一種中高密度生物晶片原位合成儀的製作方法

2023-08-04 19:06:11

專利名稱：一種中高密度生物晶片原位合成儀的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種中高密度生物晶片原位合成儀，屬於生物晶片制 備技術領域。
背景技術：
DNA晶片技術是90年代興起的一種對成百上千甚至上萬個基因 同時進行檢測的新技術，具有高通量和並行性的特點，在基因表達譜 分析、檢測基因突變和多態性分析、藥物篩選以及序列分析等諸多領 域呈現出廣泛的應用前景。隨著研究的不斷深入和技術的不斷發展， 生物晶片必將在生命科學研究領域發揮其非凡的作用。
目前，基因晶片的製備技術主要有原位合成法和直接點樣法兩 種。點樣法是指運用各種方法(列印、噴印等)將預先合成的DNA 探針或cDNA探針固定到玻片或其它固體載片上形成微探針陣列。與 原位合成法相比，點樣法較簡單，只需將預先製備好的寡核苷酸或 cDNA等樣品通過自動點樣裝置點於經特殊處理的玻璃片或其它材 料上即可。點樣法又分為列印和噴印兩種方法其中列印法的優點是 探針密度相對較高，通常可列印2500個探針/cm2，缺點是定量準確 性及重現性不好，列印針容易堵塞，且使用壽命有限。噴印法的優點 是定量準確，重現性好，使用壽命長，其缺點是噴印的斑點大，因此 探針密度低，通常只有400位點/cm2。無論是採用列印或者噴印的方 法，都需要事先大量地製備純化、量化、分類PCR產物。採用點樣法製備密度基因晶片的過程中，當探針數量較大時，所需探針成本也
隨著增加。例如，當20目的探針數量達到1000條時，探針成本即在 100， 000元人民幣左右。因而當探針數目較多時，這一技術無法與 原位合成技術相比擬，此外還有各種客觀因素導致探針密度不均勻因 而雜交信號不均勻的缺點。
原位合成是按照預先設計的鹼基序列直接將探針合成在基片上， 主要有光蝕刻原位合成和噴印原位合成兩種，目前只有美國 Affymetrix公司擁有的光脫保護原位合成製備專利技術已實現基因芯 片的規模化生產，該技術主要不足之處是特有的光脫保護方法需要制 作一系列特定的光掩模，並且對不同的用戶需求和不同的基因晶片必 須重新設計光掩，成本相當高，不適合小批量需求；此外，光蝕刻法 每步合成率較低， 一般為95%左右，合成30 nt產率僅20 %，還需 要特殊的光脫保護試劑。
原位噴印合成技術採用的化學原理與傳統的DNA固相合成一
致，因此無需特殊製備的化學試劑，其原理與噴墨列印類似，不過芯
片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種鹼基等液體而不是碳粉。
噴印頭可在整個晶片上移動並根據晶片上不同位點探針的序列需要
將特定的鹼基噴印在晶片上特定位置。噴印法每步偶聯率達99 %以
上，合成30nt產率可達74。/。，從這個意義上說噴印法特異性應比光
刻法高。此外，它並不需特殊的合成試劑。
另外，國內東南大學吳健雄實驗室經過數年的努力，開發了分 子印章接觸壓印DNA微陣列原位合成技術，完全採用現有最成熟的 DNA合成路線，可望降低成本。但美中不足的是在掩模設計上和Affymetrix公司擁有的光脫保護原位合成製備專利技術一樣，針對 不同的用戶需求和不同的基因晶片，必須重新設計掩模。
本課題組提出和研究了活版印刷原位合成中低密度基因晶片新 方法，可望避免現有原位合成方法中煩瑣而昂貴的掩模製備過程及點 樣法中昂貴的探針修飾或標記成本，針對不同用戶需求只需重新排列 印刷模版即可，易實現自動控制和精確定位，合成速度快，在較短時 間內就可快速印刷合成出探針分布均勻的大批量基因晶片。但主要存 在的缺陷就是模版的設計需要手動實現，過程繁瑣。尤其是當晶片密 度較高時，手動排版不僅所需時間長，而且非常容易出錯。在上述基 礎之上，課題組研究了一種微流體自驅動原位合成壓印生物晶片新方 法。

發明內容
本發明其目的是針對現有技術的缺點而研究開發的一套製備生 物晶片的儀器設備。利用該設備可以實現自動化、規模化原位合成生 產廉價、可靠、質量高的中高密度基因晶片和多肽晶片。
