採用超順磁性矽殼納米顆粒靜電吸附分離蛋白質的方法

2023-08-04 22:35:56

專利名稱：採用超順磁性矽殼納米顆粒靜電吸附分離蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及納米材料的應用領域和納米生物學領域，尤其涉及到超順磁性矽殼納米顆粒在生物醫學研究中對蛋白質靜電吸附分離技術的應用開發。
背景技術：
近年來，隨著人類基因組計劃的完成，解析龐大的人類基因組信息，開展蛋白質組學的研究，獲取蛋白質表達水平上的數據倍受研究者的關注與重視。作為蛋白質組學研究的前提和基礎，蛋白質的分離純化具有非常重要的生物學意義。目前人們利用蛋白質分子大小不同建立了凝膠過濾、膠體電泳、超濾等方法，利用蛋白質分子所帶電荷不同發展了離子交換層析、凝膠電泳、等電點沉澱等方法，利用蛋白質分子極性不同發展了反相色譜、疏水色譜、鹽析等方法，利用蛋白質分子的親和作用發展了親和層析等方法。這些方法用於蛋白質分離時均存在一定的不足之處，例如凝膠過濾法所用凝膠一般需要做複雜的預處理，要求有一定的操作技術，保存也要求有真空低溫的條件以防止凝膠變性；離子交換層析法的離子交換柱的預處理比較繁瑣；親和層析法對蛋白質的分離仍然存在非專一性吸附等等。隨著超順磁性矽殼納米顆粒製備技術的發展，基於超順磁性矽殼納米顆粒發展起來的生物分離方法為蛋白質的分離提供了新的技術與手段。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，基於靜電吸附原理，提供一種價廉、快速、簡便的採用超順磁性矽殼納米顆粒靜電吸附分離蛋白質的方法。
本發明的技術方案是採用兩種帶不同電荷的超順磁性矽殼納米顆粒，即以Fe3O4為內核，二氧化矽為外殼的帶負電荷的超順磁性純矽殼納米顆粒和以Fe3O4為內核，氨基化二氧化矽為外殼的帶正電荷的超順磁性氨基化矽殼納米顆粒。帶負電荷的超順磁性純矽殼納米顆粒與帶正電荷的鹼性蛋白質通過靜電吸附作用形成超順磁性純矽殼納米顆粒-鹼性蛋白質複合物，在外加磁場的作用下實現超順磁性純矽殼納米顆粒-鹼性蛋白質複合物的分離，再利用解離液將結合在超順磁性純矽殼納米顆粒上的鹼性蛋白質解離下來，實現對鹼性蛋白質的分離；帶正電荷的超順磁性氨基化矽殼納米顆粒與帶負電荷的酸性蛋白質通過靜電吸附作用形成超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-酸性蛋白質複合物，在外加磁場的作用下實現超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-酸性蛋白質複合物的分離，再利用解離液將結合在超順磁性氨基化矽殼納米顆粒上的酸性蛋白質解離下來，實現對酸性蛋白質的分離。
本發明中所採用的兩種納米顆粒熱穩定性好、顆粒均勻，並且兩種納米顆粒的zeta電位都會隨所在溶液pH值的改變而呈現有規律的變化。本發明研究了在不同pH值的溶液中，超順磁性純矽殼納米顆粒和超順磁性氨基化矽殼納米顆粒zeta電位和對酸鹼蛋白質吸附的變化趨勢，以及在吸附過程中鹽離子強度對分離的幹擾情況，從而找出蛋白質吸附、解離條件的變化規律，並分別成功應用於牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)在混合蛋白質溶液中的分離與純化。其中每克超順磁性純矽殼納米顆粒可以吸附分離36毫克細胞色素C，每克超順磁性氨基化矽殼納米顆粒可以吸附分離53毫克牛血清白蛋白。所用超順磁性矽殼納米顆粒經過洗脫處理後，還可以重複使用。
本發明與傳統的分離技術相比較的優勢在於，它將分離和富集結合於一體，利用超順磁性矽殼納米顆粒較大的比表面積，提高了分離過程中納米顆粒與蛋白質分子間的作用速度，並且通過納米顆粒的超順磁性降低了操作強度。該方法具有廉價、快速、簡便等優點，在一般的實驗條件下即可實現。


圖1為在不同的pH值的溶液中，兩種超順磁性矽殼納米顆粒的zeta電位變化圖；圖中(a)為超順磁性純矽殼納米顆粒，(b)為超順磁性氨基化矽殼納米顆粒。
圖2為超順磁性純矽殼納米顆粒對牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中細胞色素C的分離電泳佐證圖；電泳圖中各泳道分別為1、牛血清白蛋白，2、細胞色素C，3、原始牛血清白蛋白和細胞色素C的混合溶液，4、磁分離後剩餘的蛋白質溶液，5、解離所得蛋白質溶液。
圖3為超順磁性純矽殼納米顆粒對牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)、免疫球蛋白G(鹼性蛋白質，pI8.0)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中細胞色素C的分離電泳佐證圖；電泳圖中各泳道分別為1、免疫球蛋白G，2、牛血清白蛋白，3、細胞色素C，4、原始免疫球蛋白G、牛血清白蛋白和細胞色素C的混合溶液，5、磁分離後剩餘的蛋白質溶液，6、解離所得蛋白質溶液。
圖4為超順磁性氨基化矽殼納米顆粒對牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白的分離電泳佐證圖；電泳圖中各泳道分別為1、細胞色素C，2、牛血清白蛋白，3、原始細胞色素C和牛血清白蛋白的混合溶液，4、磁分離後剩餘的蛋白質溶液，5、解離所得蛋白質溶液。
