經修飾的cea/b7載體的製作方法

2023-08-04 15:37:51 1

專利名稱：：經修飾的cea/b7載體的製作方法經修飾的CEA/B7栽體發明領城本發明涉及編碼多肽的核酸和所述核酸或多肽在預防和/或治療癌症中的用途.具體地，本發明涉及用於插入和表達編碼肺瘤抗原的外源基因的改進栽體，以用於癌症的免疫治療.發明背景因為在基於原發性腫瘤和正常細胞的表達特徵的分子鑑定上取得巨大的進展，所以近年來在使用腫瘤相關抗原(TAAs)的癌症疫苗開發上已獲得巨大的增長，所述分子鑑定藉助於幾種技術，例如高密度微陣列、SEREX、免疫組織化學(IHC)、RT-PCR、原位雜交(ISH)和雷射捕獲顯微鏡術(Rosenberg,Immunity,1999;Sgroi等人，1999,Schena等人，1995,Offringa等人，2000),所述TAAs是由腫瘤細胞表達或超表達的抗原並且對一種或幾種腫瘤特異，例如CEA抗原在結腸直腸癌、乳腺癌和肺癌中表達.Sgroi等人(1999)結合使用雷射捕獲顯微解剖和cDM微陣列鑑定了幾種在侵襲性和轉移性癌細胞中差異表達的基因。幾種遞送系統如DNA或病毒可用於抗人癌症的治療性接種(Bonnet等人，2000),並且可引起免疫應答，且也可打破抗TAAs的免疫耐受性。通過插入編碼T細胞共刺激分子例如B7.1或細胞因子IFN"Y、IL2、GM-CSF等的轉基因可使腫瘤細胞更具免疫原性.TAA和細胞因子或共刺激分子的共表達可開發有效的治療性疫苗(Hodge等人，95，Bronte等人，1995，Chamberlain等人，1996),在本領域需要用於刺激預防或治療癌症的免疫應答的試劑和方法學.本發明提供了這樣的試刑和方法學，其克服了許多其它試劑和方法學在試困治療癌症例如癌的過程中遇到的困難.特別地，本發明提供了新的CBA編碼序列.該核苷酸序列CEA(6D)-1,2包含消除CEA截短形式的表達(當從表達栽體表達時)的序列修飾.本領域技術人員想要用這種經修飾的的序列來提高CEA的表達和改善免疫方案.發明概述本發明提供了給患者施用以預防和/或治療癌症的免疫原性靶，特別地，所迷免疫原性靶是CEA肺瘤抗原("TA")和/或血管發生相關抗原("AA")。在一個實施方案中，免疫原性靶由經修飾的在經轉化的細胞中提高CEA表達的CEA核苷酸序列(CEA(6D)-1，2)編碼.在某些實施方案中，將TA和/或AA以包含於質粒或其它遞送栽體例如重組病毒中的核酸的形式給患者施用.TA和/或AA也可與免疫刺激物例如共刺激分子或佐劑聯合施用.附困簡述困l.A.包舍在部分H6啟動子控制下的具有6D修飾的CEA編碼序列的質粒p3，H6MCBA的困解，B.質粒pSE1544.9(pUC18-mCEA重複l)的圖解.圖2.質粒pSE1616.44(pUC18-mCEA修飾的重複l)的困解。困3.質粒pSE1658.15(p3'H6MCBA修飾的重複1)的困解。困4.質粒pBSmCEA的困解，困5.質粒pSE1686.1(pUC18mCEA修飾的重複2)的圍解.困6.質粒pSE1696.1(pUC18mCEA修飾的重複2)的圖解.困7.質粒p3'H6modMCEA-第1和笫2重複的困解.困8.質粒pNVQH6MCBA(6D笫l和笫2)的困解。圖9A-D.CAP(6D)和CAP(6D)-1，2的核苷酸序列的比較，下劃線標明序列之間的差異.困10.確定NYVACDNA中存在CAP(6D)-1，2的PCR分析.困11.舉例說明在表達CAP(6D)-1,2的細胞中不存在截短的CEA的免疫印跡.困12.ALVACC6供體質粒中在H6啟動子控制下的人B7.l基因.困13.ALVACC3供體質粒中在H6啟動子控制下的CAP(6D)-1，2CEADNA序列.詳迷本發明提供了用於治療和/或預防癌症的試刑和方法學.所有本申請引用的參考資料都引用作為參考.在一個實施方案中，本發明涉及誘導或增強抗一種或多種腫瘸抗原("TA")的免疫應答以預防和/或治療癌症.在某些實施方案中，可將一種或多種TAs組合.在優選的實施方案中，免疫應答由在例如施用編碼腫瘤抗原的核酸栽體或以肽或多肽形式存在的腫痗抗原自身後TA在宿主細胞內的表達產生，如此處所用的，"抗原"是指在已施用抗原的宿主中產生免疫應答的分子(例如多肽)或其部分.所述免疫應答可包括產生結合至少一種抗原表位的抗體和/或產生抗表達所述抗原表位的細胞的細胞免疫應答，所述應答可以是通過例如導致增加的抗體生產、產生具有增加的對抗原的親和力的抗體或增加的細胞應答(即，增加的T細胞)而增強當前的免疫應答.可選擇地，產生免疫應答的抗原可被稱作是具有免疫原性的或被稱作免疫原.在描述本發明中，TA可稱作"免疫原性靶".TA包括肺癌相關抗原(TAAs)和腫瘸特異抗原(TSAs)，其中癌細胞是所述抗原的來源.TAA是在腫瘸細胞表面以高於在正常細胞表面觀察到的量表達的抗原或是在胎兒發育期間在正常細胞上表達的抗原。TSA是對腫瘤細胞而言獨特的抗原並且不在正常細胞中表達.TA進一步包括TAAs或TSAs、其抗原性片段和保持其抗原性的經修飾的版本，根據其表達模式、功能或遣傳來源，TAs—般分為5類癌-睪丸(CT)抗原(即，MAGE、NY-ES0-1)、黑素細胞分化抗原(即MelanA/MART-1、酪氨酸酶、gplOO)、突變抗原(即,MUM-1、p53、CDK-4)、超表達的'自身，抗原(即，HER-2/neu、p5"和病毒抗原(即，HPV、BBV).為實踐本發明的目的，合適的TA是任何在已施用TA的宿主內誘導或增強抗腫瘤免疫應答的TA.合適的TA包括，例如，gp100(Cox等人，5W,e，264:716-719(1994))、MART-1/MelanA(Kawakami等人，J.Exp.Med.，180:347-352(1994))、gp75(TRP-1)(Wang等人，J.Exp.Med.，186:1131-1140(1996))、酪氨酸酶(Wolfel等人，Eur./7ip邁wzo/.，24:759-764(1994);200175117;W0200175016;WO200175007)、NY-ES0-1(W098/14464;99/18206)、黑素病蛋白聚糖(Hellstrom等人，//瓜邁咖0/.，130:1467-1472(1983))、MAGE家族抗原(即，MAGB-1，2,3,4,6,12,51;VanderBruggen等人，Science,254:1643-1647(1991);美國專利號6,235,525;CN1319611)、BAGE家族抗原(Boel等人，力咖w",，2:167-175(1995))、GAGE家族抗原(即，GAGE-1，2;VandenEynde等人，/.iU77.,182:689-698(1995);美國專利號6,013,765)、RAGE家族抗原(即，RAGE-1;Gaugler等人，/鵬270戸e〃"，44:323-330(1996);美國專利號5，939，526)、N-乙醯葡糖胺轉移酶V(Guilloux等人，J.Exp.Med.，183:1173-1183(1996))、pl5(Robbins等人，//邁邁wjo/.154:5944-5950(1995))、P-連環蛋白(Robbins等人，J.Bxp.Med.，183:1185-1192(1996))、MUM-1(Coulie等人，戶roc.^ca^Sc六USA，92:7976-7980(1995))、依賴細胞周期蛋白的激酶4(CDK4)(Wolfel等人，5We加e，269:1281-1284(1995))、p21-ras(Fossum等人，Int.J.C腐er，56:40-45(1994))、BCR-abl(Bocchia等人，Blood，85:2680-2684(1995))、p53(Theobald等人，戶roc.5W.USA，92:11993-11997(1995))、p185HER2/neu(e^b-Bl;Fisk等人，J.Exp.Med.，181:2109-2117(1995))、表皮生長因子受體(EGFR)(Harris等人，BreastCancerRes,Treat,29:1-2(1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong等人，/C雄er,85:982-990(1995)美國專利號5,756,103、5,274,087、5，571，710、6,071,716、5,698,530、6,045,802;BP263933;EP346710和EP784483)、癌相關突變粘蛋白(即，MUC-l基因產物；Jerome等人，/7iMM//o/，151:1654-1662(1993))、EBV的EBNA基因產物(即，EBNA-1，Rickinson等人，Ca/icer^渭^，13:53-80(1992))、人乳頭瘤病毒的E7、E6蛋白(Ressing等人,/./逝羅o/，154:5934-5943(1995))、前列腺特異性抗原(PSA;Xue等人，TheProstate,30:73-78(1997))、前列腺特異性膜抗原(PSMA;Israeli,等人，"/7cer^5義，54:1807-1811(1994))、獨特型表位或抗原，例如，免疫球蛋白獨特型或T細胞受體獨特型(Chen等人，/./卿加/，153:4775-4787(1994))、KSA(美國專利號5,348,887)、驅動蛋白2(Dietz，等人，BiochemBiophysResCo邁mun2000Sep7:275(3):731-8)、HIP-55、TGF卩-1抗細胞消亡因子(Toomey，等人，BrJBiomedSci2001;58(3):177-83)、胂錄蛋白D52(BryneJ.A.,等人，Genomics,35:523-532(1996))、H1FT、NY-BR-1(WO01/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87、NY-BR-96(Scanlan,M,SerologicandBioinformaticApproachestotheIdentificationofHumanTumorAntigens,in"jjcerKacc/zes2000，CancerResearchInstitute,NewYork,NY)，包括其"野生型"(即，由基因組正常編碼的、天然發生的)、經修飾的和突變的版本和其它片段和衍生物.這些TAs中的任一種可單獨地使用或在共免疫方案中與另一種聯合使用.在某些情況下，用TA和其它抗原例如血管發生相關抗原("AA")共免疫患者可能是有利的.AA是與參與血管的誘導和/或持續發育的細胞關聯的免疫原性分子(即，肽、多肽).例如，AA可以在作為血管的主要結構成分的內皮細胞("EC")上表達.當癌症是癌時，優選地在支持腫瘤的血管內或附近發現AA.患者的抗AA免疫優選地導致抗AA的免疫應答，從而預防和/或抑制了發生在胂瘤附近或腫瘤內的血管生成過程。