實現上述發明的技術方案是用於製備生物晶片的儀器設備整體 上由生物晶片合成平臺和三維直角機器人系統兩部分組成，生物晶片 合成平臺嵌入固定在三維直角機器人系統的底部。其中三維直角機器 人系統由直線電機伺服系統和機械操作手構成，而直線電機伺服系統
具體由直線電機X-Y平臺、伺服驅動器、PC機、伺服運動控制卡構 成。機械操作手安裝固定於直線電機X-Y平臺的定位頭上，由小型 精密氣動滑臺和真空吸盤組合而成，實現抓取玻片和壓印的功能。生物晶片合成平臺主要由底座以及其上設計加工的四個構造相同的微 流體自驅動裝置和多功能噴淋池以及自動加液裝置構成。微流體自驅 動裝置通過一個通道或細管與自動加液裝置相連。 所述技術方案中
伺服運動控制卡插入PC機的基於PCI總線的插槽中，構成主從 式控制結構，PC計算機負責人機界面的管理和控制系統的實時監控， 伺服運動控制卡則具體完成運動控制的所有細節，包括運動脈衝數的 電機旋轉方向信號的輸出，自動升降速處理，原點和限位信號的檢測
等。整個控制系統的開發可以在Visual Basic或者Visual C++開發環
境中完成。
每個微流體自驅動裝置由鹼基液體存儲池，池蓋和具有微納米通 道的纖維管或者其他金屬管組成，纖維管穿過具有一定厚度的池蓋而 垂直固定在底座上，其下端深入存儲池而接近其底面，其上端露出底 座上層表面一定距離。四個鹼基液體存儲池分別用來存儲A， T， C， G四種不同的單體液體。
所述多功能噴淋池上設計有3排噴淋孔，每排均採用由下而上噴 淋的方式。為保證反應液體能夠充分接觸整個玻片下表面，採取多個 並排噴液孔，即多功能噴淋池的表面有3排類似的噴淋裝置，分別用 於清洗、氧化和脫保護反應。
自動加液裝置由儲液池，電磁藥液閥，加液瓶，加液管和加壓氣 管構成。加液管穿過加液瓶的密封口而深入到瓶內，其中加壓氣管與 高壓氬氣相通以便需要時驅動液體到儲液池。加液瓶通過一定口徑的加液管與儲液池相連，藥液電磁閥控制加液管的導通和截止，導通時 即向儲液池壓入鹼基液體。
與其他相關技術和設備製備生物晶片相比較，採用本發明製備生 物晶片有以下幾個方面的明顯優點
1、 採用本發明的儀器製備基因晶片，避免了現有原位合成方法 中煩瑣而昂貴的掩模製作過程以及點樣法中探針的修飾和標記成本。
2、 真空微孔纖維管的毛細效應帶來了類似於液相的壓印反應環 境，則賦予了合成探針極高的偶聯效率和探針位點的信號均勻性，從 而確保了獲取生物信息的準確性。
3、 也避免了活版印刷原位合成基因晶片技術中模板的設計和排 版過程。無需對模板進行手工或者額外的機械手進行排版，只需在計 算機接口程序中輸入一定的探針布局即可。
4、 無需提前製備大量製備，純化，量化，分類PCR產物，因而 晶片製備工序得到簡化。同時，採用傳統的DNA固相合成方法，不 需要購買特殊的專利試劑，晶片的製備成本得以降低。


圖1是本發明的整體結構示意圖。
圖2是本發明生物晶片合成平臺以及三維直角機器人系統的俯視圖。 圖3是本發明生物晶片合成平臺以及三維直角機器人系統的主視圖。 圖4是本發明生物晶片合成平臺以及三維直角機器人系統的左視圖。 圖5是本發明中多功能噴淋池的原理和結構示意圖。 圖6是本發明中自動加液裝置和微流體自驅動體的結構示意圖。圖7是本發明生物晶片合成原理的流程圖。
圖8是本發明生物芯循環壓印的示意圖。
下面結合附圖和實施方式對本發明作進一步說明。
具體實施例方式
見圖1至4，本發明主要由生物晶片合成平臺和三維直角機器人系統 兩部分組成，生物晶片合成平臺嵌入固定在三維直角機器人系統的底 部。其中三維直角機器人系統由直線電機伺服系統和機械操作手14 構成。直線電機伺服系統具體由直線電機X-Y平臺15、伺服驅動器 39、 PC機25、伺服運動控制卡26構成，伺服運動控制卡26插入PC 機主板上的PCI插槽，伺服驅動器39通過專用的數據傳輸線27與 PC機上的COM串口相連，而伺服驅動器39通過另一條傳輸線與直 線電機X-Y平臺上專用接口相連，這樣就實現通過PC終端操作實現 晶片合成的定位過程。機械操作手14安裝固定於直線電機X-Y平臺 15的定位頭16上，由小型精密氣動滑臺60和真空吸盤13組合而成， 實現抓取玻片12和壓印的功能。見圖1至3，在生物晶片合成平臺 的底座1中間設計加工了四個構造相同的微流體自驅動裝置6， 7， 8， 9，它們底部的液體存儲池分別與位於底座左下方的自動加液裝置2， 3， 4， 5通過加液管相連，自動加液裝置2， 3， 4， 5瓶中分別盛有 A,T,C,G四種鹼基單體液。在微流體自驅動裝置的右側設有兩個矩形 槽，分別是取片槽10和放片槽11，取片槽10用來放置經過表面處 理的載玻片，而放片槽則用來放置合成後的生物晶片。
