一種利用固定化酶製備菊芋低聚果糖的方法與流程

2023-08-04 18:23:06 2

本發明屬於低聚果糖製備
技術領域：
，具體涉及一種利用固定化酶耦合模擬移動床色譜技術製備菊芋低聚果糖的方法。
背景技術：
：菊芋為菊科菊芋屬多年生草本植物，又名歐洲菊芋、咖啡草或法國苣蕒菜，原產於歐洲、西亞、中亞和北美洲，我國西北、華北及東北等地區均有分布。菊芭營養價值高，抗病蟲害且高產，再生能力強，是一種很有開發潛力的高產優質飼草。菊芋肉質根內含70％左右(乾物質重)的菊粉，可作為菊粉、低聚果糖(fos)及高果糖漿的生產原料。果糖基系列產品是指d-果糖經β(1→2)糖苷鍵連接而成的多糖，末端常含有一個葡萄糖基，分子式表示為gfn，或是fm，其中g為終端葡萄糖單位(glucose)，f代表果糖分子(fructose)，n或m則代表果糖單位數。通常，一個糖苷鍵為一個聚合度(dp)，菊粉的聚合度為2～100，聚合度大於20時為低聚果糖，低聚合度時(dp＝2～9)為低聚果糖，如蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、果果三糖、果果四糖、果果五糖等，當兩個果糖相互連接而組成的環狀二糖，則為雙果糖酐。目前，高純度低聚果糖的主要製備方法有酶法，發酵法，色譜法和膜分離法。①酶法：lamia等以果糖轉移酶作用於蔗糖製得的低聚果糖為原料，將葡萄糖氧化酶及過氧化氫酶協同作用於30％的總糖，得到純度為86.92％的低聚果糖。kyung等曾通過補加葡萄糖氧化酶至常規的fos反應體系中，利用果糖基轉移酶和葡萄糖氧化酶雙酶法提高低聚果糖淨含量，通過這種方法低聚果糖的淨含量可提高至90％。valdivieso等將經活力重組菌株中的一株具有高複製葡萄糖氧化酶活性基因和高葡萄糖氧化酶的菌株用於製備葡萄糖氧化酶。通過添加孢外葡萄糖氧化酶至fos合成反應中，以去除反應過程中生成的葡萄糖，避免真菌β-呋喃果糖苷酶被抑制，最終低聚果糖含量達90％。②發酵法：張濤等將篩選得到的酵母添加於固形物質量分數為25％的普通級低聚果糖(fos)溶液中，以消除產品中的副產物葡萄搪，得到了不含葡萄糖且fos質量分數達85.23％的產品。lin等利用海藻酸鈣固定aspergillusjaponicusandaspergillusnige兩種微生物菌絲體於生物反應器中從蔗糖製備高含量低聚果糖產品，最後得到的低聚果糖含量達90％。③色譜法：此方法在日本和韓國有很廣泛的應用,該方法在50～60％低聚果糖的基礎上,通過色譜分離柱進行分離的方法把產品中的單糖和蔗糖除去,得到低聚果糖含量達到95％以上。④膜分離法：馮文亮、孫蔚榕、張永剛等分別採用了一級分離法、二級分離法和三級分離法純化低聚果糖，獲得的低聚果糖的純度均達到90％以上。武金良採用二級納濾和反滲透耦合的方法純化低聚果糖，可得90％以上純度和50％以上純度的低聚果糖，其產率分別為13.2％和74.2％。模擬移動色譜(smb)技術是目前國內外比較先進的純化手段，廣泛的應用於糖醇、生物及醫藥等領域，這種技術可以實現連續化、自動化的生產，在熱敏性、同分異構體物質的分離上具有獨到之處。國內的smb技術剛剛起步，還處於發展階段，目前只有極少的幾家公司和大學進行了研究，取得了一定的成果。在進行smb分離試驗時，需要根據製備色譜實驗的結果，在其數據的基礎上設計分區和計算初始參數，並通過實驗調整進行工藝參數的優化。smb技術可以實現大規模的產業化生產，可以實現連續化、自動化的控制，較製備色譜具有較大的優勢。