其中示例性AAs包括，例如，血管內皮生長因子(即，VEGF;Bernardini等人，/.^ro厶，2001，166(4):1275-9;Starnes等人，/.7orac.Ca油'o附cS呵.，2001，122(3):518-23)、VEGF受體(即，VBGF-R、flk-l/OR;Starnes，等人，/.7o"c.CW/or進y呵.，2001，122(3):518-23)、EPH受體(即，EPHA2;Gerety等人，1999，Cell,4:403-414)、表皮生長因子受體(即，EGFR;Ciardeillo等人，C〃/z.虹，2001，7(10):2958-70)、鹼性成纖維細胞生長因子(即，bFGF;Davidson等人，67/o.Ar;7.ife"""/s2000,18(6):501-7jPoon等人，*/.Sw^.，2001，182(3):298-304)、血小板衍生細胞生長因子(即，PDGF-B)、血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-BCGF;Hong等人，/.,2001，8(2):141-8)、轉化生長因子(即，TGF-a;Hong等人，/#e&，2001,8(2):141-8)、endoglin(Balza等人，/.2001，94:579-585)、Id蛋白(Benezra，R.TrendsCardiovasc.Med.,2001，11(6):237-41)、蛋白錄例如uPA、uPAR和基質金屬蛋白醉(MMP-2、MMP-9;Djonov等人，J.Pathol.，2001，195(2):147-55)、氣化氮合酶(A邁.J.Ophthalmol.,2001,132(4)551-6)、氨肽蘇(Rouslhati,E.NatureCancer,2:84-90,2002)、血小板反應蛋白(即，TSP-1、TSP-2;Alvarez等人，Gynecol,Oncol.，2001,82(2):273-8;Seki，等人，Int.J.Oncol.,2001，19(2):305-10)、iKras(Zhang等人，CancerRes.，2001，61(16):6050-4)、粉f(Zhang等人，CancerRes.，2001,61(16):6050-4)、依賴細胞周期蛋白的激酶(CDKs;DrugResist.Updat.2000，3(2):83-88)、微管(Ti姐ar等人，2001.Path.Oncol.Res.,7(2):85—94)、熱激蛋白(即，HSP90(Ti邊ar，同上))、肝素結合因子(即，肝素酶；Gohji等人，Int.J.Cancer,2001，95(5):295-301)、合酶(即，ATP合酶、胸苷酸合酶)、膠原蛋白受體、整聯蛋白(即，avP3、avP5、aipi、a2pl、a5pi)、表面蛋白聚糖NG2、AAC2-1(SEQIDNO.:1)或AAC2-2(SBQIDNO.:2)，包括其"野生型"(即，由基因組正常編碼的、天然發生的)、經修飾的、突變的版本以及其它片段和衍生物.這些把中的任何一個可適合於單獨地或與另外一種或其它試刑組合來實踐本發明.在某些實施方案中，使用編碼免疫原性靶的核酸分子，所述核酸分子可包含或由編碼一種或多種免疫原性靶的核苷酸序列或其片段或衍生物組成，例如包含於ATCC保藏物中的DNA插入片段中的那些.術語"核酸序列"或"核酸分子"是指DNA或RNA序列.所述術語包括從任何已知的卵A和RNA的鹼基類似物形成的分子，其中，所迷類似物是例如，但不限於4-乙跣胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶-胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-象尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-疏尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氬尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶，1-甲基烏嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二甲基-烏噪呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基烏嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氦甲基尿嘧啶、5-甲氣基氛基-甲基-2-疏尿嘧梵、P-D-甘露糖Q核苷(p-D-mannosylqueosine)、5'-甲氣基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氣基尿嘧啶、2-甲基疏代-K6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酶、尿嘧啶-5-羥基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧梵、Q核苦(queosine)、2-疏胞嘧咬、5-甲基-2-疏尿嘧啶、2-疏尿嘧啶、4-疏尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羥基乙酸甲醋、尿嘧啶-5-羥基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷Uueosine)、2-疏胞嘧咬和2，6-二氨基嚷呤.分離的核酸分子是這樣的分子(1)當從來源細胞中分離總核酸時，其和至少大約50X的與其一起被天然發現的蛋白、脂類、糖類或其它材料分開；(2)不和全部的或部分的在天然狀態下與核酸分子連接的多核苷酸連接；(3)可搮作地連接至在天然狀態下不和其連接的多核苷酸；和/或，(4)在天然狀態下不作為更大的多核苷酸序列的部分而發生。優選地，本發明的分離的核酸分子基本上不含任何其它汙染核酸分子或其它在其天然環境中發現的汙染物，所述汙染物可幹擾其在其治療、診斷、預防或研究應用中生產多肽的用途.如此處所用的，術語"天然發生的"或"天然的"或"天然發現的"，當在與生物學材料例如核酸分子、多肽、宿主細胞等相關的情況下使用時，是指天然發現的和不由人操作的材料.類似地，如此處所用的，"非然發生的"或"非天然的"是指非天然發現的或經人進行結構修飾或合成的材料.通過比較序列確定兩個或更多個核酸或多肽分子的同一性，如本領域公知的，"同一性"是指通過組成分子的單位(即，核苷酸或胺基酸殘基)之間的匹配確定的核酸分子或多肽之間的序列相關性程度.同一性用缺口比對(如果有的話)量度更小的兩個或更多個序列之間相同匹配的百分比，所述缺口比對由特定的數學模型或電腦程式(即，算法)處理.核酸序列之間的同一性也可通過相關序列與核酸序列或分離的核酸分子雜交的能力來確定.在定義這些序列時，術語"高嚴格性條件"和"中等嚴格性條件"是指允許序列互補的核酸鏈雜交並排除明顯錯配核酸雜交的方法.用於雜交和洗滌的"高嚴格性條件"的例子是0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉、在65-681C下或0.015M氯化鈉、0.0015M梓檬酸鈉，和50X甲醯胺，在42"C下，(參見，例如；Sambrook，Fritsch&Maniatis，C/o/7/i7《^Zs6(7i""t7r,船iiw/(第2版,ColdSpringHarborLaboratory,1989);Anderson等人，Aiwc/e/cJc/炒6r/(Z/s"/0/7..J戶ra"/cWJ/J!/7_ro"AC*A.4(IRLPressLimited))術語"中等嚴格性條件"是指能夠形成具有高於在"高嚴格性條件下"可發生的鹼基對錯配程度的DM雙鏈體的條件.示例性中等嚴格性條件是0.015M氯化鈉、0.0015M檸樣酸鈉，在50-65C下或0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉和20X甲醯胺、在37-50C下.通過示例方式，0.015M鈉離子、50TC的中等嚴格性條件允許大約21X的錯配.在雜交過程中，為了減少非特異性和/或背素雜交，可在雜交和洗滌緩沖液中含有其它試刑.例子是0.14牛血清清蛋白、O.W聚乙烯-吡咯烷嗣、0.1X焦褲酸鈉、0.1X十二烷基硪酸鈉、NaDodSO"(SDS)、菲可(ficoll)、Denhardt氏溶液、超聲處理的鮭精DNA(或其它非互補的DNA)和疏酸葡聚糖，雖然也可使用其它合適的試刑.可以改變這些添加刑的濃度和類型而不顯著地影響雜交條件的嚴格性，通常在pH6.8-7.4下進行雜交實驗；然而，在一般的離子強度條件下，雜交速度幾乎是不依賴於pH的.在本發明的優選的實施方案中，使用栽體將編碼多肽的核酸序列轉移至細胞中.栽體是用於將核酸分子轉移入宿主細胞的任何分子。在某些情況下，使用表達栽體.表達栽體是適合用於宿主細胞轉化和包舍指導和/或控制被轉移的核酸序列表達的核酸序列的核酸分子.表達包括，但不限於例如轉錄、翻譯和剪接(如果存在內含子的話)的過程.表達栽體通常包含一個或多個可操作地連接編碼多肽的異源核酸序列的側翼序列.側翼序列可以是例如同源的(即，來自與宿主細胞相同的物種和/或品系)、異源的(即，來自與宿主細胞物種或品系不同的物種)、雜交的(即，來自超過一種來源的側翼序列的組合)或合成的，側翼序列優選地能夠影響編碼序列的複製、轉錄和/或翻譯並且可操作地連接編碼序列.如此處所用的，術語可搮作地連接的是指功能關聯的多核苷酸元件的連接.例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼其可搮作地連接至所迷編碼序列.然而，只要其正確地發揮功能，側翼序列不一定需要與編碼序列鄰接.因此，例如，間插的非翻譯但仍轉錄的序列可存在於啟動子序列和編碼序列之間，而啟動子序列仍然可以被認為可操作地連接編碼序列.類似地，可將增強子序列置於編碼序列的上遊或下遊並且影響所述序列的轉錄.在某些實施方案中，優選地，側翼序列是轉錄調控區，其在靶細胞中驅動高水平的基因表達.所迷轉錄調控區可包含，例如，啟動子、增強子、沉默子、阻抑物元件，或其組合.轉錄調控區可以是組成型的、組織特異性的、細胞類型特異性(即，與其它的組織或細胞類型相比，所述區域在一種類型的組織或細胞中驅動更高水平的轉錄)，或可調節的(即，對與化合物例如四環素的相互作用起反應).轉錄調控區的來源可以是任何原核或真核生物、任何脊推或無脊推生物，或任何植物，前提是側翼序列通過使核酸在該細胞中轉錄在細胞中發揮作用.在實踐本發明中，可使用多種轉錄調控區.