使用棒狀細菌發酵生產d－泛酸的方法

2023-08-04 10:38:01 2

專利名稱：使用棒狀細菌發酵生產d－泛酸的方法
泛酸構成了具有商業價值的維生素，可用於化妝品，藥物以及人類和動物的營養品。
泛酸可以化學合成，也可通過生物技術，在適當的營養液中發酵適當的微生物來生產泛酸。利用微生物進行生物技術生產的優點在於形成了所需的立體異構的D型泛酸。
多種類型的細菌，如大腸桿菌，產紅棒狀桿菌(Corynebacteriumerythrogenes)，產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)以及酵母，如Debaromyces castellii可以如EP-A 0 493 060中所述在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的營養液中生產D-泛酸。EP-A 0 493060還表明對大腸桿菌而言，利用質粒pFV3和pFV5擴增生物合成泛酸所用的基因可改良D-泛酸的形成。
EP-A 0 590 857涉及攜有多種抗代謝物抗性，並在含有葡萄糖和β-丙氨酸的營養液中可生產D-泛解酸和D-泛酸的大腸桿菌菌株，所述抗代謝物如水楊酸，α-丁酮酸，β-羥基天冬氨酸等。EP-A 0590 857中還描述了通過擴增得自大腸桿菌的生物合成泛酸所用的基因可改良大腸桿菌中D-泛解酸和D-泛酸的生產，所述基因未經任何詳細限定，只知其包含在質粒pFV31中。
WO97/10340中闡明在形成泛酸的大腸桿菌突變體中，通過增加一種纈氨酸生物合成酶，即乙醯羥酸合成酶II的活性可進一步提高泛酸的產量。
發明人自己制訂的目標是利用新的基本原理，藉助於棒狀細菌來改良發酵生產D-泛酸的方法。
維生素泛酸構成了具有商業價值的產物，可用於化妝品，藥物以及人類和動物的營養品。因此，人們普遍的興趣是改良生產泛酸的方法。下文中無論何處提及的D-泛酸或泛酸或泛酸鹽，不僅指的是游離的酸，也指D-泛酸的鹽，如鈣，鈉，氨或鉀鹽。
本發明提供了能在棒狀桿菌屬微生物中複製的任選重組的DNA，所述DNA得自棒狀桿菌屬並含有至少一個下列核苷酸序列，所述序列選自a)SEQ ID NO1所示的編碼panB基因(酮泛解酸羥基甲基轉移酶)的序列，b)SEQ ID NO1所示的編碼panC基因(泛酸合成酶)，尤其是panBC操縱子的序列，和任選地c)SEQ ID NO4所示的編碼ilvD基因(二羥酸脫水酶)的序列。
本發明提供了能與上述類似地進行複製的DNA，該DNA含有(i)SEQ ID NO1，SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡併性的範圍內對應於(i)中各個序列的序列中的至少一個序列或(iii)與(i)或(ii)中各個序列的互補序列雜交的序列中的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中功能上中性的有義突變。
本發明還提供了通過導入一種或多種可複製的DNA而被轉化的棒狀微生物，尤其是棒狀桿菌屬微生物。本發明還提供了使用已經能產生D-泛酸的棒狀細菌生產此酸的方法，所述棒狀細菌中panB和panC基因或單獨或與一個其它基因聯合，任選與ilvA基因中的缺損突變或與ilvBN，ilvC或ilvD基因的增強聯合被增強，尤其是被過量表達。
本文中所用術語「增強」描述了微生物內因基因拷貝數增加、使用了強的啟動子或使用了編碼高活性相應酶的基因和任選地聯合使用上述手段，使得由相應DNA編碼的一種或多種酶的胞內活性增加。
作為本發明主題的微生物可由葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，澱粉，纖維素或甘油和乙醇，尤其是從葡萄糖或蔗糖生產泛酸。這是棒狀細菌，如棒狀桿菌或節桿菌屬細菌的問題。對棒狀桿菌屬而言，應特別地提及穀氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，已知該菌種形成胺基酸的能力很強。此菌種包括野生型菌株，如穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032，黃色短桿菌ATCC14067，Corynebacterium melassecola ATCC17965及其衍生菌株。
本發明人發現新近從穀氨酸棒狀桿菌中分別或聯合(panBC操縱子)分離的D-泛酸生物合成基因panB(編碼酮泛解酸羥基甲基轉移酶)和panC(編碼泛酸合成酶)增強，尤其是過量表達之後，D-泛酸的生產得以改良。
