相比，降低了臨床開展本檢測的成本。
【專利說明】脂蛋白相關磷脂酶A2定量檢測試劑盒及製備、操作方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種體外診斷試劑製備領域，屬於生物【技術領域】，具體涉及一種測定血清中人脂蛋白磷脂酶A2 (LP-PLA2)含量的試劑盒及製備、操作方法。
【背景技術】
[0002]脂蛋白憐脂酶A2 (lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp_PLA2),屬於磷脂酶超家族，含有441個胺基酸殘基，相對分子質量約為45400。Lp-PLA2主要由炎症細胞(如巨噬細胞、淋巴細胞等)分泌，並受炎性介質的調節，目前研究表明Lp-PLA2作用主要是產生二十烷酸類炎性介質，促進血小板聚集、中性粒細胞和單核細胞趨化以及促進白三烯等炎症介質釋放，從而促進血栓形成、炎症反應以及促進動脈粥樣硬化，被視為一種新的炎性反應標誌物，是反映血管炎症的特異性標記物，在促進動脈粥樣硬化以及冠心病和卒中的形成等方面發揮重要作用。外周血中Lp-PLA2濃度增加被視為患心腦血管栓塞疾病(如冠心病、中風)的獨立危險因子。
[0003]臨床檢測人外周血Lp-PLA2濃度能給臨床醫生提供預防和治療心腦血管事件的新靶點，為臨床疾病的早期幹預、臨床應用治療提供新思路新方向。
[0004]目前用於檢測Lp-PLA2的試劑和方法主要是化學發光免疫分析法(CLIA)、酶聯免疫吸附法(ELISA)和膠乳增強比濁法。產品存在操作繁瑣，數據重複性差以及精確度不足等缺點。
[0005]化學發光免疫分析法(CLIA)是利用化學發光物質經催化劑催化和氧化劑氧化，形成一個激發態的中間體，這種激發態的中間體回到穩定基態時，發出光子，利用發光信號測量儀測量光子數，從而間接測定Lp-PLA2的濃度。目前市場上有管式和板式兩種試劑盒，但此法存在吖唳酯、魯米諾、異魯米諾直接標記抗體的發光效率低，標記物不穩定，這種直接標記法屬於瞬間發光型，很難保證測試結果的穩定性和重複性，而且需要特殊的檢測儀器，不便於常規實驗室開展。
`[0006]普通酶聯免疫法(ELISA)自動化程度不高，且受人為因素影響較大，重複性差，整個反應測定時間也很長(至少需要40分鐘)。膠乳增強比濁法是一種靈敏、簡潔、快速的檢測方法，但在脂血的抗幹擾方面效果不佳，而心血管病人有很大一部分都存在血脂濃度高的情況，檢測中容易出現假陽性結果，而且抗凝劑的使用對該方法的影響也比較大。因此迫切需要一種高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，不容易受其他因素幹擾的方法。
[0007]在20世紀90年代開始推廣的磁微粒分離酶聯免疫檢測技術是一種結合免疫磁微粒分離技術與酶聯免疫檢測技術建立的新型酶聯免疫檢測方法。與傳統ELISA方法中抗原、抗體的結合反應是在固相表面進行的不一樣的是，磁微粒分離酶聯免疫檢測方法，抗原、抗體的結合反應在近似液相下進行，克服了普通微孔板酶聯免疫分析(ELISA)分析精密度差、靈敏度差的缺點，反應快速、徹底，具有靈敏度高，特異性高，操作簡便，檢測用時少和不易受脂血等外界因素幹擾的優點。
【發明內容】

[0008]為解決現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種脂蛋白相關磷脂酶A2定量檢測試劑盒及製備、操作方法，採用該試劑盒進行Lp-PLA2檢測具有較高的靈敏度、特異性、操作簡便和更短檢測時間的優點。
[0009]為了實現上述目標，本發明採用如下的技術方案:
[0010]一種人外周血LP-PLA2定量檢測試劑盒，包含磁分離試劑、酶反應物、底物溶液、稀釋液、緩衝液、校準品、質控品和清洗液，所述磁分離試劑為含有標記有抗Lp-PLA2單克隆抗體的磁性微球，所述酶反應物為含有鹼性磷酸酶標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體，所述底物溶液為酶促化學發光底物溶液，所述校準品及質控品為含有Lp-PLA2抗原的BSA蛋白溶液。
[0011]前述的一種人外周血LP-PLA2定量檢測試劑盒，所述稀釋液為含有BSA的溶液。
[0012]前述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒，所述緩衝液為含有Tris的溶液。
[0013]前述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒，所述清洗液為含有TWEEN-20和Proclin-300的緩衝液。
[0014]前述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒，所述的Lp_PLA2試劑盒檢測濃度為 0.1—1600ng/mL。
[0015]一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟:
[0016]步驟一，磁分離試劑的製備
[0017](I)製備 MES 溶液；
[0018](2)取表面含羧基活性基團的磁微粒，加入活化劑，25°C混勻2— 4小時，用MES溶液洗滌後用MES溶液重懸，加入Lp-PLA2抗體，37°C混勻2— 4小時，加入緩衝液於37°C封閉I小時，然後用緩衝液洗滌磁珠，並用緩衝液製成磁分離試劑溶液；
[0019]步驟二，酶反應物的製備
[0020](I)將抗Lp-PLA2抗體溶於PBS溶液中，加入活化劑，20°C放置30—60分鐘後加入甘氨酸終止反應，20°C靜置3— 5分鐘，通過層析柱除去活化劑，收集蛋白峰，在活化後的抗體溶液中加入DTT和PBS溶液，混勻後室溫放置30— 60分鐘，通過層析柱除去游離的DTT，收集蛋白峰；
[0021](2)將鹼性磷酸酶ALP溶於EDTA和Tris-HCl溶液中，加入Traunt試劑，室溫放置40-60分鐘，通過層析柱除去活化劑，收集蛋白峰；
[0022](3)將(I)和(2)的溶液按照抗體與鹼性磷酸酶分子摩爾比1:1混合，室溫放置3-5小時，然後用層析柱分離純化，收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和鹼性磷酸酶，將產物保存在4°C ；