其中，合適的轉錄調控區包括CMV啟動子(即，CMV立即早期啟動子)、來自真核基因的啟動子(即，雌激素誘導型雞卵清蛋白基因、幹擾素基因、糖皮質激素誘導型酪氨酸氨基轉移蘇基因和胸苷激醉基因)和主要的早期和晚期腺病毒基因啟動子、SV40早期啟動子區域(Bernoist和Chambon，1981，Y"ffre290:304-10)、包含於勞斯肉瘸病毒USV)的3'長末端重複序列(LTR)的啟動子(Ya邁a邊oto等人，1980，Cell22:787-97)、單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-TK)啟動子(Wagner等人，1981,戶i77CJcad.Sc/.U.S.A.78:1444-45)、金屬硫蛋白基因的調控序列(Brinster等人，1982，Nature296:39-42)、原核表達栽體例如p-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978，/Vo"Sc/.U.S.A.，75:3727-31)或tac啟動子(DeBoer等人，1983，戶雄.#"入Sc/.U.S.A.，80:21-25).組織和/或細胞類型特異性轉錄控制區包括，例如，在胰腺腺泡細胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，1984，Cell38:639-46;0rnitz等人，1986，ColdSpringHarbor5>邁仏50:399-409(1986);MacDonald，1987，^e/w"/o多77:425-515)、在狹腺p細胞中具有活性的胰烏素基因控制區域(Hanahan，1985，Nature315:115-22)、在淋巴樣細胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984，Cell38:647-58;Adames等人，1985，Nature318:533-38;Alexander等人，1987，#o/.Ce//.，7:1436-44)、辛丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中的小鼠乳癌病毒控制區(Leder等人，1986,Cell45:485-95)、肝中的清蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987，^郎e;ys/wf/ew/.1:268-76)、肝中的ci-胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人，1985,Ce//.，5:1639-48;Hammer等人，1987，Sc/加ce235:53-58)、肝中的al抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987，^/wa/d"eM/.1:161-71)、骨鍵細胞中的p-珠蛋白基因控制區(Mogram等人，1985，iY"tfre315:338-40;Kollias等人，1986，Ce//46:89-94)、腦中少突膠質細胞中的號鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，1987，Cell48:703-12)、骨駱肌中的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985，#an/re314:283-86)、下丘腦中的促性腺素釋放激素基因控制區(Mason等人，1986,^c/e/ce234:1372-78)和黑素瘤細胞中的酪氨酸醃啟動子(Hart，I.SeminOncol1996Feb;23(1):154-8;Siders等人，CancerGeneTher1998Sep-0ct;5(5):281-91),其它合適的啟動子在本領城是已知的.如上所述，增強子也可適合用於側翼序列.增強子是DNA的順式作用元件，長度通常為大約10-300bp，其作用於啟動子以增加轉錄。增強子通常是非方向和位置依賴性的，且已確定其位於控制的編碼序列的5，和3，.已知幾種可從哺乳動物基因獲得的增強子序列(即，珠蛋白、彈性蛋白蘇、清蛋白、a胎蛋白和胰烏素).類似地，SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多形瘸增強子和腺病毒增強子對真核啟動子序列非常有用.儘管可將增強子在核酸編碼序列的5，或3，位置剪接入栽體，但其通常位於啟動子5'的位點.其它合適的增強子在本領域是已知的，並且可用於本發明.當製備本發明的試劑時，可能需要轉染或轉化細胞，轉染是指細胞吸收外來的或外源DNA，且當外源DNA已被導入細胞膜內側時細胞已被轉染.許多轉染技術在本領域是熟知的(即，Graham等人，1973，r/ro7o^52:456;Sambrook等人，#o7ecw/sr67o/72'/7《,>4^a6or"ory勸卯a/(ColdSpringHarborLaboratories,1989);Davis等人,A"/c#"力0&//zifo/ecw/ar(Elsevier,1986);和Chu等人，1981，Gene13:197),這些扶術可用於將一種或多種外源DM部分導入合適的宿主細胞中.在某些實施方案中，優選地，細胞的轉染導致該細胞的轉化，當細胞的特徵發生變化時，所述細胞被轉化，當其經修飾含有新的核酸時，其被轉化.轉染後，被轉染的核酸可通過物理地整合入細胞的染色體而與所述細胞的核酸發生重組，可以作為附加型元件維持瞬時轉染而不複製，或可作為質粒自主複製。當核酸隨細胞的分裂進行複製時，細胞被穗定地轉化.本發明進一步提供以多肽形式存在的分離的免疫原性靶.在如下情形中，多肽被認為是分離的(1)當從來源細胞分離時，其和至少大約50X的與其一起被天然發現的多核苷酸、脂類、糖類或其它材料分開；(2)其不和全部的或部分的在天然狀態下連接所述"分離的多肽"的多肽連接(通過共價或非共價相互作用)；(3)其可搮作地連接(通過共價或非共價相互作用)至在天然狀態下不和其連接的多肽；或，(4)其不會在天然狀態下發生。優選的，所述分離的多肽基本上不含任何其它汙染多肽或在其天然環境中發現的、將會干擾其治療、診斷、預防或研究用途的其它汙染物.免疫原性靶多肽可以是如此處所定義的成熟多肽，且可具有或可以不具有氨基末端甲疏氨酸殘基，這依賴於製備其的方法.進一步預期的是相關的多肽，例如片段、變體(即，等位基因的、剪接的)、直向同源物、同源物和衍生物，例如具有至少一種所述免疫原性靶的特徵或活性(即，反應性，抗原性)的多肽.也涉及肽，所述肽是指具有對應於至少部分多肽的序列的一系列鄰接的胺基酸殘基，其序列來源於所述多肽.在優選的實施方案中，所述肽包含大約5-10個胺基酸、10-15個胺基酸、15-20個胺基酸、20-30個胺基酸或30-50個氛基酸，在更優選的實施方案中，肽包含例如適合呈遞在I類MHC分子上的9-12個胺基酸.核酸或多肽的片段包含在氨基末端(具有或不具有前導序列)和/或羧基末端對序列的截短(即，核酸或多肽).片段也可以包括變體(即，等位基因的、剪接的)、直向同源物、同源物和其它變體，所述變體與親本序列相比具有一個或多個胺基酸添加或替代或內部缺失.在優選的實施方案中，截短和/或缺失包含大約IO個胺基酸、20個胺基酸、30個胺基酸、40個胺基酸、50個胺基酸或更多胺基酸。這樣產生的多肽片段將包含大約IO個胺基酸、25個胺基酸、30個胺基酸、40個胺基酸、50個胺基酸、60個胺基酸、70個胺基酸或更多胺基酸.這樣的多肽片段可任選地包含氨基末端甲硫氦酸殘基.應當理解，這些片段可用於例如產生針對免疫原性靶多肽的抗體或細胞免疫應答.變體是與受試者序列相比，具有一個或多個序列替代、缺失和/或添加的序列.變體可以是天然發生的或人工構建的。這些變體可從相應的核酸分子製備.在優選的實施方案中，變體具有從1至3、或從1至5、或從1至10、或從1至15、或從1至20、或從1至25、或從1至30、或從1至40、或從1至50、或超過50個胺基酸的替代、插入、添加和/或缺失.等位基因變體是佔據生物或生物群體的染色體上給定的基因座的基因的幾種可能天然發生的供替換的形式的一種.剪接變體是從幾種由初級轉錄物的剪接產生的RNA轉錄物中的一種產生的多肽.直向同源物是來自另一物種的相似的核酸或多肽序列.例如，免疫原性靶多肽的小鼠和人版本可以被認為是相互之間的直向同源物，序列的衍生物是來源於親本序列的序列，這些序列具有替代、添加、缺失或化學修飾變體.變體也可以包括融合蛋白，其是指一個或多個第一序列(例如肽)在至少一個其它序列(例如異源肽)的氨基或羧基末端的融合."相似性"是與同一性相關的概念，只是除了相似性是指包括相同匹配和保守替代匹配的相關性的量度.如果兩個多肽序列具有，例如，10/20相同的胺基酸，並且剩餘的全部是非保守替代，那麼百分比同一性和百分比相似性都是50X.如果在相同的例子中，有另外5個位置是保守替代，那麼百分比同一性仍然是50、而百分比相似性是75X(15/20)。因此，在存在保守替代的情況下，兩個多肽之間的百分比相似性將高於這兩個多肽之間的百分比同一性.替代可以是保守的或非保守的，或是其任何組合.對多肽序列的保守性胺基酸修飾(和對應的對編碼核苷酸的修飾)可產生具有與親本多肽相似的功能和化學特性的多肽.例如，"保守胺基酸替代"可包括天然胺基酸殘基被非天然殘基的替代，這樣在該位置上對氛基酸殘基的大小、極性、電荷、疏水性或親水性影響很小或沒有影響，並且特別是不會導致減少的免疫原性.合適的保守胺基酸替代顯示於表I,tableseeoriginaldocumentpage17本領域技術人員通過使用熟知的技術能夠確定合適的多肽變體.為確定可被改變而不破壞生物學活性(即，MHC結合、免疫原性)的合適的分子區域，本領域技術人員可靶向據信對該活性不重要的區域.例如，當已知具有相似活性的來自相同物種或來自不同物種的相似多肽時，本領域技術人員可將多肽的胺基酸序列與該相似的多肽進行比較.通過進行這種分析，人們可確定在相似多肽中保守的殘基和分子的部分.應當理解，相對於這些相似多肽，不保守的分子區域內的變化將不太可能不利地影響多肽的生物學活性和/或結構。類似地，而要用於結合MHC的殘基是已知的，並且可經修飾從而提高結合.然而，導致與MHC結合下降的修飾在大多數情況下是不適當的，本領域技術人員也知道，即使在相對保守的區域，人們也可用化學上相似的胺基酸取代天然發生的殘基而仍保持活性.因此，即使對生物學活性或結構很重要的區域，也可接受保守性胺基酸替代而不破壞生物學活性或不會不利地影響多肽結構.其它優選的多肽變體包括糖基化變體，其中相對於受試者胺基酸序列，糖基化位點的數目和/或類型已發生了改變.在一個實施方案中，多肽變體包含比受試者胺基酸序列更多或更少數目的N-連接的糖基化位點.N-連接的糖基化位點的特徵在於Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中稱為X的胺基酸殘基可以是除了脯氨酸外的任何胺基酸殘基.