本發明人還觀察到得自穀氨酸棒狀桿菌的新的纈氨酸生物合成基因ilvD(編碼二羥酸脫水酶)表達的增強能使D-泛酸的產量增加。根據本發明，除了此基因外，編碼乙醯羥酸合成酶的ilvBN基因和編碼異構還原酶的ilvC基因表達的增強也會使穀氨酸棒狀桿菌中D-泛酸的產量增加。
為了達到增強(過量表達)的目的，例如可增加相應基因的拷貝數，或者可突變位於結構基因上遊的啟動子和調控區域。摻入結構基因上遊的表達盒以類似的方式起作用。利用可誘導的啟動子，還可以在發酵生產D-泛酸的過程中增強表達。利用延長mRNA壽命的方法同樣可以改善表達。另外，通過防止酶蛋白質的降解同樣可以增強酶活性。此時，基因或基因構建體或存在於拷貝數不同的質粒載體中，或整合於染色體中並擴增。或者，通過改變培養基的組成和改變控制培養的方式可使所需基因過量表達。本領域技術人員可在下列文獻中發現有關指導Martin等(Bio/Technology 5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EP 0 472 869，美國專利4,601,983，Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))，Reinscheid等(應用和環境微生物學60，126-132(1994))，LaBarre等(細菌學雜誌175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Jensen和Hammer(生物技術和生物工程58，191-195(1998))或美國細菌學學會出版的「普通細菌學方法手冊」(Washington D.C.，USA，1981)和遺傳學，分子生物學的教科書。
為了從穀氨酸棒狀桿菌中分離panB和panC基因，首先應在大腸桿菌中建立此微生物的基因庫。一般的教科書和手冊中描述了基因庫的建立，例如，可參見Winnacker所編的教科書基因和克隆，EineEinführung in die Gentechnologie(Verlag Chemie，Weinheim，德國，1990)或Sambrook等人所編的手冊分子克隆，實驗室手冊(冷泉港實驗室出版社，1989)。已知的基因庫是由Kohara等人(細胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的大腸桿菌K-12菌株W3110的基因庫。Bathe等(分子和普通遺傳學，252255-265，1996)描述了穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的基因庫，該基因庫是藉助於粘粒載體SuperCosI(Wahl等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 842160-2164)在大腸桿菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的。為了在大腸桿菌中產生穀氨酸棒狀桿菌基因庫，也可使用質粒，如pBR322(Bolivar，生命科學，25，807-818(1979))或pUC19(Norrander等，1983，基因，26101-106)。特別適合的宿主是限制性缺損和重組缺損的大腸桿菌菌株。例如Grant等(Proc.Natl.Acad.Sci，USA 87(1990)4645-4649)所述的菌株DH5αmcr。
隨後，通過轉化(Hanahan，分子生物學雜誌166，557-580，1983)或電穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物學通訊，123343-347)將基因庫摻入指示菌株。指示菌株的區別特徵在於其中的所需基因具有突變，產生了可測的表型，例如輔源營養。指示菌株或突變體可由已公知的來源或原種保藏中心得到，也可自己生產。在本發明的範圍內，特別優選的是panC基因攜有突變的大腸桿菌突變體DV39(Vallari和Rock，細菌學雜誌1985，164136-142)。另一個需要泛酸的大腸桿菌突變體例子是菌株SJ2，其panB基因攜有突變，可得自Yale大學的Genetic Stock Center(New Haven，Connecticut，USA)。另一例是在本發明範圍內分離的穀氨酸棒狀桿菌突變體R127/7，其編碼二羥酸脫水酶的ilvD基因是缺損的。用攜有所需基因，如panB基因的重組質粒轉化指示菌株，如panB突變體SJ2，並表達所需基因之後，指示菌株在相應的特性，如對泛酸的需求方面變為原養型的。