圖5為超順磁性氨基化矽殼納米顆粒對牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)、免疫球蛋白G(鹼性蛋白質，pI8.0)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白的分離電泳佐證圖；電泳圖中各泳道分別為1、細胞色素C，2、牛血清白蛋白，3、免疫球蛋白G，4、原始細胞色素C、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的混合溶液，5、磁分離後剩餘的蛋白質溶液，6、解離所得蛋白質溶液。
具體實施例方式
針對不同等電點的蛋白質，選擇合適的納米顆粒，通過控制溶液的pH值，改變納米顆粒的zeta電位和蛋白質的帶電量，從而控制納米顆粒與蛋白質的靜電作用，實現蛋白質分離。如圖1(a)所示，當納米顆粒所在溶液的pH＞7.0時，超順磁性純矽殼納米顆粒的zeta電位小於-30mV，此時超順磁性純矽殼納米顆粒分散均勻，對帶正電荷的鹼性蛋白質的吸附能力大。當納米顆粒所在溶液的2.5＜pH＜5.0時，超順磁性純矽殼納米顆粒帶有絕對值很小的負zeta電位或者帶有正的zeta電位，對帶正電荷的鹼性蛋白質吸附能力很小或者有排斥作用。所以我們一般選擇在pH＞7.0的溶液中，利用超順磁性純矽殼納米顆粒吸附帶有正電荷的鹼性蛋白質，選擇在2.5＜pH＜5.0的溶液中，對被吸附的鹼性蛋白質進行解離。如圖1(b)所示，當納米顆粒所在溶液的pH＜7.0時，超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的zeta電位大於30mV，此時超順磁性氨基化矽殼納米顆粒分散性好，對帶負電荷的酸性蛋白質吸附能力大。當納米顆粒所在溶液的9.0＜pH＜12時，超順磁性氨基化矽殼納米顆粒帶有很小的正zeta電位或者帶有負的zeta電位，此時超順磁性氨基化矽殼納米顆粒對帶負電荷的酸性蛋白質吸附能力很小或者有排斥作用。所以我們選擇在pH＜7.0溶液中，利用超順磁性氨基化矽殼納米顆粒吸附帶有負電荷的酸性蛋白質，選擇在12＞pH＞9.0的溶液中，對被吸附的目標酸性蛋白質進行解離。
目標鹼性蛋白質的分離選擇超順磁性純矽殼納米顆粒，在7.0＜pH＜pI目標鹼性蛋白質的鹼性溶液中對目標鹼性蛋白質進行吸附。在7.0＜pH＜pI目標鹼性蛋白質的鹼性溶液中，超順磁性純矽殼納米顆粒帶有負zeta電位，此時目標鹼性蛋白質帶有正電荷，二者靜電吸附形成納米顆粒-鹼性蛋白質複合物，在外加磁場的作用下分離出該複合物。用相應pH值的鹼性溶液對納米顆粒-鹼性蛋白質複合物清洗三次。然後在2.5＜pH＜5.0的酸性溶液中，對納米顆粒-鹼性蛋白質複合物進行解離，磁分離回收超順磁性純矽殼納米顆粒，所得溶液即純化的目標鹼性蛋白質溶液。
目標酸性蛋白質的分離選擇超順磁性氨基化矽殼納米顆粒，在pI酸性蛋白質＜pH＜7.0的酸性溶液中對目標酸性蛋白質進行吸附。在pI酸性蛋白質＜pH＜7.0的酸性溶液中，超順磁性氨基化矽殼納米顆粒帶有正zeta電位，此時目標酸性蛋白質帶有負電荷，二者靜電吸附形成納米顆粒-酸性蛋白質複合物，在外加磁場的作用下分離出該複合物。用相應pH值的酸性溶液對納米顆粒-酸性蛋白質複合物清洗三次。然後在9.0＜pH＜12的鹼性溶液中，對納米顆粒-酸性蛋白質複合物進行解離，磁分離回收超順磁性氨基化矽殼納米顆粒，所得溶液即純化的目標酸性蛋白質溶液。
具體實施步驟A、超順磁性純矽殼納米顆粒對目標鹼性蛋白質的分離1、混合蛋白質溶液pH值的調節室溫下，調節混合蛋白質溶液的pH值大於7.0，而小於目標鹼性蛋白質的等電點pH值。此時超順磁性純矽殼納米顆粒帶有負電荷，而目標鹼性蛋白質帶有正電荷。
2、超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物的形成以每毫升混合蛋白質溶液中加入3.0mg的超順磁性純矽殼納米顆粒的比例，向混合蛋白質溶液中加入超順磁性純矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下，充分混勻並培育0.50～2.0小時，形成超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物。
3、超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物的分離收集利用超順磁性矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下對複合物進行分離，收集超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物，並用鹽離子強度小於0.50mol/L的與步驟1中所調pH值相同的鹼性溶液對該複合物進行清洗。
4、超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物的解離以每毫升混合蛋白質溶液磁分離所得超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物中加入1.0mL解離液的比例，向超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物中加入2.5＜pH＜5.0的酸性溶液作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50～2.0小時，將目標鹼性蛋白質從超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物中洗脫下來。