但現有技術中的模擬移動色譜技術其進料濃度低一般只有20％、產品折光低，導致濃縮成本的增加。技術實現要素：本發明需要解決的技術問題是，提供一種利用固定化酶製備菊芋低聚果糖的方法，以解決現有技術中低聚果糖純度不高的問題。為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：一種利用固定化酶製備菊芋低聚果糖的方法，該方法包括如下步驟：(1)將有菊芋製備得到的菊粉粗提液進行脫色、脫苦、脫鹽處理，得到菊粉精製液；(2)將步驟(1)得到的菊粉精製液加入固定化菊粉內切酶樹脂柱，從固定化菊粉內切酶樹脂柱的流出液再加入模擬移動床色譜分離裝置進行分離純化，以水為洗脫劑，所述模擬移動床包括i～iv個區，每一個區包括1～6根色譜柱，其中ⅰ區、ⅱ區色譜柱填充弱酸型陽離子交換樹脂，ⅲ區、ⅳ區色譜柱填充陽離子分子篩；所述固定化菊粉內切酶樹脂柱內填充殼聚糖/二氧化矽固定化菊粉內切酶；(3)將得到的低聚果糖溶液減壓蒸發濃縮，既得到低聚果糖。步驟(1)中，菊粉粗提液脫色、脫苦、脫鹽的方法如下：將菊粉粗提液依次通過活性炭、殼聚糖、陽離子大孔樹脂、納濾膜。步驟(2)中，模擬移動床色譜分離裝置的工藝參數如下：運行溫度為35℃～50℃，壓力為0.1～0.4mpa，進料液流量20～100ml/min，洗脫劑的流量為50～130ml/min，設定i區流速為30cm/h～50cm/h，ii區流速為20cm/h～50cm/h，iii區流速為30cm/h～50cm/h，iv區流速為20cm/h～30cm/h；作為優選，所述的陽離子大孔樹脂為h103。作為優選，所述的納濾膜為dl8040f。其中，所述的弱酸型陽離子交換樹脂為d-85。其中，所述陽離子分子篩的類型為y型分子篩。作為優選，模擬移動床色譜分離裝置的工藝參數如下：運行溫度為45℃，壓力為0.2mpa，進料液流量50ml/min，洗脫劑的流量為70ml/min，設定i區流速為45cm/h，ii區流速為35cm/h，iii區流速為45cm/h，iv區流速為25cm/h。其中，所述減壓蒸發濃縮，其壓力為-0.098mpa。其中，殼聚糖/二氧化矽固定化菊粉內切酶的製備方法如下：(1a)取介孔二氧化矽1～10g、殼聚糖5～20g於100～150ml乙醇中，在50～100℃下反應10～24h，過濾，用乙醇洗滌，乾燥，得到殼聚糖修飾的二氧化矽載體；(2a)將步驟(1a)得到的殼聚糖修飾的二氧化矽載體加入體積分數為1％～4％的戊二醛水溶液中，反應2～10h，過濾，用水洗滌濾出物，再將濾出物加入內切菊粉酶的濃度為1～5mg/l的磷酸水溶液中，在30～40℃條件下反應1～10h，抽濾，得到殼聚糖/二氧化矽固定化菊粉內切酶。有益效果：本發明公開了一種利用固定化酶製備菊芋低聚果糖的方法，將固定化菊粉內切酶的樹脂柱與模擬移動床色譜技術耦合，得到的低聚果糖的純度高，可以實現操作連續化，提高了原料的利用率，降低了生產成本。具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1：菊粉精製液的製備。取500g新鮮菊芋菊芋洗淨、去皮、研磨壓碎；將壓碎的菊芋加入含有果膠酶的tris-hcl緩衝液中，所述tris-hcl緩衝液的濃度為1mol/l，ph為6.8，果膠酶的添加量是1000u/l，在35攝氏度下攪拌3h，然後將提取液加熱至100℃，攪拌5h；過濾菊粉提取液，得到菊粉粗提液；對菊粉粗提液進行脫色、脫苦、脫鹽處理，將菊粉粗提液依次通過活性炭、殼聚糖、陽離子大孔樹脂、納濾膜，所述的陽離子大孔樹脂為h103，所述的納濾膜為dl8040f，得到菊粉精製液。