所述自動加液裝置和微流體自驅動裝置的具體結構如圖6所示，自動加液裝置由儲液池34，加液瓶37，微型液位計45，電磁藥液閥 48，加液管46和通氣管51構成。加液管46 —端經過加液瓶37的密 封蓋伸入到加液瓶底端，而與高壓氬氣相接的通氣管51 —端則位於 加液瓶37上端，位於瓶內液面之上。加液管另一端則與微流體自驅 動裝置的儲液池相連，在加液管46的中間安裝一個電磁藥液闊48。 微型液位計45安裝於儲液池34的邊上，根據儲池液面的高低發出信 號來控制電磁藥液閥的開關。具體工作過程如下所述
當儲液池液面低於下限hl時，微型液位計46檢測到一個信號， 通過接口電路讀入PC機，而PC機根據這一信號執行程序控制給電 磁藥液閥48，使之處於導通狀態，瓶內的鹼基液體在高壓氬氣的作 用下通過加液管46自動流向儲液池34;當儲液池內液面達到上限h2 時，微型液位計46檢測到信號並發送給電磁藥液閥48，使其截止， 加液即停止。這樣，通過自動加液裝置，能保證儲液池中始終保持一 定量的鹼基液體，從而確保纖維管頂端有充分的鹼基液體用於晶片壓 印。
微流體自驅動裝置6通過加液管與自動加液裝置2相連。具有微 納米通道的纖維管35被牢固地夾裝在微流體自驅動裝置的池蓋47 上，其底端浸在存儲池34的鹼基液體中，頂端露出一定距離。存儲 池中的液體由於纖維管35的毛細效應而源源不斷地傳輸到纖維管頂 端，而且均勻而不富餘。當玻璃載片下表面與其壓印接觸時，鹼基液 體就黏附其上，經過多次循環壓印後則形成一些列微點陣列。
在生物晶片合成平臺的中央設計加工了兩個多功能噴淋池，分別是清洗池22，氧化和脫保護池23，它們中間分別加工了並排的清洗 噴淋孔21，氧化噴淋孔40和脫保護噴淋孔41，而在每個多功能的反 應池右端則是廢液池42，噴淋到載玻片的液體下落後流入廢液池， 通過廢液池底部的三個小孔排出。其中並排噴淋孔21， 40， 41分別 經過塑料管與瓶子19， 18， 17相通，每個瓶子分別裝有一定量的清 洗液，氧化液和脫保護液。 下面對多功能噴淋池的功能實現作進一步說明
見圖5，玻璃載片12壓印完一層後，通過機械手的控制運動到 多功能噴淋池上方，使PC機25控制的電磁閥28導通，氮氣瓶33 中的高壓氮氣則通過管子進入裝清洗液的瓶子17形成高壓，瓶中的 清洗液就通過另一個管子被壓入多功能噴淋池底部的緩衝池21，液 體最終經噴淋孔30均勻而充分地噴淋玻璃載片12。控制玻璃載片使 其朝著與並排噴淋孔所在方向垂直移動，直到玻片下表面完全被噴 淋，才關閉電磁閥28。用同樣的方式可實現晶片的清洗、氧化和脫 保護反應，只是在噴淋孔出來的液體種類不同而已。
下面結合晶片原位合成的原理對儀器的整個工作過程進行說
明
用戶通過計算機執行己經編寫好的應用程式操作晶片合成過程， 初始化完成後，在用戶接口程序中輸入所要合成的鹼基序列後，即可 開始晶片的合成。晶片合成原理和流程見圖7和圖8，這裡以4X4 微陣列晶片加以說明，現實中晶片合成的密度完全取決於三維直角機 器人系統的定位精度和微流體自驅動裝置中纖維管的粗細程度。機械操作手14運動到取片槽上方，向下抓取載玻片。然後開始
壓印，先後順序依次是A,T,C,G:載玻片12運動到微流體自驅動裝置 6上方，然後根據用戶輸入的微陣列鹼基序列，先向下壓印一系列A 點，得到的結果如圖8中a所示；然後定位平移到微流體自驅動裝置 7上方，壓印鹼基陣列T，得到的結果如圖8中b所示；接著運動到 微流體自驅動裝置8上方，壓印鹼基陣列C，壓印後的結果如圖8中 c所示，最後運動到上方，壓印鹼基陣列T，這樣完成晶片的第一層 壓印，最後結果如圖8中d所示。壓印完一層後，將載玻片移動到多 功能噴淋池，進行清洗一氧化一清洗一脫保護一清洗的循環噴淋，接 著開始晶片的第二層壓印，完成相同位點上鹼基之間的偶聯反應。循 環這個過程，直到完成用戶所要求的探針長度(晶片壓印的層數)為 止，最終得到所需的基因晶片，最後將合成完的晶片放片槽中。