5、超順磁性純矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性純矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的目標鹼性蛋白質溶液。
如果混合蛋白質溶液中的目標鹼性蛋白質太多，可以在上清溶液中進行多次納米顆粒吸附磁分離，最終可以實現目標鹼性蛋白質的完全分離。
B、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒對目標酸性蛋白質的分離1、混合蛋白質溶液pH值的調節室溫下，調節混合蛋白質溶液的pH值小於7.0，而大於目標酸性蛋白質的等電點pH值。此時超順磁性氨基化矽殼納米顆粒帶有正電荷，而目標酸性蛋白質帶有負電荷。
2、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物的形成以每毫升混合蛋白質溶液中加入3.0mg超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的比例，向混合蛋白質溶液中加入超順磁性氨基化矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下，充分混勻並培育0.50～2.0小時，形成超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物。
3、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物的分離收集利用超順磁性矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下對複合物進行分離，收集超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物，並用鹽離子強度小於0.50mol/L的與步驟1中所調pH值相同的酸性溶液對該複合物進行清洗。
4、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物的解離以每毫升混合蛋白質溶液磁分離所得超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物中加入1.0mL解離液的比例，在超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物中加入9.0＜pH＜12的鹼性溶液作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50～2.0小時，將目標酸性蛋白質從超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物中洗脫下來。
5、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性氨基化矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的目標酸性蛋白質溶液。
如果混合蛋白質溶液中的目標酸性蛋白質太多，可以在上清溶液中進行多次納米顆粒吸附磁分離，最終可以實現目標酸性蛋白質的完全分離。
實施例1牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中細胞色素C的提取1、細胞色素C和牛血清白蛋白混合溶液pH值的調節室溫下，用1/15mol/L的磷酸氫二鈉的溶液，調節混合蛋白質溶液的pH值為8.0。
2、超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物的形成在5.0mL混合蛋白質溶液中，加入15mg超順磁性純矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下，充分混勻並培育0.50小時，形成超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C的複合物。
3、超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物的分離收集利用超順磁性純矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下，對超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物進行分離，收集超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物。用5.0mL pH8.0的1/15mol/L的磷酸鹽溶液對該複合物進行磁分離清洗，清洗三次。
4、超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物的解離在超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物中，加入5.0mL pH3.0的磷酸二氫鉀-鹽酸溶液(經0.1mol/L鹽酸調節1/15mol/L磷酸二氫鉀溶液的pH值到3.0)作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50小時，將細胞色素C從超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物中解離下來。