[0023]步驟三，底物溶液的製備
[0024]稱取Tris、NaCl、Na2S03 和 Proclin-300，用純化水溶解，pH 值調整到 7.8—8.2之間，加入發光底物後，過濾收集濾液，用純化水定容，混勻後即得；
[0025]步驟四，稀釋液的製備
[0026]稱取NaCl和BSA，量取Proclin_300加純化水溶解，混合定容，pH值調製7.2—7.6之間，完全溶解後，過濾，貼好標籤於4°C冷庫貯存；
[0027]步驟五，緩衝液的製備[0028]取Tris和NaCl，量取Proclin-300用純化水溶解，混合待完全溶解，調整pH到
7.2-7.6之間，稱取阻斷劑溶於上述溶液中定容，待完全溶解後，過濾即得；
[0029]步驟六，校準品和質控品的製備
[0030]將高純度Lp-PLA2抗原稱重後用稀釋液溶解分裝製成Lp_PLA2的校準品與質控品，校準品濃度分別為在Ing/mL-1600ng/mL之間按濃度差取6個值；
[0031]步驟七，清洗液的製備
[0032]稱取Tris和NaCl，稱取吐溫20加純化水，完全溶解後與Tris和NaCl混合，量取Proclin-300加純化水完全溶解後倒入上述混合液中，用純化水定容，PH調在7.2—7.6之間，過濾即得。
[0033]前述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備方法，步驟二中所述的酶反應物稀釋液配製方法為:Tris、NaCl、疊氮鈉，用純化水溶解，調整pH值至7.5，加入吐溫20、BSA，定容，過濾，於4°C保存。
[0034]一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒的操作方法，其特徵在於，包括以下步驟:
[0035]步驟一，加樣與免疫反應
[0036]在試管中加入Lp-PLA2待測樣本、校準品和質控品，然後依次加入酶反應物、磁分離試劑和緩衝液，用多管混勻器輕輕振蕩I分鐘後，37°C水浴30分鐘；
[0037]步驟二，洗滌
[0038]反應試管放置在磁分離器上，使磁微粒在磁場中沉降2分鐘，緩緩倒轉分離器，倒去上清液，並除去黏在管壁上的液滴；
[0039]步驟三，每支試管加入清洗液，震蕩30秒使磁微粒充分混懸，再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清液；
[0040]步驟四，重複步驟二與步驟三2次；
[0041]步驟五，加底物溶液
[0042]每管加入底物溶液。37°C混勻後I分鐘內檢測；
[0043]步驟六,讀值
[0044]在分光光度計或發光強度檢測儀上讀取吸光度或發光強度值。
[0045]本發明工作原理:磁分離酶聯免疫技術採用磁粒為包被固相，37°C孵育後，磁粒在液相中與免疫複合物反應，磁性微粒上結合的Lp-PLA2抗體與酶標抗體分別與Lp-PLA2抗原的不同表位結合，反應形成雙抗夾心複合物。在外加磁場中直接沉澱，倒去上清液後清洗沉澱的複合物，然後加入酶促化學發光底物。底物在酶作用下被催化裂解發出光子，形成發光反應，使用發光儀檢測反應的發光強度，根據標準曲線即可算出樣品中的Lp-PLA2含量。在試劑盒檢測範圍內，發光強度與樣本中的Lp-PLA2濃度成正比。
[0046]本發明的有益之處在於:本發明Lp-PLA2定量測定試劑盒運用磁微粒分離酶聯免疫技術，提供了 一種接近均相的反應體系，與現有化學發光法以及普通酶聯免疫法相比，本發明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，並達到了較佳的性能參數。與普通酶聯免疫技術相比，運用本試劑盒可以在I小時內完成所有檢測過程，縮短了臨床檢測時間。與化學發光法相比，本試劑盒不需要特殊的全自動化學發光儀器，可以在普通分光光度計或發光檢測儀上開展，極大的降低了臨床開展本檢測的成本。【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1是本發明的Lp-PLA2校準曲線。
【具體實施方式】
[0048]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明。
[0049]Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備實施例一:
[0050]一磁分離試劑(含有標記有抗Lp_PLA2單克隆抗體的磁性微球)的製備
[0051](1)0.lmol/L的ρΗ4.5的MES溶液(2- (N-嗎啉代)乙磺酸)製備:
[0052]稱取MES19.52g, Trisl.56g, NaC14.24g 於 IL 燒杯中，量取 950mL 純化水溶解，調節pH至4.5 ;加純化水定容到1L，採用孔徑0.2 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0053](2)取磁微粒(表面含「羧基C00H-」活性基團)IOOmg用戊二醛活化，25°C混勻2小時，用0.lmol/L MES, pH4.5溶液IOmL洗滌3次，磁微粒用該溶液ImL重懸；加入2mgLp-PLA2抗體，37°C混合均勻2小時；之後加入等體積0.01mol/L PBS5%BSA (pH7.4)緩衝液於37。封閉I小時；最後用IOmL含0.5%BSA溶液的0.0lmol/LPBS (pH7.4)緩衝液洗滌磁珠3次，並用該溶液製成磁分離試劑溶液。
[0054]二酶反應物(含有鹼性磷酸酶標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體)的製備
[0055](I)將 2.5mg 抗 Lp_PLA2 抗體溶於 0.01mol/L PBS PH7.4 溶液中；加入 0.1mol/mL活化劑2-1minothiolane -HCl (2IT)溶液20 μ L，20°C放置30分鐘後加入甘氨酸終止反應；20°C靜置3分鐘；通過SephadeXG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；每毫升活化的抗體溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT (二硫蘇糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液，混勻後，室溫放置30分鐘；通過SephadexG25柱子除去游離的二硫蘇糖醇,收集蛋白峰。