產生該序列的胺基酸殘基的替代提供了潛在的用於添加N-連接的糖鏈的新位點.可選擇地，除去該序列的替代將消除已存在的N-連接的糖鏈.也提供了N-連接的糖鏈的重排，其中一個或多個N-連接的糖基化位點(一般是天然發生的位點)被消除而一個或多個新的N-連接的位點產生.為影響多肽的0-連接的糖基化，人們可修飾絲氨酸和/或蘇氨酸殘基.另外的優選的變體包括半胱氦酸變體，其中與受試者胺基酸序列組相比，一個或多個半胱氨酸殘基被缺失或用另一個胺基酸(例如，絲氛酸)替代.當多肽必須重新摺疊回生物學活性的構象時，例如在分離不溶性內含體後，半胱氨酸變體是有用的.半胱氨酸變體通常具有比天然蛋白更少的半胱氨酸殘基，並且一般具有將由未配對的半胱氨酸產生的相互作用最小化的精確數目.在其它實施方案中，本發明的分離的多肽包括幫助純化所述多肽的融合多肽片段.可在其受試者多肽變體的氨基末端或羧基末端進行融合.融合可直接進行而不用接頭或銜接分子或可通過接頭或銜接分子進行.接頭或銜接分子可以是一個或多個氛基酸殘基，通常是從大約20至大約50個胺基酸殘基.接頭或銜接分子也可被設計為具有DNA限制性內切核酸酶或蛋白酶的切割位點以使被融合的部分分開.應當理解，一旦構建，就可按照此處描述的方法衍生化融合多肽，其中，合適的融合片段包括金屬結合結構域(例如，多組氨酸片段)、免疫球蛋白結合結構域(即，A蛋白、G蛋白、T細胞、B細胞、Fc受體或補體蛋白抗體結合結構城)、糖結合結構域(例如，麥芽糖結合結構域)和/或"標記"結構域(即，至少a半乳糖苷酶的部分、strep標記肽、T7標記肽、FLAG肽或其它結構域(所迷結構域通常可使用結合所述結構域的化合物例如單克隆抗體進行純化)).在多肽表達後，該標記通常融合入所迷多肽，並且可用作從宿主細胞中親和純化目的多肽序列的工具.親和純化可通過例如使用抗所述標記的抗體作為親和基質的柱層析來進行。任選地，隨後通過各種方法，例如使用某些用於切割的肽酶，可將標記從純化的目的多舦序列中除去.如下面所描述的，也可以在例如TA和共刺激組分例如趨化因子(薄膜(E1)的物性)對薄膜(E1)進行DSC測定、廣角X射線衍射(WAXS)測定和原子力顯微鏡(AFM)測定。DSC測定的結果如圖1所示。圖1中的實線為薄膜(E1)的DSC曲線。圖1中的虛線為比較例1中得到的薄膜(C1)的DSC曲線。薄膜(C1)的熔點約為170°C，而薄膜(E1)的熔點為209.4°C，可知由本發明可得到耐熱性高的薄膜。薄膜(E1)的立體複合物的含量為76.1%,195。C以上的熔融峰的比例為69.1%。薄膜(E1)的WAXS測定中，在20角12。、21°和24。可見衍射峰，與在18.5。和22.5。出現的聚-L-乳酸的晶體衍射峰不同，可以確認形成了立體複合物。薄膜(E1)表面的AFM測定結果如圖2所示。可知薄膜(E1)具有平滑的表面結構。實施例2(聚-L-乳酸的水性乳液的製備)在IO(TC下，將100份聚-L-乳酸(PLLA:分子量=71,000)溶解於460份甲苯中，然後冷卻至8(TC，加入20份乳化劑(聚氧乙烯垸基醚硫代琥珀酸)和1,000份蒸餾水。在75'C下攪拌1小時，進行預乳化，然後施加1小時以上的超聲波，進行乳化。然後通過旋轉蒸發器進行減壓蒸餾，得到固體成分10%、平均粒徑為0.3pm的聚-L-乳酸乳液(以下稱為溶液(L2))。(聚-D-乳酸的水性乳液的製備)使用聚-D-乳酸(PDLA:分子量=75,000)，除此之外重複同樣的操作，得到固體成分為10%、平均粒徑為0.3pm的聚-D-乳酸的水性乳液(以下稱為溶液(D2))。(混合乳液的製備)將所得溶液(L2)和溶液(D2)按照重量比1:1混合，得到混合乳液。(CD137;Vinay等人，^e邁/z/咖咖/1998，10:481-489)、OX40(CD134;Weinberg等人，J咖//7/廳加/1998,10:471-480;Higgins，等人，///MW70/1999，162:486-493)和CD27(Lens等人，^e邁/iiij敏咖(7/1998，10:491-499))的多肽，例如4-1BBL(4-1BB配體；Vinay等人，^e邁y//咖咖/1998，10:481-48;DeBenedette等人，//逝邁做o/1997，158:551-559)、TNFR關聯因子-1(TRAF-1;4-lBB配體；Saoulli等人，/^r/#e(/1998，187:1849-1862，Arch等人，ilfo/6W/1998，18:558-565)、TRAF-2(4-1BB和0X40配體；Saoulli等人，JExpMed1998，187:1849-1862;0shima等人，//1998，10:517-526，Kawamata等人，JBiolChem1998,273:5808-5814)、TRAF-3(4-1BB和0X40配體；Arch等人,MolCellBiol1998，18:558-565;Jang等人，"/oc力戰WoMr"e^yCo鵬咖1998,242:613-620;KawamataS等人，"/o/(7力戰1998，273:5808-5814)、OX40L(0X40配體；Gra邊aglia等人，//必巡〃27071998，161:6510-6517)、TRAF-5(0X40配體；Arch等人，MolCellBiol1998，18:558-565;Kawa咖ta等人，JBiolChe邁1998，273:5808-5814)和CD70(CD27配體；Couderc等人，CancerGeneTher.，5(3):163-75).CD154(CD40配體或"CD40L";Gurunathan等人,/./咖卿/.，1998，161:4563-4571;Sine等人，#"邁.(7加er力er.，2001,12:1091-1102)也是適合的，作為多肽或由本發明的組合物包含的核酸編碼的一個或多個細胞因子也可以是合適的共刺激組分或"佐刑"(Parmiani等人，ImmunolLett2000Sep15;74(1):"-4;Berzofsky等人，NatureImmunol.1:209-219).合適的細胞因子包括，例如，白細胞介素-2(IL-2)(Rosenberg等人，#"wre4:321-327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(參閱Pardoll，1992的綜述；Harries等人，/.(7e/e2000Ju卜Aug;2(4):243-9;Rao等人，/./邊邁"/0人156:3357-3365(1996))、IL-15(Xin等人，&cc//ze,17:858-866，1999)、IL-16(Cruikshank等人，/.67(6):757-66，2000)、IL-18(/(7a腳r細.0歸/.2001.127(12):718-726)、GM-CSF(CSF(Disis等人，Blood,88:202-210(1996))、腫瘤壞死因子a(tnf-tt)或幹擾素y(inf-y).如本領域公知的，其它細胞因子也可以適合用於實踐本發明.也可使用趨化因子.例如，已顯示包含融合至腫瘸自身抗原的CXCL10(IP-10)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白誘導抗肺瘤的免疫(Biragyn等人，1999，17:253-258).趁化因子CCL3(MIP-la)和CCL5(RANTES)(Boyer等人，&cc//ze，1999,7(Supp.2):S53-S64)也可用於實踐本發明.其它合適的趨化因子在本領域是已知的，在本領域也已知可阻斷抑制性或負調控免疫機制，從而導致增強的免疫應答.例如，使用抗CTLA-4(Shrikant等人，//maw//",1996，14:145-155;Sutmuller等人，/.^r/7.#e(f.，2001，194:823-832)、抗CD25(Sutmuller,同上)、抗CD4(Matsui等人，/.//mw"o/.,1999，163:184-193)、融合蛋白IL13Ra2-Fc(Terabe等人，#"z/re/咖咖/.，2000,1:515-520)和其組合(即，抗CTLA-4和抗CD25,Sutmuller，同上)的處理已顯示上調抗腫瘤免疫應答，且適合用於實踐本發明.這些組分中的任一種可單獨地使用或與其它試劑聯合使用.例如，已顯示CD80、ICAM-1和LFA-3("TRICOM")的組合可加強抗癌免疫應答(Hodge等人，Ca/zcer59:5800-5807(1999),其它有效的組合包括，例如，IL-12+GM-CSF(Ahlers等人，/.Timzw/zo/.，158:3947-3958(1997);Iwasaki等人，/./邁邁咖/.158:4591-4601(1997))、IL-12+GM-CSF+TNF-a(Ahlers等人，/乾/咖咖/.13:897-908(2001))、CD80+IL-12(Fr訓d等人，/.85:508-517(2000);Rao等人，同上)和CD86+GM-CSF+IL-12(Iwasaki，同上).本領域技術人員知道另外的用於實施本發明的組合.此外，本領域技術人員知道另外的可用於調節這些機制的試劑或方法.這些試刑和方法，以及其它本領域技術人員已知的試劑和方法可用於實踐本發明.也可使用另外的用於提高基於核酸的免疫效力的策略，其包括，例如，使用自我複製的病毒複製子(Caley等人，1999.17:3124-2135;Dubensky等人，2000..6:723-732;Leitner等人，2000.Ca/cer^w.60:51-55)、密碼子最優化(Liu等人，2000.7er.，1:497-500;Dubensky，同上；Huang,等人，2001./.J7i"0/.75:4947-4951)、體內電穿孔(Widera等人，2000././鵬做o/.164:4635-3640)、整合CpG剌激基元(Gurunathan等人，j/mz.紐./咖咖/.，2000，18:927-974;Leitner，同上)、用於靶向內吞或遍在蛋白加工途徑的序列(Thomson等人，1998./.r/ro/.72:2246-2252;Velders等人，2001.//邊邁tf/70/.166:5366-5373)、引發(prime)-加強方案(Gurunathan，同上jSullivan等人，2000.iV"we，408:605-609;Hanke等人,1998,&cc//e，16:439-445;A咖ra等人，2001.^c/e/ce，292:69-74)和使用黏膜遞送栽體例如沙門氏菌(&/巡做<//*)(Darji等人，1997.Cell,91:765-775;Woo等人，2001.racc/ue,19:2945-2954)。其它方法在本領域是已知的，其中一些方法在下面進行描迷.