5、超順磁性純矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性純矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的細胞色素C溶液。
對分離過程中所得的各種蛋白質溶液進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳實驗，如圖2所示第一、二泳道分別表示牛血清白蛋白和細胞色素C的標準樣品，與此對比可知，原始牛血清白蛋白和細胞色素C的混合溶液(第3泳道)中的細胞色素C被完全分離出來(第4泳道)，並成功地實現了被吸附細胞色素C的解離，得到純化的細胞色素C溶液(第5泳道)。
實施例2牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)、免疫球蛋白G(鹼性蛋白質，pI8.0)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中細胞色素C的提取1、牛血清白蛋白、免疫球蛋白G和細胞色素C混合溶液pH值的調節室溫下，用1/15mol/L的磷酸氫二鈉的溶液，調節混合蛋白質溶液的pH值為8.0。
2、超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物的形成在1.0mL混合蛋白質溶液中，加入3.0mg超順磁性純矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下充分混勻並培育0.50小時，形成超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C的複合物。
3、超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物的分離收集利用超順磁性純矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下，對超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物進行分離，收集超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物。用1.0mL pH8.0的1/15mol/L的磷酸鹽溶液對該複合物進行磁分離清洗，清洗三次。
4、超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物的解離在超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物中，加入1.0mL pH3.0的磷酸二氫鉀-鹽酸溶液(經0.1mol/L鹽酸調節1/15mol/L磷酸二氫鉀溶液的pH值到3.0)作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50小時，將細胞色素C從超順磁性純矽殼納米顆粒-細胞色素C複合物中解離下來。
5、超順磁性純矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性純矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的細胞色素C溶液。
對分離過程中所得的各種蛋白質溶液進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳實驗，如圖3所示第一、二、三泳道分別表示免疫球蛋白G、細胞色素C和牛血清白蛋白的標準樣品，與此對比可知，原始免疫球蛋白G、牛血清白蛋白和細胞色素C的混合溶液(第4泳道)中的細胞色素C被完全分離出來(第5泳道)，並成功地實現了被吸附的細胞色素C的解離，得到純化的細胞色素C溶液(第6泳道)。
實施例3牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白的提取1、細胞色素C和牛血清白蛋白混合溶液pH值的調節室溫下，用1/15mol/L的磷酸二氫鉀溶液，調節混合蛋白質溶液的pH值為5.0。
2、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物的形成在3.0mL混合蛋白質溶液中，加入9.0mg超順磁性氨基化矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下，充分混勻並培育0.50小時，形成超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物。
3、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物的分離收集利用超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下進行分離，收集超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物。用3.0mL pH5.0的1/15mol/L的磷酸鹽溶液對該複合物進行磁分離清洗，清洗三次。
4、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物的解離在超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物中加入3.0mL pH9.0的1/15mol/L的磷酸鹽溶液作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50小時，將牛血清白蛋白從超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物中解離下來。