實施例2：本發明中使用的菊粉內切酶購自諾維信公司，殼聚糖/二氧化矽固定化菊粉內切酶的製備方法如下：(1a)取介孔二氧化矽1～10g、殼聚糖5～20g於100～150ml乙醇中，在50～100℃下反應10～24h，過濾，用乙醇洗滌，乾燥，得到殼聚糖修飾的二氧化矽載體；(2a)將步驟(1a)得到的殼聚糖修飾的二氧化矽載體加入體積分數為1％～4％的戊二醛水溶液中，反應2～10h，過濾，用水洗滌濾出物，再將濾出物加入內切菊粉酶的濃度為1～5mg/l的磷酸水溶液中，在30～40℃條件下反應1～10h，抽濾，得到殼聚糖/二氧化矽固定化菊粉內切酶。實施例3：戊二醛濃度對固定化菊粉酶的酶活影響。固定化載體製備和固定化方法參考實施例1～3，所不同的是，在固定化酶時，戊二醛體積濃度為0、1％、2％、3％、4％、5％。表1戊二醛濃度對固定化菊粉酶的酶活影響實施例4：固定化時間對固定化內切菊粉酶的酶活影響。固定化載體製備和固定化方法參考實施例1～3，所不同的是，在固定化酶時，固定化時間為1h、2h、4h、8h、10h、12h。表2固定化時間對固定化內切菊粉酶的酶活影響固定化時間(h)固定化內切菊粉酶酶活(u/g)18712884486689571089912881實施例5：內切菊粉酶濃度對固定化內切菊粉酶的酶活影響。固定化載體製備和固定化方法參考實施例1～3，所不同的是，在固定化酶時，1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l。表3內切菊粉酶濃度對固定化內切菊粉酶的酶活影響內切菊粉酶濃度mg/l固定化內切菊粉酶酶活(u/g)18562932394749815878在最有的條件下，該固定化菊粉酶能夠將95％以上的低聚果糖水解為低聚果糖，固定化酶在使用20批次後酶活還能保持80％以上，具有較好的應用前景。實施例6：模擬移動床色譜分離裝置分離純化低聚果糖。從固定化菊粉內切酶樹脂柱的流出液再加入模擬移動床色譜分離裝置進行分離純化，以水為洗脫劑，所述模擬移動床包括i～iv個區，每一個區包括1～6根色譜柱，其中ⅰ區、ⅱ區色譜柱填充d-85弱酸型陽離子交換樹脂，ⅲ區、ⅳ區色譜柱填充y型分子篩；將得到的低聚果糖溶液在-0.098mpa減壓蒸發濃縮，既得到高純度低聚果糖。模擬移動床色譜分離裝置的工藝參數如下：運行溫度為45℃，壓力為0.2mpa，進料液流量50ml/min，洗脫劑的流量為70ml/min，設定i區流速為45cm/h，ii區流速為35cm/h，iii區流速為45cm/h，iv區流速為25cm/h。得到低聚果糖溶液中低聚果糖含量為99％，低聚果糖提取效率為95％。實施例7：其他條件與實施例6相同，所不同的是，調節模擬移動床色譜分離裝置的運行溫度為35℃、40℃、45℃、50℃。檢測低聚果糖流出口低聚果糖的含量及聚合度，檢測結果如下表。表4溫度對低聚果糖分離效率的影響實施例8：壓力對低聚果糖分離效率的影響。其他條件與實施例2相同，所不同的是，調節模擬移動床色譜分離裝置的運行壓力為0.1～0.4mpa。檢測低聚果糖流出口低聚果糖的含量及聚合度，檢測結果如下表。表5壓力對低聚果糖分離效率的影響實施例8：i區流速對低聚果糖分離效率的影響。表6i區流速對低聚果糖分離效率的影響實施例9：ii區流速對低聚果糖分離效率的影響。表7ii區流速對低聚果糖分離效率的影響實施例10：iii區流速對低聚果糖分離效率的影響。表8iii區流速對低聚果糖分離效率的影響實施例11：iv區流速對低聚果糖分離效率的影響。表9iv區流速對低聚果糖分離效率的影響當前第1頁12