[0056](2)將鹼性磷酸酶 ALP 溶於 2mmol/L EDTA20mmol/L Tris_HCLPH8.0 溶液中，溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt試劑(巰基活化試劑)室溫放置40分鐘,通過SephadexG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；
[0057](3)將(I)和(2)溶液按照抗體與鹼性磷酸酶分子摩爾比1:1混合，室溫放置3小時，然後用Superdex200凝膠層析柱分離純化,收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和鹼性磷酸酶，將產物保存在4°C。
[0058]將上述Lp-PLA2-ALP連接物用酶反應物稀釋液稀釋到l_5ug/mL，使用0.2 μ m過濾器過濾後4°C保存。
[0059]酶反應物稀釋液配置方法:Trisl2.5g，氯化鈉8.5g，疊氮鈉lg，加純化水至600mL，調整pH值至7.5。加吐溫201mL，BSAlOg，加純化水定容至1L。用0.2 μ m過濾器過
濾，於4°C保存。
[0060]三底物溶液(酶促化學發光底物溶液)的製備
[0061]稱取Tris2.4g、NaC16.4g、Na2S030.002g 和 Proclin-3000.2mL 於 IOOOmL 燒杯中；量筒量取700mL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，pH值調整到7.8 ;加入250mL發光底物魯米諾(Luminol-Phos)後,用0.2 μ m濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1L,混勻
後即得。
[0062]四稀釋液的製備
[0063]稱取NaC19.0g和BSA60g於IL的燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.5mL加IOmL純化水溶解，倒入上述燒杯中；最後定容1L，pH值調至7.2 ;待完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾，貼好標籤於4°C冷庫貯存(有效期I年)。
[0064]五緩衝液的製備
[0065]取Trisl.56g 和 NaC14.24g 於 IL 燒杯中，取 0.2mL Proclin-300 於 IOmL 純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL燒杯中；取SOOmL純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調整PH到7.2 ;稱取阻斷劑(優選Mak33) 0.9g溶於上述溶液中；最後定容至1L,完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾即得。
[0066]六校準品與質控品的製備
[0067]將高純度Lp-PLA2抗原稱重後用稀釋液溶解分裝製成Lp_PLA2的校準品與質控品。校準品濃度分別為 1.5ng/mL, 6ng/mL, 24ng/mL, 96ng/mL, 384ng/mL, 1536ng/mL,質控品濃度分別為 6ng/mL, 384ng/mL。
[0068]七清洗液的製備
[0069]稱取Trisl2.5g和NaC1325.5g於IOOOmL燒杯中；稱取5g吐溫20於IOOmL容器中加20mL水使其完全溶解後，倒入燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2mL於盛有IOmL純化水的燒杯中完全溶解後，倒入燒杯中；用量筒量取SOOmL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，溶液PH調至7.2 ;最後用純化水定容IOOOmL,完全溶解後用0.2μπι孔徑的過濾器過濾即得。
[0070]Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備實施例二:
[0071]一磁分離試劑(含有標記有抗Lp_PLA2單克隆抗體的磁性微球)的製備
[0072](1)0.lmol/L的ρΗ4.5的MES溶液(2_ (N-嗎啉代)乙磺酸)製備:
[0073]稱取MES19.52g, Trisl.56g, NaC14.24g 於 IL 燒杯中，量取 950mL 純化水溶解，調節pH至4.5 ;加純化水定容到1L，採用孔徑0.2 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0074](2)取磁微粒(表面含「羧基C00H-」活性基團)IOOmg用戊二醛活化，25°C混勻3小時，用0.lmol/L MES, pH4.5溶液IOmL洗滌3次，磁微粒用該溶液ImL重懸；加入2mgLp-PLA2抗體，37°C混合均勻3小時；之後加入等體積0.01mol/L PBS5%BSA (pH7.4)緩衝液於37。封閉I小時；最後用IOmL含0.5%BSA溶液的0.0lmol/LPBS (pH7.4)緩衝液洗滌磁珠3次，並用該溶液製成磁分離試劑溶液。
[0075]二酶反應物(含有鹼性磷酸酶標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體)的製備