5、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性氨基化矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的牛血清白蛋白溶液。
對分離過程中所得的各種蛋白質溶液進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳實驗，如圖4所示第一、二泳道分別表示細胞色素C和牛血清白蛋白的標準樣品，與此對比可知，原始牛血清白蛋白和細胞色素C混合溶液(第3泳道)中的牛血清白蛋白被部分提取出來(第4泳道)，並實現了被吸附牛血清白蛋白的解離，得到純化的牛血清白蛋白溶液(第5泳道)。
實施例4牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)、免疫球蛋白G(鹼性蛋白質，pI8.0)和細胞色素C(鹼性蛋白質，pI10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白(酸性蛋白質，pI4.6)的提取1、牛血清白蛋白、細胞色素C和免疫球蛋白G混合溶液pH值的調節室溫下，用1/15mol/L的磷酸二氫鉀溶液，調節混合蛋白質溶液的pH值為5.0。
2、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物的形成在6.0mL混合蛋白質溶液中，加入18mg超順磁性氨基化矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下，充分混勻並培育0.50小時，形成超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物。
3、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物的分離收集利用超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下進行分離，收集超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物。用6.0mL pH5.0的1/15mol/L的磷酸鹽溶液對該複合物進行磁分離清洗，清洗三次。
4、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物的解離在超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物中加入6.0mL pH9.0的1/15mol/L的磷酸鹽溶液作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50小時，將牛血清白蛋白從超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-牛血清白蛋白複合物中解離下來。
5、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性氨基化矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的牛血清白蛋白溶液。
對分離過程中所得的各種蛋白質溶液進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳實驗，結果如圖5所示，第一、二、三泳道分別表示細胞色素C、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的標準樣品，與此對比可知，原始免疫球蛋白G、牛血清白蛋白和細胞色素C的混合溶液(第4泳道)中的牛血清白蛋白被部分提取出來(第5泳道)，並成功地實現了被吸附牛血清白蛋白的解離，得到純化的牛血清白蛋白溶液(第6泳道)。
權利要求
1.一種採用超順磁性矽殼納米顆粒靜電吸附分離蛋白質的方法，其特徵在於採用兩種帶不同電荷的超順磁性矽殼納米顆粒，即以Fe3O4為內核，二氧化矽為外殼的帶負電荷的超順磁性純矽殼納米顆粒和以Fe3O4為內核，氨基化二氧化矽為外殼的帶正電荷的超順磁性氨基化矽殼納米顆粒，帶負電荷的超順磁性純矽殼納米顆粒與帶正電荷的鹼性蛋白質通過靜電吸附作用形成超順磁性純矽殼納米顆粒-鹼性蛋白質複合物，在外加磁場的作用下實現超順磁性純矽殼納米顆粒-鹼性蛋白質複合物的分離，再利用解離液將結合在超順磁性純矽殼納米顆粒上的鹼性蛋白質解離下來，實現對鹼性蛋白質的分離；帶正電荷的超順磁性氨基化矽殼納米顆粒與帶負電荷的酸性蛋白質通過靜電吸附作用形成超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-酸性蛋白質複合物，在外加磁場的作用下實現超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-酸性蛋白質複合物的分離，再利用解離液將結合在超順磁性氨基化矽殼納米顆粒上的酸性蛋白質解離下來，實現對酸性蛋白質的分離。