權利要求
1、一種中高密度生物晶片原位合成儀，其特徵在於該儀器由三維直角機器人系統和生物晶片合成平臺組成，所述三維直角機器人系統由直線電機伺服系統和機械手構成，所述直線電機伺服系統具體由直線電機X-Y平臺、伺服驅動器、PC機、伺服運動控制卡構成。所述生物晶片合成平臺嵌入固定在三維直角機器人系統的底座上。所述生物晶片合成平臺包括基座、四個構造相同的微流體自驅動裝置、多功能噴淋池以及自動加液裝置，微流體自驅動裝置通過加液管自動加液裝置相連。
2、 根據權利要求1所述的生物晶片原位合成的儀器設備，其特徵在於所述伺服運動控制卡插入PC機主板上的PCI插槽，所述伺服驅動器通過專用的數據傳輸線與PC機上的COM串口相連，而伺服驅 動器通過另一條傳輸線與直線電機X-Y平臺上專用接口相連，這樣 就實現通過PC終端操作實現晶片合成的定位過程。
3、 根據權利要求1所述的生物晶片原位合成的儀器設備，其特徵在於所述機械操作手由小型精密氣動滑臺和真空吸盤組合而成，小型精密氣動滑臺的升降運動和真空洗盤的吸取動作通過若干個電磁閥 開關加以控制。
4、 根據權利要求1所述的生物晶片原位合成的儀器設備，其特徵在於所述生物晶片合成平臺上設有四個構造相同的微流體自驅動裝 置，每個微流體字驅動裝置由儲液池、池蓋和具有微納米通道的纖維 管或者其他金屬管組成。
5、 根據權利要求4所述的微流體自驅動裝置，其特徵在於所述纖維管穿過具有一定厚度的池蓋而垂直固定在底座上，其下端深入存儲 池而接近其底面，其上端露出底座上層表面一定距離。所述鹼基液體存儲池分別用來存儲A， T， C， G四種不同的單體液體。
6、 根據權利要求1所述的生物晶片原位合成的儀器設備，其特徵在 於所述多功能噴淋池上設計有3種不同的噴淋 L，每種均採用由下 而上噴淋的方式。為保證反應液體能夠充分接觸整個玻片下表面，採 取多個並排噴液孔，即多功能噴淋池的表面有3排類似的噴淋裝置， 分別用於清洗、氧化和脫保護反應。
7、 根據權利要求1所述的生物晶片原位合成的儀器設備，其特徵在於所述生物晶片合成平臺上還設有四個密封的玻璃瓶，分別通過塑料管與廢液回收池以及多功能噴淋池中的清洗池、氧化池、脫保護池 相連。
8、 根據權利要求1所述的生物晶片原位合成的儀器設備，其特徵在 於所述自動加液裝置由儲液池，電磁藥液閥，加液瓶，加液管，微 型液位計和以及通氣管構成。加液管一端經過加液瓶的密封蓋伸入到 加液瓶底端，而與高壓氬氣相接的通氣管一端則位於加液瓶上端，位 於瓶內液面之上。加液管另一端則與微流體自驅動裝置的儲液池相 連，在加液管的中間安裝一個電磁藥液閥。微型液位計安裝於儲液池 的邊上，根據儲池液面的高低發出信號來控制電磁藥液閥的開關。
全文摘要
一種中高密度生物晶片原位合成儀，屬於生物晶片製備技術領域。儀器設備整體上由生物晶片合成平臺和三維直角機器人系統兩部分組成，生物晶片合成平臺嵌入固定在三維直角機器人系統的底部。其中三維直角機器人系統由直線電機伺服系統和機械操作手構成，而直線電機伺服系統具體由直線電機X-Y平臺、伺服驅動器、PC機、伺服運動控制卡構成。機械操作手安裝於直線電機X-Y平臺的定位頭上，由小型精密氣動滑臺和真空吸盤組合而成，實現抓取玻片和壓印的功能。生物晶片合成平臺由底座以及其上設計加工的四個構造相同的微流體自驅動裝置和多功能噴淋池以及自動加液裝置構成，微流體自驅動裝置通過加液管與自動加液裝置相連。
文檔編號C12Q1/68GK101280270SQ200810031129
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月23日 優先權日2008年4月23日
發明者何建迪, 徐訓蒙, 湯建新, 王許南 申請人:湯建新;王許南;何建迪;徐訓蒙