[0076](I)將 2.5mg 抗 Lp_PLA2 抗體溶於 0.01mol/L PBS PH7.4 溶液中；加入 0.1mol/mL活化劑2-1minothiolane -HCl (2IT)溶液20 μ L，20°C放置45分鐘後加入甘氨酸終止反應；20°C靜置4分鐘；通過SephadeXG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；每毫升活化的抗體溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT (二硫蘇糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液，混勻後，室溫放置45分鐘；通過SephadexG25柱子除去游離的二硫蘇糖醇,收集蛋白峰。
[0077](2)將鹼性磷酸酶 ALP 溶於 2mmol/L EDTA20mmol/L Tris_HCLPH8.0 溶液中，溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt試劑(巰基活化試劑)室溫放置50分鐘，通過SephadexG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；
[0078](3 )將(I)和(2 )溶液按照抗體與鹼性磷酸酶分子摩爾比1:1混合，室溫放置4小時，然後用Superdex200凝膠層析柱分離純化,收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和鹼性磷酸酶，將產物保存在4°C。[0079]將上述Lp-PLA2-ALP連接物用酶反應物稀釋液稀釋到l_5ug/mL，使用0.2 μ m過濾器過濾後4°C保存。
[0080]酶反應物稀釋液配置方法:Trisl2.5g，氯化鈉8.5g，疊氮鈉lg，加純化水至600mL，調整pH值至7.5。加吐溫201mL，BSAlOg，加純化水定容至1L。用0.2 μ m過濾器過
濾，於4°C保存。
[0081]三底物溶液(酶促化學發光底物溶液)的製備
[0082]稱取Tris2.4g、NaC16.4g、Na2S030.002g 和 Proclin-3000.2mL 於 IOOOmL 燒杯中；量筒量取700mL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，pH值調整到8.0 ;加入250mL發光底物魯米諾(Luminol-Phos)後,用0.2 μ m濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1L,混勻
後即得。
[0083]四稀釋液的製備
[0084]稱取NaC19.0g和BSA60g於IL的燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.5mL加IOmL純化水溶解，倒入上述燒杯中；最後定容1L，pH值調至7.4 ;待完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾，貼好標籤於4°C冷庫貯存(有效期I年)。
[0085]五緩衝液的製備
[0086]取Trisl.56g 和 NaC14.24g 於 IL 燒杯中，取 0.2mL Proclin-300 於 IOmL 純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL燒杯中；取SOOmL純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調整PH到7.4 ;稱取阻斷劑(優選Mak33) 0.9g溶於上述溶液中；最後定容至1L,完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾即得。
[0087]六校準品與質控品的製備
[0088]將高純度Lp-PLA2抗原稱重後用稀釋液溶解分裝製成Lp_PLA2的校準品與質控品。校準品濃度分別為 Ing/mL, 5ng/mL, 25ng/mL, 125ng/mL, 625ng/mL, 1250ng/mL,質控品濃度分別為 5ng/mL, 525ng/mL。
[0089]七清洗液的製備
[0090]稱取Trisl2.5g和NaC1325.5g於IOOOmL燒杯中；稱取5g吐溫20於IOOmL容器中加20mL水使其完全溶解後，倒入燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2mL於盛有IOmL純化水的燒杯中完全溶解後，倒入燒杯中；用量筒量取SOOmL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，溶液PH調至7.4 ;最後用純化水定容IOOOmL,完全溶解後用0.2μπι孔徑的過濾器過濾即得。
[0091]Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備實施例三:
[0092]一磁分離試劑(含有標記有抗Lp_PLA2單克隆抗體的磁性微球)的製備
[0093](1)0.lmol/L的ρΗ4.5的MES溶液(2_ (N-嗎啉代)乙磺酸)製備:
[0094]稱取MES19.52g, Trisl.56g, NaC14.24g 於 IL 燒杯中，量取 950mL 純化水溶解，調節pH至4.5 ;加純化水定容到1L，採用孔徑0.2 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0095](2)取磁微粒(表面含「羧基C00H-」活性基團)IOOmg用戊二醛活化，25°C混勻4小時，用0.lmol/L MES, pH4.5溶液IOmL洗滌3次，磁微粒用該溶液ImL重懸；加入2mgLp-PLA2抗體，37°C混合均勻4小時；之後加入等體積0.01mol/L PBS5%BSA (pH7.4)緩衝液於37。封閉I小時；最後用IOmL含0.5%BSA溶液的0.0lmol/LPBS (pH7.4)緩衝液洗滌磁珠3次，並用該溶液製成磁分離試劑溶液。[0096]二酶反應物(含有鹼性磷酸酶標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體)的製備