2.根據權利要求1所述的採用超順磁性矽殼納米顆粒靜電吸附分離蛋白質的方法，其特徵在於採用超順磁性純矽殼納米顆粒靜電吸附分離目標鹼性蛋白質，其具體步驟為(1)、混合蛋白質溶液pH值的調節室溫下，調節混合蛋白質溶液的pH值大於7.0，而小於目標鹼性蛋白質的等電點pH值；(2)、超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物的形成以每毫升混合蛋白質溶液中加入3.0mg的超順磁性純矽殼納米顆粒的比例，向混合蛋白質溶液中加入超順磁性純矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下，充分混勻並培育0.50～2.0小時，形成超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物；(3)、超順磁性矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物的分離收集利用超順磁性純矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下對複合物進行分離，收集超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物，並用鹽離子強度小於0.50mol/L的與步驟(1)中所調節的pH值相同的鹼性溶液對該複合物進行清洗；(4)、超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物中被吸附蛋白質的解離以每毫升混合蛋白質溶液磁分離所得超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物中加入1.0mL解離液的比例，向超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物中加入2.5＜pH＜5.0的酸性溶液作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50～2.0小時，將目標鹼性蛋白質從超順磁性純矽殼納米顆粒-目標鹼性蛋白質複合物中洗脫下來；(5)、超順磁性純矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性純矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的目標鹼性蛋白質溶液。
3.根據權利要求1所述的採用超順磁性矽殼納米顆粒靜電吸附分離蛋白質的方法，其特徵在於採用超順磁性氨基化矽殼納米顆粒靜電吸附分離目標酸性蛋白質，其具體步驟為(1)、混合蛋白質溶液pH值的調節室溫下，調節混合蛋白質溶液的pH值小於7.0，而大於目標酸性蛋白質的等電點pH值；(2)、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物的形成以每毫升混合蛋白質溶液中加入3.0mg超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的比例，向混合蛋白質溶液中加入超順磁性氨基化矽殼納米顆粒，於15～25℃室溫下，充分混勻並培育0.50～2.0小時，形成超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物；(3)、超順磁性矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物的分離收集利用超順磁性矽殼納米顆粒的超順磁性，在外加磁場作用下對複合物進行分離，收集超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物，並用鹽離子強度小於0.50mol/L的與步驟(1)中所調節的pH值相同的酸性溶液對該複合物進行清洗；(4)、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物中被吸附蛋白質的解離以每毫升混合蛋白質溶液磁分離所得超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物中加入1.0mL解離液的比例，在超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物中加入9.0＜pH＜12的鹼性溶液作為解離液，於15～25℃室溫下，充分振蕩解離0.50～2.0小時，將目標酸性蛋白質從超順磁性氨基化矽殼納米顆粒-目標酸性蛋白質複合物中洗脫下來；(5)、超順磁性氨基化矽殼納米顆粒的回收在外加磁場的作用下，將超順磁性氨基化矽殼納米顆粒從解離液中分離回收，所得溶液即純化的目標酸性蛋白質溶液。
全文摘要
本發明公開了一種基於靜電吸附原理，利用帶電荷的超順磁性矽殼納米顆粒分離蛋白質的方法。本發明主要涉及兩種超順磁性矽殼納米顆粒帶有負電荷的超順磁性純矽殼納米顆粒和帶有正電荷的超順磁性氨基化矽殼納米顆粒。通過控制溶液pH值，利用前者實現對目標鹼性蛋白質(細胞色素C)的分離提取，利用後者實現對目標酸性蛋白質(牛血清白蛋白)的分離提取。與傳統的分離技術相比較，該方法將分離和富集結合於一體，利用超順磁性矽殼納米顆粒較大的比表面積，提高了分離過程中顆粒與蛋白質分子間的作用速度，並且通過顆粒的超順磁性降低了操作強度。該方法具有廉價、快速、簡便等優點，在一般的實驗條件下即可實現。
文檔編號C07K1/00GK1876673SQ20061003192
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月4日 優先權日2006年7月4日
發明者王柯敏, 何曉曉, 陳英傑, 譚蔚泓, 吳萍 申請人:湖南大學