通過使用免疫原性靶也可使用化學治療刑、輻射、抗血管生成化合物或其它試刑治療和/或預防癌症(Sebti，等人，Oncogene2000Dec27;19(56):6566-73).例如，在治療轉移性乳腺癌中，其中有用的化學治療劑包括環磷醯胺、阿審素、紫杉醇、多西他賽、諾維本、卡培他濱和絲裂黴素C.也已證明組合化學治療方案是有效的，其包括例如環磷醯胺+氨甲蝶呤+5-象尿嘧啶、環砩酜胺+阿黴素+5-象尿嘧啶或環砩醯胺+阿審素.因各種原罔，已使用了其它化合物例如強的松、Uxane、諾維本、絲裂審素C或長春鹼，大部分乳腺癌患者具有雌激素受體陽性(BR+)腫瘤並且在這些患者中，內分泌治療法(即，他莫昔芬)優於化學治療法.對於這些患者，他莫昔芬或作為二線治療的孕稱(醋酸甲羥孕酮或醋酸甲地孕網)是優選的。芳化酶抑制刑(即，氛普米特和其類似物例如來曲唑)降低了需要用於維持腫瘤生長的雌激素的有效性，且在某些患者中可用作二或三線內分泌治療法.其它癌症可要求不同的化學治療方案.例如，一般單獨地或相互組合在一起地用伊立替康(Camptosar)(伊立替康(irinotecan)或CPT-ll)、5-氣尿嘧啶或甲醯四氬葉酸治療轉移性結脈直腸癌.蛋白酶和整聯蛋白抑制刑例如MMP抑制劑marimastate(BritishBiotech)、C0L-3(Collage認)、Neovastat(Aeterna)、AG3340(Agouron)、BMS-275291(BristolMyersSquibb)、CGS27023A(Novartis)或整聯蛋白抑制劑Vitaxin(Medimmune)或MED1522(MerckKgaA)也可適合使用.同樣地，可與使用這些化學治療刑的治療聯合進行結腸直腸癌相關的免疫原性靶的免疫學靶向.類似地，用於治療其它類型的癌症的化學治療劑在本領域是熟知的並且可與此處描述的免疫原性靶組合.許多抗血管生成劑在本領域是已知的並且適合與免疫性靶疫苗共同施用(參見，例如，Timar等人，2001.戶"A0/0,7^co厶b.，7(2):85-94).這類試刑包括，例如，生理試刑例如生長因子(即，ANG-2、NK1，2,4(HGF)、轉化生長因子p(TGF-p))、細胞因子(即，千擾素例如ifn-a,-p，-y、血小板因子4(pf-4)、pr-39)、蛋白酶(即，經切割的AT-III、膠原蛋白XVIII片段(內皮抑制素(Endostatin)))、HmwKal1ikrein-d5纖溶酶片段(血管抑素(Angiostatin))、凝血酶原-Fl-2、TSP-1)、蛋白蘇抑制劑(即，金屬蛋白酶的組織抑制刑例如TIMP-l，-2或-3、maspin、纖溶酶原激活物抑制劑例如PAI-1、色素上皮來源的因子(PEDF))、Tu邁statin(可通過ILEX,Inc.商購獲得)、抗體產物(即，膠原蛋白結合抗體HUIV26、HUI77、XL313;抗VBGF;抗整聯蛋白(即，Vitaxin，(Lxsys)))和糖苷酶(即，肝素酶-i，-iii).已知或據信具有抗血管生成潛能的"化學物質"或經修飾的生理試刑包括，例如，長春鹼、紫杉醇、嗣康峻、沙利度胺、dolestatin、combrestatinA、雷伯審素(Guba等人，2002，y"i/rei^/.，8:128-135)、CBP-7055(可從Cephalon，Inc.商購)、黃酮乙酸、Bay12-9566(BayerCorp.)、AG3340(Agouron,Inc.)、CGS27023A(Novartis)、四環素衍生物(即，C0L-3(Collagenix，Inc.))、Neovastat(Aeterna)、BMS-275291(Bristol-MyersSquibb)、低刑量的5-FU、低劑量氨甲蝶呤(MTX)、irsofladine、根赤殼菌素、環孢菌素、卡託普利、塞來昔布、D45152-疏酸化多糖、陽離子蛋白(魚精蛋白)、陽離子肽-VEGF、Suramin(聚橫酸化萘脲(polysulphonatednapthylurea))、幹擾VEGF功能或生產的化合物(即，SU5416或SU6668(Sugen)、PTK787/ZK22584(Novartis))、偏端審素A、Angiozyme(核醃)、isoflavinoids、顯形孢菌素衍生物、染料木黃稱、EMD121974(MerckKcgaA)、酪氨酸磷酸化抑制劑、異喹諾酮(isoquinolone)、視黃酸、羧醯胺三唑(carboxyamidotriazole)、TNP-470、善得定、2甲氧基雌二醇、氨基固醉(aminosterol)(即，角鯊胺(squalamine))、穀胱甘肽類似物(即，N-乙醯-L-半胱氨酸)、combretastatinA-4(Oxigene)、Eph受體阻斷刑(化fwe，414:933-938，2001)、Rh-血管抑素、Rh-內皮抑制素(WO01/93897)、環-RGD肽、accutin-disintegrin、benzodiazepenes、人源化的抗avb3Ab、Rh-PAI-2、阿米洛利、p-酖氨基節脒、抗uPAab、抗uPARAb、L-phanylalanin-N-甲耽胺(即，巴馬司他、馬馬司他)、AG3340和二甲胺四環素，許多其它合適的試劑在本領域是已知的並且足以滿足實踐本發明.本發明也可與"非常規"的治療癌症的方法聯合使用.例如，近來證實施用某種厭氣細菌可幫助減緩腫瘤生長.在一個研究中，將諾氏梭菌OVoW/7(f/咖加JT/)進行修飾以消除噬菌體附加體上攜帶的毒素基因並將其給患有結煬直腸癌的小鼠施用(Dang等人，P.N.A.S.USA，98(26):15155-15160，2001).與化學治療法相聯合，所述治療在動物中顯示導致腫瘸壞死.在本申請中描述的試刑和方法學可與這些治療方法學聯合，可通過幾種可獲得的技術中的任一種將編碼免疫原性靶的核酸給患者施用.其中，各種已成功地用於將核酸導入宿主的病毒栽體包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒和痘病毒。在本領域中應當理解，在領域中可獲得許多這樣的病毒栽體.通過使用本領域技術人員可廣泛獲得的標準重組技術可構建本發明的栽體.可在普通分子生物學參考資料例如iVb/ecWar^Vo///^.'JZa6ojr"o/y勸加a/(Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)、<e/ze^rpre^/o/7ec力i3o/og/(MethodsinEnzymology,第185巻，D.Goeddel編著,1991.AcademicPress,SanDiego,CA)和PCRProtocols:J<7i//r//7#齡6.^/a/7L^/o/.，59:685-90);Oldfield,E.，1993，#咖.(7幼er力".，4(1):39-69).工程改造生產者細胞系以在靶細胞附近產生病毒栽體和釋放病毒顆粒.部分釋放的病毒顆粒接觸靶細胞並感染這些細胞，從而將本發明的核酸遞送給靶細胞.在感染靶細胞後，栽體的核酸發生表達.已證明腺病毒栽體在將基因轉移入真核細胞中(Rosenfeld，M.等人，1991,Jc/e/ce，252(5004):431-4;Crystal,R.等人，1994，6^22et，8(1):42-51)、在研究真核基因表達中(Levrero，M.等人，1991,Ce/ze，101(2):195-202)、在疫苗開發中(Graham,F.和Prevec，L.,1992，Biotechnology,20:363-90)和在動物模型中(Stratford-Perricaudet，L,等人，1992，細e勸riw7y謝p/a/7f.,9(Suppl.1):151-2;Rich,D.等人，1993，Hum.GeneTher.，4(4):461-76)特別有用.其中，將重組Ad在體內施用到不同組織中的實驗途徑包括氣管內滴注(Rosenfeld,M,等人，1992，Cell,68(l):143-55)注射入肌肉(Quantin,B.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7):2581-4)、外周靜脈內注射(Herz，J.和Gerard,R.，1993,/Voc.U.S.A.,90(7):2812-6)和對腦的趨實體接種(LeGalLaSalle,G.等人，1993，Science,259(5097):988-90).腺伴隨病毒(AAV)顯示在整合入宿主細胞基因組上具有高水平感染性、廣泛的宿主範圍和特異性(Hermonat，P.等人，1984，/Voc.JcaA&/，U.S.A.,81(20):6466-70).而1型單純皰滲病毒(HSV-1)卻是另一種具有吸引力的栽體系統，由於其向神經的特性，其特別適用於神經系統(Geller，A.等人，1991，7>郎"細旭c/.，14(10):428-32;Glorioso等人，1995，#o/.及/0/ec力"o/.，4(1):87-99;Glorioso等人，1995，J/肌及e^#/"o6/a/，49:675-710).疽病毒是另一種有用的表達栽體(Smith等人，1983，Gene，25(1):21-8;Moss等人，1992，A/ofecA/zo/o#/，20:345-62;Moss等人，1992，Ci/rr.7"o;,W/croWo厶/咖卿/.，158:25-38;Moss等人，1991.^c/e/ce:1662-1667).其中，顯示有用的痘病毒包括牛痘病毒、NYVAC、禽痘病毒(avipox)、禽疽病毒(fowlpox)、canarypox、ALVAC和ALVAC(2)。牛痘病毒是疽病毒科的原型病毒，且和其它疽病毒組的成員一樣，通過其較大尺寸和複雜度進行區別.牛痘病毒的MA類似地巨大和複雜.幾種類型的牛痘適合用於實踐本發明.一種這樣的牛痘相關病毒是經修飾的牛痘病毒Ankara(MVA),如在例如美國專利號5，185，146和6,440，422中描述的。另一種合適的牛疸相關病毒是NYVAC,NYVAC是通過缺失編碼已知的或潛在的毒力因子的基因組的6個非必需區域而來源於牛痘病毒的Copenhagen疫苗品系的(參見，例如，美國專利號5，364，773和5，494，807)。缺失的基因座也被工程改造為插入外源基因的受體基因座.被缺失的區域是胸苷激酶基因(TK;J2R)、出血性區域(u;B13R+B14R)、A型內含體區域(ATI;A26L)、血凝素基因(HA;A56R)、宿主範圍基因區域(C7L-K1L)和核糖核苷酸還原酶大亞基(I4L).NYVAC是通過特異性缺失18個編碼與毒力和宿主範閨相關的基因產物的可讀框而產生的、經遣傳工程改造的牛痘病毒品系，已顯示NYVAC用於表達TAs(參見，例如，美閨專利號6,265,189).