[0097](I)將 2.5mg 抗 Lp_PLA2 抗體溶於 0.01mol/L PBS PH7.4 溶液中；加入 0.1mol/mL活化劑2-1minothiolane -HCl (2IT)溶液20 μ L，20°C放置60分鐘後加入甘氨酸終止反應；20°C靜置5分鐘；通過SephadeXG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；每毫升活化的抗體溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT (二硫蘇糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液，混勻後，室溫放置60分鐘；通過SephadexG25柱子除去游離的二硫蘇糖醇,收集蛋白峰。
[0098](2)將鹼性磷酸酶 ALP 溶於 2mmol/L EDTA20mmol/L Tris_HCLPH8.0 溶液中，溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt試劑(巰基活化試劑)室溫放置60分鐘,通過SephadexG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；
[0099](3 )將(I)和(2 )溶液按照抗體與鹼性磷酸酶分子摩爾比1:1混合，室溫放置5小時，然後用Superdex200凝膠層析柱分離純化,收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和鹼性磷酸酶，將產物保存在4°C。
[0100]將上述LP-PLA2-ALP連接物用酶反應物稀釋液稀釋到l_5ug/mL，使用0.2 μ m過濾器過濾後4°C保存。
[0101]酶反應物稀釋液配置方法:Trisl2.5g，氯化鈉8.5g，疊氮鈉lg，加純化水至600mL，調整pH值至7.5。加吐溫201mL，BSAlOg，加純化水定容至1L。用0.2 μ m過濾器過
濾，於4°C保存。
[0102]三底物溶液(酶促化學發光底物溶液)的製備
[0103]稱取Tris2.4g、NaC16.4g、Na2SO30.002g 和 Proclin-3000.2mL 於 IOOOmL 燒杯中；量筒量取700mL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，pH值調整到8.2 ;加入250mL發光底物魯米諾(Luminol-Phos)後,用0.2 μ m濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1L,混勻
後即得。
[0104]四稀釋液的製備
[0105]稱取NaC19.0g和BSA60g於IL的燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.5mL加IOmL純化水溶解，倒入上述燒杯中；最後定容1L，pH值調至7.6 ;待完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾，貼好標籤於4°C冷庫貯存(有效期I年)。
[0106]五緩衝液的製備
[0107]取Trisl.56g 和 NaC14.24g 於 IL 燒杯中，取 0.2mL Proclin-300 T IOmL 純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL燒杯中；取SOOmL純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調整PH到7.6 ;稱取阻斷劑(優選Mak33) 0.9g溶於上述溶液中；最後定容至1L,完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾即得。
[0108]六校準品與質控品的製備
[0109]將高純度Lp-PLA2抗原稱重後用稀釋液溶解分裝製成Lp_PLA2的校準品與質控品。校準品濃度分別為 2ng/mL, 7ng/mL, 24.5ng/mL, 85.75ng/mL, 300ng/mL, 1050ng/mL,質控品濃度分別為7ng/mL, 1050ng/mL。
[0110]七清洗液的製備
[0111]稱取Trisl2.5g和NaC1325.5g於IOOOmL燒杯中；稱取5g吐溫20於IOOmL容器中加20mL水使其完全溶解後，倒入燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2mL於盛有IOmL純化水的燒杯中完全溶解後，倒入燒杯中；用量筒量取SOOmL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，溶液PH調至7.6 ;最後用純化水定容IOOOmL,完全溶解後用0.2μπι孔徑的過濾器過濾即得。
[0112]Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備實施例四:
[0113]—磁分離試劑(含有標記有抗LP-PLA2單克隆抗體的磁性微球)的製備
[0114](1)0.lmol/L的pH5的MES溶液(2- (N-嗎啉代)乙磺酸)製備:
[0115]稱取MES19.52g, Trisl.56g, NaC14.24g 於 IL 燒杯中，量取 950mL 純化水溶解，pH調節至5.0 ;加純化水定容到1L，採用孔徑0.2μπι濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0116](2)取磁微粒(表面含「羧基COOH-」活性基團)IOOmg用戊二醛活化，25°C混勻3小時，用0.lmol/L MES，pH5溶液IOmL洗滌3次，磁微粒用該溶液ImL重懸；加入2mg Lp-PLA2抗體，37°C混合均勻3小時；之後加入等體積0.01mol/L PBS5%BSA (pH7.4)緩衝液於37°封閉I小時；最後用IOmL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS (ρΗ7.4)緩衝液洗滌磁珠3次，並用該溶液製成磁分離試劑溶液。
[0117]二酶反應物(含有鹼性磷酸酶標記的抗LP-PLA2單克隆抗體)的製備
[0118](I)將 2.5mg 抗 Lp-PLA2 抗體溶於 0.01mol/L PBS PH7.4 溶液中;加入 0.1mol/mL活化劑2-1minothiolane 〃 HCl (2IT)溶液20 μ L，20°C放置30分鐘後加入甘氨酸終止反應；20°C靜置3分鐘；通過SephadeXG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；每毫升活化的抗體溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT (二硫蘇糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液，混勻後，室溫放置30分鐘；通過SephadexG25柱子除去游離的二硫蘇糖醇,收集蛋白峰。
[0119](2)將鹼性磷酸酶 ALP 溶於 2mmol/L EDTA20mmol/L Tris_HCLPH8.0 溶液中，溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt試劑(巰基活化試劑)室溫放置I小時,通過SephadexG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；
[0120](3)將(I)和(2)溶液按照抗體與鹼性磷酸酶分子摩爾比1:1混合，室溫放置3小時，然後用Superdex200凝膠層析柱分離純化,收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和鹼性磷酸酶，將產物保存在4°C。
[0121]將上述Lp-PLA2-ALP連接物用酶反應物稀釋液稀釋到l_5ug/mL，使用0.2 μ m過濾器過濾後4°C保存。
[0122]酶反應物稀釋液配置方法:Trisl2.5g，氯化鈉8.5g，疊氮鈉lg，加純化水至600mL，調整pH值至7.5。加吐溫201mL，BSAlOg，加純化水定容至1L。用0.2 μ m過濾器過
濾，於4°C保存。
[0123]三底物溶液(酶促化學發光底物溶液)的製備
[0124]稱取Tris2.4g、NaC16.4g、Na2S030.002g 和 Proclin-3000.2mL 於 IOOOmL 燒杯中；量筒量取700mL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，pH值調整到7.8 ;加入250mL發光底物魯米諾(Luminol-Phos)後,用0.2 μ m濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1L,混勻
後即得。
[0125]四稀釋液的製備
[0126]稱取NaC19.0g和BSA60g於IL的燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.5mL加IOmL純化水溶解，倒入上述燒杯中；最後定容1L，pH值調至7.2 ;待完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾，貼好標籤於4°C冷庫貯存(有效期I年)。
[0127]五緩衝液的製備[0128]取Trisl.56g 和 NaC14.24g 於 IL 燒杯中，取 0.2mL Proclin-300 於 IOmL 純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL燒杯中；取SOOmL純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調整PH到7.2 ;稱取阻斷劑(優選Mak33) 0.9g溶於上述溶液中；最後定容至1L,完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾即得。
[0129]六校準品與質控品的製備
[0130]將高純度Lp-PLA2抗原稱重後用稀釋液溶解分裝製成Lp_PLA2的校準品與質控品。校準品濃度分別為 Ing/mL, 20ng/mL, 100ng/mL, 200ng/mL, 500ng/mL, 1500ng/mL,質控品濃度分別為 20ng/mL, 500ng/mL。
[0131]七清洗液的製備
[0132]稱取Trisl2.5g和NaC1325.5g於IOOOmL燒杯中；稱取5g吐溫20於IOOmL容器中加20mL水使其完全溶解後，倒入燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2mL於盛有IOmL純化水的燒杯中完全溶解後，倒入燒杯中；用量筒量取SOOmL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，溶液PH調至7.2 ;最後用純化水定容IOOOmL,完全溶解後用0.2 μ m孔徑的過濾器過濾即得。
[0133]Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備實施例五:
[0134]一磁分離試劑(含有標記有抗Lp_PLA2單克隆抗體的磁性微球)的製備
[0135](1)0.lmol/L的pH5的MES溶液(2- (N-嗎啉代)乙磺酸)製備:
[0136]稱取MES19.52g, Trisl.56g, NaC14.24g 於 IL 燒杯中，量取 950mL 純化水溶解，pH調節至5.0 ;加純化水定容到1L，採用孔徑0.2μπι濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0137](2)取磁微粒(表面含「羧基C00H-」活性基團)IOOmg用戊二醛活化，25°C混勻5小時，用0.lmol/L MES，pH5溶液IOmL洗滌3次，磁微粒用該溶液ImL重懸；加入2mg Lp-PLA2抗體，37°C混合均勻5小時；之後加入等體積0.01mol/L PBS5%BSA(pH7.4)緩衝液於37°封閉I小時；最後用IOmL含0.5%BSA溶液的0.01mol/L PBS (ρΗ7.4)緩衝液洗滌磁珠3次，並用該溶液製成磁分離試劑溶液。