在布達佩斯條約(BudapestTreaty)下，也由ATCC保藏NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB，保藏號分別為VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914.基於ALVAC的重組病毒(即，ALVAC-1和ALVAC-2)也適合用於實踐本發明(參見，例如，美國專利號5，756，103).ALVAC(2)與ALVAC(l)相同，只是除了ALVAC(2)基因組包含在牛疽啟動子控制下的牛痘E3L和K3L基因(美國專利號6,130,066;Beattie等人，1995a，1995b，1991;Chang等人，1992;Davies等人，1993).ALVAC(l)和ALVAC(2)都已證實用於表達外源DM序列，例如TAs(TarUglia等人，1993a,b;美閨專利號5，833，975).ALVAC在布達佩斯條約下由美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209，美國保藏，ATCC保藏號為VR-2547,另一個有用的疽病毒栽體是TROVAC.TROVAC是減毒的禽痘病毒，其是來源於禽痘病毒的FP-1疫苗品系的噬斑克隆的分離物，其被準許用於接種1天大小的雞.TROVAC同樣在布達佩斯條約下由ATCC保藏，保藏號為2553."非病毒"質粒栽體也可適合於實踐本發明.優逸的質粒栽體與細菌、昆蟲和/或哺乳動物宿主細胞相容.這些栽體包括，例如，PCR-II、pCR3和pcDNA3,1(Invitrogen，SanDiego，CA)、pBSII(Stratagene，LaJolla，CA)、p醜T15(Novagen,Madison,WI)、pGEX(PharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech,PaloAlto，CA)、pET"BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-a(PCT公開號W090/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)和Bluescript質粒衍生物(高拷貝數目的基於C0LE1的噬菌粒，StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)、設計用於克隆Taq擴增的PCR產物的PCR克隆質粒(例如，TOPOTAcloning⑧試劑盒，PCR2.1@質粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad,CA).細菌栽體也可用於本發明.這些栽體包括，例如，志賀氏菌屬(幼^e/")、沙門氏菌屬(Salmonella)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、卡介苗(BCG)和鏈球菌屬(Streptococcus(參見，例如，WO88/6626、WO90/0594、WO91/13157、WO92/1796和WO92/21376).許多其它的非病毒質粒表達栽體和系統在本領域是已知的並且可用於本發明.其中，合適的核酸遞送技術包括DNA-配體複合物、腺病毒-配體-DNA複合物、直接注射DNA、CaPO,沉澱、基罔槍技術、電穿孔和膠態分散體系統.膠態分散體系統包括大分子複合物、納米膠嚢(nanocapsule)、小球體、珠和基於脂質的系統，包括水包油乳刑、微團、混合微團和脂質體.本發明的優選的膠態系統是脂質體，其是在體外和體內用作遞送媒介物的人造膜小泡.可將RNA、DM和完整的病毒體被囊化入含水的內部並以生物學活性形式遞送至細胞(Fraley,R.等人，1981,rre油A/ocAe邁.,6:77),脂質體的組合物通常是砩脂，特別是高相變溫度磷脂的組合，其通常與類固醇特別是膽固酵組合.也可使用其它砩脂或其它脂類。脂質體的物理特性依賴於pH、離子強度和二價陽離子的存在.用於脂質體生產的脂類的例子包括磷脂耽化合物，例如褲脂醯甘油、砩脂醯膽鹼、褲脂醯絲氛酸、褲脂醯乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經節苷脂，特別有用的是二醯基鱗酯醯甘油，其中脂類部分含有14-18個破原子，特別是16-18個碳原子，並且是飽和的.示例說明性鱗脂包括印罅脂跌膽械、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼和二硬脂耽砩脂跣膽鹼.也可將免疫原性靶和一種或多種佐刑聯合施用以加強免疫應答.示例性佐刑顯示於下列表I中免疫原性佐劑的類型佐劑類型一般例子特定例子/參考資料1.凝膠類型氳氣化鋁/磷酸鋁("鋁佐劑")(Aggerbeck和Heron，1995)鱗酸鉀(Relyveld,1986)2.微生物胞壁醯二肽(MDP)(Chedid等人，1986)細菌外毒素霍亂毒素(CT)，大腸桿菌(Aco〃)不穗定毒素(LT)(Freytag和Clements,1999)基於內毒素的佐刑單鱗醯脂類A(MPL)(Ulrich和Myers,1995)表I(續)tableseeoriginaldocumentpage29本發明的免疫原性靶也可用於產生用於篩選測定法或用於免疫治療法的抗體.其它用途對本領域技術人員來說是顯而易見的.術語"抗體"包括抗體片段，如本領域公知的，包括Fab、Fab"單鏈抗體(例如Fv)、人源化的抗體、嵌合抗體、人抗體，其由本領域公知的幾種方法產生.製備和利用各種類型抗體的方法對本領域技術人員來說是熟知的，並且可適用於實踐本發明(參見，例如，Harlow等人，Antibodies:乂Za6or"or/他/zf/a/，ColdSpringHarborLaboratory,1988;Harlow等人，^s7/7《y</7〃6o(//w"a6or"o/yy(fe/7f/a/,戶or"67e戶rofoco/Mo.1，1998;Kohler和Milstein，Nature,256:495(1975));Jones等人，Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature,332:323-329(1988);Presta(Curr,Op.Struct.Biol,，2:593-596(1992)jVerhoeyen等人，(Science,239:1534-1536(1988);Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581(1991)'.Cole等人,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985);Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991);Marks等人，Bio/Technology10，779-783(1992);Lonberg等人，Nature368856-859(1994)jMorrison,Nature368812-13(1994);Fishwild等人，NatureBiotechnology14，845-51(1996hNeuberger，NatureBiotechnology14，826(1996)jLonberg和Huszar，Intern.Rev.Im咖nol.1365-93(1995);和美國專利號4,816,567、5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661，016).也可將抗體或其衍生物綴合至治療性部分例如細胞毒性藥物或毒素，或其活性片段，其中例如，diptheriaA鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、盼審素、伊諾審素.細胞毒性刑也可包括放射化學試劑.抗體和其衍生物可整合入用於在體外或體內使用的本發明的組合物中.代表免疫原性靶的核酸、蛋白或其衍生物可用於在患者中確定疾病狀態存在、預測預後或確定化學治療法或其它治療方案有效性的測定中.表達特徵，如按本領域已知方法進行的，可用於確定免疫原性靶表達的相對水平.因此將表達水平與基礎水平相比較以確定患者是否存在特定的疾病、確定患者的預後或確定特定的治療方案是否有效。例如，如果對患者使用特定的化學治療方案進行治療，那麼患者組織(即，在外周血中)中免疫原性靶的表達水平下降可表明該方案在該患者中減少癌症負擔.類似地，如果表達水平增加，那麼可能需要採用另一種治療方式.在一個實施方案中，如在本領域中已知的，可將對應於編碼免疫原性靶的核酸的核酸探針附著在生物晶片上，以用於檢測和定量宿主中的表達.也可能在藥物歸選測定法中使用核酸、蛋白、其衍生物或針對其的抗體作為試劑.所迷試劑可用於確定藥物候選物對細胞系、或患者的細胞或組織中的免疫原性靶的表達的作用。確定表達特徵的技術可與高通量篩選技術組合以允許快速筌定有用的化合物和監控使用藥物候選物進行治療的有效性(參見，例如，Zlokarnik，等人，Science279,84-8(1998))藥物候選物可以是化合物、核酸、蛋白、抗體或其衍生物，無論是天然發生的還是合成的.除其他用途以外，由此鑑定的藥物候選物可用作給患者施用或用於進一步篩選測定法的藥物組合物.對宿主施用本發明的組合物可通過使用本領域技術人員已知的許多技術中的任一種來實現。可根據常規的藥刑學方法加工組合物以產生用於給患者(包括人和其它哺乳動物)施用的藥劑(即，"藥物組合物")。優選地以例如含有給定量的DNA、病毒栽體顆粒、多肽或肽的刑量單位形式製備藥物組合物。針對人或其它哺乳動物的合適的每日劑量可依賴於患者的狀況和其它因素而產生很大變化，但，可再次使用常規方法進行確定，藥物組合物可經口、煬胃外、通過吸入噴霧、經直腸、結內(intranodally)或局部以含有常規藥物可接受栽體、佐劑和媒介物的劑量單位製劑的形式施用，此處使用的術語"藥物可接受栽體"或"生理學可接受栽體"是指一種或多種適合用於實現或增強將核酸、多肽或肽作為藥物組合物進行遞送的制刑材料."藥物組合物"是包含治療有效重的核酸或多肽的組合物.術語"有效量"和"治療有效量"各指用於誘導或增強有效免疫應答的核酸或多肽的量.優選地本發明的組合物在宿主中誘導和增強抗腫瘤免疫應答，所迷免疫應答保護宿主免受腫瘤的發展和/或允許宿主從體內消除已存在的腫瘤.對於經口施用，藥物組合物可以是幾種形式中的任一種，其中所述形式包括，例如，膠嚢、片刑、懸浮液或液體.液體可作為具有合適的栽體(包括鹽水、葡萄糖或水)的組合物通過注射施用.如此處所用的，術語腸胃外包括皮下、靜脈內、肌內、胸骨內、輸注或腹膜內施用。用於藥物的直煬施用的栓刑可通過將所述藥物與合適的非刺激性賦形劑例如可可脂和聚乙二醇進行混合來製備，所述賦形刑在常溫下是固體而在直腸溫度下是液體.