[0138]二酶反應物(含有鹼性磷酸酶標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體)的製備
[0139](I)將 2.5mg 抗 Lp-PLA2 抗體溶於 0.01mol/L PBS PH7.4 溶液中;加入 0.1mol/mL活化劑2-1minothiolane -HCl (2IT)溶液20 μ L，20°C放置60分鐘後加入甘氨酸終止反應；20°C靜置5分鐘；通過SephadeXG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；每毫升活化的抗體溶液中加入0.5mL0.05mol/mL DTT (二硫蘇糖醇)0.01mol/L PBS PH7.4溶液，混勻後，室溫放置60分鐘；通過SephadexG25柱子除去游離的二硫蘇糖醇,收集蛋白峰。
[0140](2)將鹼性磷酸酶ALP溶於 2mmol/L EDTA20mmol/L Tris-HCL PH8.0 溶液中，溶度5mg/mL,加入0.10mg/mL Traunt試劑(巰基活化試劑)室溫放置I小時,通過SephadexG25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；
[0141](3 )將(I)和(2 )溶液按照抗體與鹼性磷酸酶分子摩爾比1:1混合，室溫放置4小時，然後用Superdex200凝膠層析柱分離純化,收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和鹼性磷酸酶，將產物保存在4°C。
[0142]將上述Lp-PLA2-ALP連接物用酶反應物稀釋液稀釋到l_5ug/mL，使用0.2 μ m過濾器過濾後4°C保存。
[0143]酶反應物稀釋液配置方法:Trisl2.5g，氯化鈉8.5g，疊氮鈉lg，加純化水至600mL，調整pH值至7.5。加吐溫201mL，BSAlOg，加純化水定容至1L。用0.2 μ m過濾器過
濾，於4°C保存。
[0144]三底物溶液(酶促化學發光底物溶液)的製備
[0145]稱取Tris2.4g、NaC16.4g、Na2S030.002g 和 Proclin-3000.2mL 於 IOOOmL 燒杯中；量筒量取700mL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，pH值調整到8.2 ;加入250mL發光底物魯米諾(Luminol-Phos)後,用0.2 μ m濾器過濾收集濾液,用純化水定容至1L,混勻
後即得。
[0146]四稀釋液的製備
[0147]稱取NaC19.0g和BSA60g於IL的燒杯中；用移液器將Proclin_300量取0.5mL加IOmL純化水溶解，倒入上述燒杯中；最後定容1L，pH值調至7.6 ;待完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾，貼好標籤於4°C冷庫貯存(有效期I年)。
[0148]五緩衝液的製備
[0149]取Trisl.56g 和 NaC14.24g 於 IL 燒杯中，取 0.2mL Proclin-300 於 IOmL 純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL燒杯中；取SOOmL純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調整PH到7.6 ;稱取阻斷劑(優選Mak33) 0.9g溶於上述溶液中；最後定容至1L,完全溶解後，用0.2 μ m濾器過濾即得。
[0150]六校準品與質控品的製備
[0151]將高純度Lp-PLA2抗原稱重後用稀釋液溶解分裝製成Lp_PLA2的校準品與質控品。校準品濃度分別為 10ng/mL, 30ng/mL, 90ng/mL, 270ng/mL, 810ng/mL, 1620ng/mL,質控品濃度分別為 30ng/mL,810ng/mL。
[0152]七清洗液的製備
[0153]稱取Trisl2.5g和NaC1325.5g於IOOOmL燒杯中；稱取5g吐溫20於IOOmL容器中加20mL水使其完全溶解後，倒入燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2mL於盛有IOmL純化水的燒杯中完全溶解後，倒入燒杯中；用量筒量取SOOmL純化水於燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，溶液PH調至7.6 ;最後用純化水定容IOOOmL,完全溶解後用0.2 μ m孔徑的過濾器過濾即得。
[0154]將本發明所得的Lp-PLA2定量檢測試劑盒進行如下操作:
[0155]步驟一，加樣與免疫反應
[0156]在試管中加入45 μ I LPPLA2待測樣本、校準品和質控品，然後依次加入60 μ L酶反應物、30 μ L磁分離試劑和60 μ L緩衝液。用多管混勻器輕輕振蕩I分鐘後，37°C水浴30分鐘；
[0157]步驟二，洗滌
[0158]反應試管放置在磁分離器上(所有試管都要求與磁分離器接觸)，使磁微粒在磁場中沉降2分鐘，緩緩倒轉分離器，倒去上清液，並除去黏在管壁上的液滴。
[0159]步驟三，每支試管加入200 μ L清洗液，震蕩30秒使磁微粒充分混懸，再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清液。
[0160]步驟四，重複步驟二和步驟三2次；
[0161]步驟五，加底物溶液
[0162]每管加入200 μ L底物溶液。37°C混勻後I分鐘內檢測；[0163]步驟六，讀值
[0164]在分光光度計或發光強度檢測儀上讀取吸光度或發光強度值。
[0165]檢測結果:
[0166]以本試劑實施例1為例製備出脂蛋白相關磷脂酶A2定量試劑盒，並以此檢測200例盲樣標本，得到以下試劑盒檢測結果:
[0167]分析靈敏度:對20次零校準品的測定，取其2倍的平均偏差，其在標準曲線上對應的濃度即為分析靈敏度；本發明試劑盒分析靈敏度為0.1ng/mL。
[0168]精密性:同時評價批內和批間不精密度:每天做2個批次的測試，每批測試時，對同一樣品作雙份測量，共做20天。評估結束時共有40對，即80個測試結果。從40批次測量中雙份結果的差值求出批內精密度。從所有80個數據計算出批間精密度。
[0169]本發明試劑盒:批內精密度CV% ( 10.0% ;批間精密度CV% ( 15.0% ；
[0170]線性範圍:取本試劑實施例1，每點重複檢測3次，得出本試劑盒標準曲線為:y=2.9931X-31.509,線性相關R2=0.9997。本發明試劑盒線性範圍為0.l_3500ng/mL。圖1為Lp-PLA2校準曲線。
[0171]又以本試劑盒與市售酶聯免疫法試劑盒分別檢測同一批40例標本，得出以下值，顯示出了兩者良好的相關性，見表1:
[0172]表140個樣本ELIS A法檢測結果與本發明的檢測結果對比
【權利要求】
1.一種人外周血LP-PLA2定量檢測試劑盒，其特徵在於，包含磁分離試劑、酶反應物、底物溶液、稀釋液、緩衝液、校準品、質控品和清洗液，所述磁分離試劑為含有標記有抗Lp-PLA2單克隆抗體的磁性微球，所述酶反應物為含有鹼性磷酸酶標記的抗Lp-PLA2單克隆抗體，所述底物溶液為酶促化學發光底物溶液，所述校準品及質控品為含有Lp-PLA2抗原的BSA蛋白溶液。
2.根據權利要求1所述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述稀釋液為含有BSA的溶液。
3.根據權利要求1所述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述緩衝液為含有Tris的溶液。
4.根據權利要求1所述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述清洗液為含有TWEEN-20和Proclin-300的緩衝液。
5.根據權利要求1所述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述的Lp-PLA2試劑盒檢測濃度為0.1 — 1600ng/mL。
6.一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟一，磁分離試劑的製備 製備MES溶液 稱取MES、Tris和NaCl，用純化水溶解，調pH值至4.5-5之間，定容，過濾取表面含羧基活性基團的磁微粒，用戊二醛活化，25°C混勻2-4小時，用MES溶液洗滌，磁微粒用MES溶液重懸，加入Lp-PLA2抗體，37°C混勻2_4小時，加入緩衝液於37°C封閉I小時，然後用緩衝液洗滌磁珠，並用緩衝液製成磁分離試劑溶液； 步驟二，酶反應物的 製備 將抗Lp-PLA2抗體溶於PBS溶液中，加入活化劑，20°C放置30-60分鐘後加入甘氨酸終止反應，20°C靜置3-5分鐘，通過層析柱除去活化劑，收集蛋白峰，在活化後的抗體溶液中加入DTT和PBS溶液，混勻後室溫放置30-60分鐘，通過層析柱除去游離的DTT，收集蛋白峰； 將鹼性磷酸酶ALP溶於EDTA和Tris-HCl溶液中，加入Traunt試劑，室溫放置40-60分鐘，通過層析柱除去活化劑，收集蛋白峰； 將(I)和(2)的溶液按照抗體與鹼性磷酸酶分子摩爾比1:1混合，室溫放置3-5小時，然後用層析柱分離純化，收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和鹼性磷酸酶，將產物LP-PLA2-ALP連接物保存在4°C ； 將LP-PLA2-ALP連接物用酶反應物稀釋液稀釋，過濾後4°C保存； 步驟三，底物溶液的製備 稱取Tris ,NaCl、Na2S03和Proclin-300，用純化水溶解，pH值調整到7.8-8.2之間，加入發光底物後，過濾收集濾液，用純化水定容，混勻後即得； 步驟四，稀釋液的製備 稱取NaCl和BSA，量取Proclin-300加純化水溶解，混合定容，pH值調製7.2-7.6之間，完全溶解後，過濾，貼好標籤於4°C冷庫貯存； 步驟五，緩衝液的製備 取Tris和NaCl，量取Proclin-300用純化水溶解，混合待完全溶解，調整pH到7.2-7.6之間，稱取阻斷劑溶於上述溶液中，定容，待完全溶解後，過濾即得； 步驟六，校準品和質控品的製備 將高純度Lp-PLA2抗原稱重後用稀釋液溶解分裝製成Lp-PLA2的校準品與質控品，校準品濃度分別為在Ing/mL-1600ng/mL之間按濃度差取6個值； 步驟七，清洗液的製備 稱取Tris和NaCl，稱取吐溫20加純化水，完全溶解後與Tris和NaCl混合，量取Proclin-300加純化水完全溶解後倒入上述混合液中，用純化水定容，pH調在7.2-7.6之間，過濾即得。
7.根據權利要求6所述的一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於，步驟二中所述的酶反應物稀釋液配製方法為:Tris、NaCl、疊氮鈉，用純化水溶解，調整pH值至7.5，加入吐溫20、BSA,定容，過濾，於4°C保存。
8.一種人外周血Lp-PLA2定量檢測試劑盒的操作方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟一,加樣與免疫反應 在試管中加入Lp-PLA2待測樣本、校準品和質控品，然後依次加入酶反應物、磁分離試劑和緩衝液，用多管混勻器輕輕振蕩1分鐘後，37°C水浴30分鐘； 步驟二，洗滌 反應試管放置在磁分離器上，使磁微粒在磁場中沉降2分鐘，緩緩倒轉分離器，倒去上清液，並除去黏在管壁上的液滴； 步驟三，每支試管加入清洗液，震蕩30秒使磁微粒充分混懸，再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清液； 步驟四，重複步驟二與步驟三2次； 步驟五，加底物溶液 每管加入底物溶液； 37°C混勻後1分鐘內檢測； 步驟六，讀值 在分光光度計或發光強度檢測儀上讀取吸光度或發光強度值。
【文檔編號】G01N33/531GK103698535SQ201310695303
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】陸上蘇 申請人:陸上蘇