使用本發明的組合物免疫宿主或另外治療病症或疾病的刑量方案基於各種因素，其包括患者的疾病類型、年齡、體重、性別、醫學狀況、狀況的嚴重性、施用途徑和具體使用的化合物.例如，痘病毒栽體可以以每刑含有lxl(^個感染性顆粒的組合物進行施用.因此，劑重方案可以發生很大變化，但可通過使用標準方法進行常規確定.也可使用引發-加強方案(W001/30382Al),其中最初以一種形式在引發步稞中施用被靶向的免疫原，之後進行加強步驟，其中以另一種形式施用所述被靶向的免疫原.在引發和加強步騍中的被靶向的免疫原的形式不同.例如，如果引發步壤使用核酸，那麼加強步驟可施用肽，類似地，當引發步驟使用一種類型的重組病毒(即，ALVAC)，那麼加強步驟可使用另一種類型的病毒(即，NYVAC).該引發-加強施用方法已顯示誘導出強免疫應答.儘管本發明的組合物可以作為單一的活性藥物刑施用，但其也可與一種或多種其它組合物或試刑(即，其它免疫原性靶、共刺激分子、佐劑)聯合施用.當作為組合施用時，單個組分可以以分開的在相同時間或不同時間施用的組合物形式配製，或組分可以以單一組合物形式組合在一起.可注射的制刑，例如無菌可注射水性或油質悉浮液，可使用合適的分散刑或溼潤刑和懸浮劑按照已知的方法進行配製.可注射的制刑也可以是在非毒性麻胃外可接受稀釋刑或溶刑中的無菌可注射溶液或懸浮液.其中，可使用的合適的媒介物和溶劑是水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。例如，可在NaCl中製備病毒栽體例如疽病毒.此外，可常規地將無菌的固定油用作溶劑或懸浮介質.為此，可使用任何剌激性少的固定油，包括合成的甘油羊酶或甘油二fil.此外，脂肪酸例如油酸用於可注射製劑的製備.對於局部施用，合適的組合物局部刑量可每天施用l至4次，優選地2或3次.也可間隔數天施用劑量，在間隔天數期間不施用刑量.按製劑的重量計算，合適的組合物可佔0.001%至10Xw/w，例如l4至2X，儘管其可佔到最多達10Xw/w，但優選地不超過w/w，更優選地佔制刑的0.1X至IX,適合用於局部施用的製劑包括適合穿透皮膚的液體或半液體制刑(例如，搽劑、洗劑、軟奮、乳骨或糊劑)和適合眼、耳或鼻施用的滴劑.藥物組合物也可以固體形式(包括顆粒、粉末或栓劑)進行製備.藥物組合物可接受常規的藥物操作例如滅菌和/或可含有常規佐劑，例如防腐劑、穗定劑、溼潤刑、乳化劑、緩衝液等.用於經口施用的固體劑重形式可包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒.在這些固體刑量形式中，活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑例如蔗糖、乳糖或澱粉混合，如在正常的實踐中那樣，這些劑量形式也可包含除了惰性稀釋劑外的另外的物質，例如，潤滑劑例如硬脂酸鎂.在膠囊、片劑和丸劑的情況下，刑量形式也可以包含緩衝劑.可用腸溶性包衣另外製備片劑和丸刑.用於經口施用的液體刑量形式可包括包含通常用於本領域的惰性稀釋刑例如水的藥物可接受乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和貤劑.這些組合物也可以包含佐劑例如溼潤增甜刑、調味刑和加香劑.包含本發明的核酸或多肽的藥物組合物可採用幾中形式中的任一種和可通過幾種途徑中的任一種途徑進行施用施用.在優選的實施方案中，通過腸胃外途徑(皮內、肌內或皮下)施用組合物以在宿主中誘導免疫應答.可選擇地，可將組合物直接施用入淋巴結(結內)或腫瘤塊(即，瘤內施用).例如，可在笫0、7和14天皮下施用劑量，使用包含TAs的組合物進行免疫的合適方法在本領域是已知的，其中如，對p53(Hollstein等人，1991)、p21-ras(Almoguera等人，1988)、HER-2(Fendly等人，1990)、黑素瘤相關的抗原(MAGE-1、MAGE-2)(vanderBruggen等人，1991)、p97(Hu等人，1988)和癌胚抗原(CBA)(Kantor等人，1993;Fishbein等人，1992;Kaufman等人，1991)所顯示的.優選的可施用的組合物的實施方案包括，例如，液體製劑例如懸浮液、糖漿或醜刑中的核酸或多肽.優選的可注射的制刑包括，例如，適合於腸胃外、皮下、皮內、肌內或靜脈內施用的核酸或多肽，例如其滅菌的懸浮液或乳劑.例如，重組疽病毒可與合適的栽體、稀釋劑或賦形劑例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等混合.組合物也可以凍幹的形式提供，以便在例如等滲水性鹽水緩衝液中重構.此外，組合物可與其它抗癍刑、抗腫瘸劑或抗癌劑和/或與降低或減輕抗瘰刑、抗胖瘤刑或抗癌刑的有害作用的試刑共同施用或按順序施用.也提供了包含本發明的組合物的試劑盒.所述試刑盒可包含分開的含有合適栽體、稀釋刑或賦形劑的容器.試劑盒也可包含另外的用於共同施用或順序施用的抗癌刑、抗腫痏刑或抗裙劑和/或降低或減輕抗瘤刑、抗腫瘤刑或抗癌劑的有害作用的試刑.此外，所述試刑盒可包含用於混合或組合組分和/或施用的說明書.通過舉例說明，從下面的實施例中可更好地理解本發明和其許多有利方面.實施例實施例1A.mCEA(6D)重複1的修飾已證明重組CBA表達後在細胞中存在截短形式的CEA.該研究目的在於產生編碼CEA的核酸序列，所述核酸序列不會導致在細胞中表達後產生截短的CEA表達.下面描述新的編碼CEA的核酸序列CAP(6D)-1，2的產生和表達.從Virogenetics，Inc商購獲得質粒p3'H6MCEA,該質粒含有在部分H6啟動子控制下的具有6D修飾的MCEA基因(困U;SEQIDNO.:1).將來自p3'H6MCEA的912bpNruI-BamHI片段克隆入pUC18,從而形成質粒pSE1544.9(pUC18-mCEA重複1;圖1B)將經OPC純化的寡核苷酸7524-7526、7528-7533、7535-7537和7567-7568用激酶處理並退火，從而產生兩個經連接產生464bp合成的經修飾的mCBA重複l的片段，所迷mCEA重複1兩側連接有Accl和BamHI位點.將該合成的經修飾的重複1片段克隆入pSE1544.9AccI-BamHI，從而產生pSE1616.44(pUC18-mCEA修飾的重複l;困2).將pSE1616.44的904bpEcoRV-BamHI片段克隆回3'H6MCEAEcoRV-Ba邁HI，從而形成pSB1658.15(p3'H6MCEA修飾的重複l;閨3).B.mCEA(6D)重複2的修飾通過使用稱為由重疊延伸進行基因剪接的方法(S0E)產生合成的經修飾的重複2片段並將其克隆入pBluescript-SIC+，從而產生pBSmCEA(圖4).用於重複2修飾的寡核苷酸顯示於下面(第IV、B部分).兩個不同的克隆(pBS-mCEA-3和pBS-mCEA-8)包含各種點突變。將pBS-mCEA-3的697bpBamHI-EcoRI片段克隆入pUC18BamHI-EcoRI以產生pSE1671.8.將pBSmCEA-8的591bpSpel-Bsu361片段克隆入pSE1671.8Spel-Bsu361，從而產生稱為pSE1681.1的質粒.使用寡核苷酸7751(SEQIDNO.:2;(SEQIDNO.:3;CAGAATGAATTATCCGTTGATCACTCC)，使用獲自Stratagene的Quikchange定點謙變試刑盒進行兩位點PCR誘變，以修正兩個剩餘的點突變pSE1681.1.經修正的克隆稱為PSE1686.l(pUC18mCEA修飾的重複2;圖5)如最近所指出的，含有CEA的質粒p3'H6MCEA中的第二重複的5，末端缺少丙氨酸密碼子.為保持CEA的胺基酸序列的一致性，敲除存在於質粒PSE1686.1中的丙氨酸密碼子，所述質粒包含經修飾的笫二CEA重複，通過使用寡核苷酸7802(SEQIDNO.:4;IDNO.:5;GTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCATACACGGTAATCGTCGTCACG)和來自Stratagene的Quikchange定點資變試刑盒完成該過程，通過測序來證實所得的質粒PSE1696.l(pUC18mCEA修飾的重複2;圖6).將來自pSE1696.1的694bpBsu36I-Ba邁HI片段克隆入Psel658.15的Bsu36I-BamHI位點以組合經修飾的重複1和2.所產生的質粒稱為p3'H6modMCEA-笫1和笫2重複(困7).C.ALVAC供體質粒pNVQH6MCEA(6D第1和第2)的構建將來自p3'H6modMCEA-笫1和第2重複的2.2kbNrul/Xhol片段克隆入pNVQH6LSP-18的Nrul/Xhol位點，從而產生pNVQH6MCEA(6D笫1和笫2;困8).包含於pNVQH6MCEA中的經修飾的CBA序列("CAP(6D)-1，2";SEQIDNO.6)顯示於困9,D.經修飾的CEA的表達為檢驗在細胞中表達後，CAP(6D)-1,2序列的穩定性，使用pNVQH6MCEA(6D第1和笫2)作為模板和兩個寡核苷酸(8034LZ，SEQIDNO.:7;CTGGCGCGCCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG;和8035LZ,SEQIDNO.:8:CTGGTACCAGAAAAACTATATCAGAGCAACCCCAAC)對該基因連同側翼H6啟動子一起進行PCR擴增.然後將PCR產物克隆入稱為pLZTKl的NYVACTK供體質粒中，其包含LacZ和K1L標記基因。特定地製備該栽體以便通過使用藍/白篩選方法在NYVAC中產生重組病毒，在兩個供體質粒體pLZTKlmCEA(6D第1和第2)和NYVAC之間進行體外重組後，將外源CAP(6D)-1,2序列和標記基因整合入NYVAC基因組.含有具有LacZ和mCEA二者的中間體重組NYVAC的斑點呈現藍色.然後進行幾輪斑點的純化.第二重組亊件踢除了標記基因，從而產生包含只具有CAP(6D)-1，2序列但無標記基因的重組體的最終的白色斑點(困10).挑揀出重組白色斑點和藍色斑點以證實CAP(6D)-1，2序列的表達.使用來自各斑點的病毒進行感染，並在感染後三天收穫細胞以製備細胞DNA或細胞裂解物.為分離重組NYVACDNA，使用了DNAzol試劑(GibcoBRL).進行PCR(PCR條件95TC(5分鐘)—[95TC(30秒)—491C(30秒)—721C(l分鐘)]30個循環—721C(7分鐘)-41C)以證實CAP(6D)-1,2序列存在於重組NYVAC基因組中，使用的引物是7569LZ(5'ttggatccatggagtctccctcggcc3'正向引物；SEQIDNO,:9)和7570LZ(5'ttggatccctatatcagagcaacccc3'反向引物；SEQIDNO.:10),其可擴增全長2106bpCAP(6D)-1,2,最終的重組白色斑點PRBC-III-2、3、6、8、9、10在PCR中全部顯示2.1kb的CAP(6D)-1，2序列的帶，PRBC-III-Nl是具有標記基因和仍存在於病毒基因組中的CAP(6D)-1，2序列的藍色斑點，且在PCR中也擴增出CAP(6D)-1，2序列的帶，從vCP307DNA(包含被整合入ALVAC基因組中的天然CEA)擴增的主要PCR帶是在1.2kb處的截短的CEA，另外具有非常弱的全長CEA帶，將只是細胞的樣品(無病毒感染)用作負對照，且質粒pLZTKlMCEA(6D笫l和笫2)是用於PCR反應的正對照.PCR結果清楚地顯示全長CAP(6D)-1,2存在於重病毒基因組中，而未見其它CEA的截短形式.該結果表明在ALVAC基因組中，和天然CEA相比，CAP(6D)-1,2具有增加的穩定性。也通過免疫印跡法測定蛋白的表達以確定在表達CAP(6D)-1,2的細胞中不存在截短的CEA蛋白(困11).為分離細胞裂解物，首先用PBS洗塗細胞，然後加入裂解緩衝液(ReporterGeneAssay;BoehringerMannheim)並振蕩15分鐘，在13，000rpm下離心細胞裂解物，並收集上清液進行蛋白印跡分析.將樣品加到IOX的聚丙烯耽胺凝膠上並在125伏特下電泳.然後將蛋白轉移至PVDF濾過膜上(I咖obilon-P，Millipore).使用HRP連接的小鼠CEA單克隆抗體(1:1000;Fitzgerald)檢測mCEA的表達，其中利用化學發光試劑(DNAThunder;NENT"LifeScienceProducts)進行增強，所有6個最終的CAP(6D)-1,2重組白色斑點(PRBC-III-2、3、6、8、9、10)和一個中間體藍色斑點(pRBC-III-NI)只顯示一條CEA帶而無其它截短的形式(閨11).相反地，來自vCP307斑點(表達天然CEA的重組ALVAC)的蛋白除顯示全長CEA外，在大約60kDa處顯示清晰的截短的CEA產物.延長的膠片詠光確證了在CAP(6D)-1，2重組體中不存在任何截短的CEA多肽.CEF用作負對照.總之，通過用邁CEA替代天然CEA產生了CAP(6D)-1，2重組體，以防止多版本CEA的表達.通過PCR和蛋白印跡法證明從重組NYVAC表達的CAP(6D)-1，2在消除截短的CEA版本中是有效的.E,用於表達B7.1和CAP(6D)-1,2CEA的重組ALVAC栽體如困12所示，將人B7.1基因插入在H6啟動子控制下的ALVACC6供體質粒.然後使用標準技術用該供體質粒和ALVAC產生ALVAC重組vCP306.將供體質粒插入ALVAC基因組的C6位點.如困13所示，將CAP(6D)-1，2CEADNA序列插入在H6啟動子控制下的ALVACC3供體質粒中.然後使用標準技術用該供體質粒和vCP306產生表達這些基因的ALVAC重組體vCP2140(ALVAC-CAP(6D)-1,2CEA-B7.1),將供體質粒插入ALVAC基罔組的C3位點.該栽體可用於，例如，在體外(即，在細胞培養物中)或在體內(為了免疫目的)表達B7.1和/或CEA.儘管按照優選的實施方案描述了本發明，但應當理解對於本領域技術人員而言可產生變化和修飾.因此，所附的權利要求意困褒蓋所有這些在本發明請求保護的範圍內的等同變化.權利要求1.包含如在SEQIDNO.:24和困9中舉例說明的核酸序列CEA(6D)-1，2或其片段的表達栽體.2.權利要求l的表達栽體，其中所述栽體是質粒或病毒栽體.3.權利要求2的表達栽體，其中所述病毒栽體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、疾滲病毒和腺伴隨病毒.4.權利要求3的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自牛疸病毒、NYVAC、禽痘病毒、canarypox、ALVAC、ALVAC(2)、禽疽病毒和TR0VAC的痘病毒.5.權利要求4的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的疽病毒.6.權利要求1的表達栽體，其進一步包含至少一個類外的肺瘤相關抗原.7.權利要求6的表達栽體，其中所述栽體是質粒或病毒栽體.8.權利要求7的表達栽體，其中所述病毒栽體選自疽病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、疾滲病毒和腺伴隨病毒.9.權利要求8的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自牛疽病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、canarypox、ALVAC、ALVAC(2)、禽疽病毒和TR0VAC的疽病毒.10.權利要求9的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒.11.權利要求l的表達栽體，其進一步包含至少一個編碼血管發生相關抗原的核酸序列.12.權利要求ll的表達栽體，其中所述栽體是質粒或病毒栽體.13.權利要求12的表達栽體，其中所述病毒栽體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰滲病毒和腺伴隨病毒.14.權利要求13的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自牛痘病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、canarypox、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒和TR0VAC的疽病毒，15.權利要求14的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的疽病毒.16.權利要求6的表達栽體，其進一步包含至少一個編碼血管發生相關抗原的核酸序列.17.權利要求16的表達栽體，其中所述栽體是質粒或病毒栽體.18.權利要求17的表達栽體，其中所述病毒栽體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰務病毒和腺伴隨病毒.19.權利要求17的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自牛疽病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、canarypox、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒和TR0VAC的痘病毒.20.權利要求18的疽病毒，其中所述病毒栽體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒.21.權利要求l、6、11或16的表達栽體，其進一步包含至少一個編碼共刺激組分的核酸序列.22.權利要求22的表達栽體，其中所述栽體是質粒或病毒栽體.23.權利要求23的表達栽體，其中所述病毒栽體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰滲病毒和腺伴隨病毒，24.權利要求24的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自牛疽病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、canarypox、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒和TR0VAC的痘病毒.25.權利要求18的痘病毒，其中所述病毒栽體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒.26.包含藥物可接受栽體中的表達栽體的組合物，所述栽體包含如SEQIDNO.:24和困9中舉例說明的核酸序列CEA(6D)-1，2或其片段.27.權利要求26的表達栽體，其中所述栽體是質粒或病毒栽體.28.權利要求27的表達栽體，其中所述病毒栽體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒和腺伴隨病毒，29.權利要求28的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自牛疽病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、canarypox、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒和TR0VAC的痘病毒.30.權利要求29的疽病毒，其中所迷病毒栽體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的疽病毒.31.用於預防或治療癌症的方法，其包括給宿主施用包含如SEQIDNO.:24和困9中舉例說明的核酸序列CEA(6D)-1,2或其片段的表達栽體.32.權利要求31的表達栽體，其中所述栽體是質粒或病毒栽體。33.權利要求32的表達栽體，其中所述病毒栽體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰滲病毒和腺伴隨病毒.34.權利要求33的表達栽體，其中所述病毒栽體是選自牛痘病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、canarypox、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒和TR0VAC的痘病毒。35.權利要求34的痘病毒，其中所述病毒栽體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒.36.包含如SEQIDNO.:24和困9中舉例說明的CEA(6D)-1，2序列的分離的DNA分子。37.包含如SEQIDNO.:24和圖9中舉例說明的CEA(6D)-1，2序列的片段的分離的DNA分子.全文摘要本發明涉及編碼多肽的核酸和所述核酸或多肽在預防和/或治療癌症中的用途。具體地，本發明涉及用於插入和表達編碼腫瘤抗原的外源基因的改進載體，以用於癌症的免疫治療。文檔編號A61K39/00GK101124327SQ200480029155公開日2008年2月13日申請日期2004年10月6日優先權日2003年10月8日發明者B·羅文斯基,L·張,L·格裡茨,M·帕林頓,P·格林哈爾夫申請人:聖諾菲·帕斯圖爾公司;特裡昂生物學公司