通過如Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci，USA 745463-5467，1977)所述測定序列可鑑定以此方法分離的基因或DNA片段。
使用此方法從穀氨酸棒狀桿菌中得到編碼panB和panC基因的新DNA序列，即SEQ ID NO1所示序列，該序列是本發明的組成部分。另外，用上述方法從本發明的DNA序列中得到相應酶的胺基酸序列。SEQ ID NO2描述的是所得panB基因產物，即酮泛解酸羥基甲基轉移酶的胺基酸序列，SEQ ID NO3描述的是所得panC基因產物，即泛酸合成酶的胺基酸序列。另外，使用此方法從穀氨酸棒狀桿菌中得到編碼ilvD基因的新DNA序列，即SEQ ID NO4所示序列，該序列是本發明的組成部分。SEQ ID NO5描述的是所得ilvD基因產物，即二羥酸脫水酶的胺基酸序列。
利用簡併的遺傳密碼由SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO4所得的編碼DNA序列同樣是本發明的組成部分。同樣，與SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO4雜交的DNA序列也是本發明的組成部分。另外，本領域技術人員熟知保守的胺基酸變化，如在蛋白質中用丙氨酸替代甘氨酸或用穀氨酸替代天冬氨酸作為「有義突變」，這種突變不會導致蛋白質活性發生根本的變化，即該突變在功能上是中性的。另外，蛋白質N-末端和/或C-末端的變化基本上不會損害其功能，或甚至還可使蛋白質穩定化。本領域技術人員可從下列文獻中發現有關細節Ben-Bassat等(細菌學雜誌169751-757(1987))，O』Regan等(基因77237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質科學3240-247(1994))，Hochuli等(Bio/Technology 61321-1325(1988))和遺傳學及分子生物學的教科書。以相應的方法由SEQ ID NO2，SEQ IDNO3和/或SEQ ID NO5得到的胺基酸序列同樣是本發明的組成部分。
隨後，在適當微生物中單獨地表達或與其它基因聯合表達以這種方法鑑定的基因。表達或過量表達基因的已知方法為藉助於質粒載體擴增所述基因，另外，所述載體可被賦予表達信號。作為質粒載體，應考慮能在相應微生物中複製的載體。例如，對穀氨酸棒狀桿菌而言，考慮使用載體pEKEx1(Eikmanns等，基因10293-98(1991))或pZ8-1(歐洲專利說明書0 375 889)或pEKEx2(Eikmanns等，微生物學1401817-1828(1994))或pECM2(Jger等，細菌學雜誌174(16)5462-5465(1992))。此種類型質粒的例子是pEKEx2panBC和pECM3ilvBNCD，它們包含在菌株DH5αmcr/pEKEx2panBC和DH5αmcr/pECM3ilvBNCD中。質粒pEKEx2panBC是攜有panB和panC基因的大腸桿菌/穀氨酸棒狀桿菌穿梭載體。質粒pECM3ilvBNCD是除了攜有ilvD基因外，還攜有ilvBN和ilvC基因的大腸桿菌/穀氨酸棒狀桿菌穿梭載體。
本發明人還發現，單獨地，連帶地或與ilvBN，ilvC和ilvD基因聯合地增強panB和panC基因對蘇氨酸和異亮氨酸合成量降低的微生物具有有利的影響。通過減弱或消除相應的生物合成酶或其活性可使合成量降低。為此，可考慮例如高絲氨酸脫氫酶，高絲氨酸激酶，蘇氨酸合成酶或甚至蘇氨酸脫水酶。減弱或消除酶和其活性的一個可能的方法是誘變方法。
這些方法包括非定向法，該方法使用化學試劑(如N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍)或UV照射進行誘變，隨後篩選需要L-蘇氨酸或L-異亮氨酸的所需微生物。引發突變和突變體篩選的方法一般是已知的，可參見Miller(細菌遺傳學短期課程，大腸桿菌和相關細菌的實驗室指南和手冊(冷泉港實驗室出版社，1992))或美國細菌學學會出版的「普通細菌學方法手冊」(Washington D.C.，USA，1981)。
另外，這些方法也包括定向重組DNA技術。藉助於這些方法，可使染色體中編碼蘇氨酸脫水酶ilvA的基因缺失。用於此目的的適當方法描述於Schfer等(基因(1994)14569-73)或Link等(細菌學雜誌(1998)1796228-6237)。也可以僅使部分基因缺失，或使蘇氨酸脫水酶基因的突變片斷被交換。以此方式缺失或交換的結果是蘇氨酸脫水酶活性喪失或降低(Mckel等(1994)分子微生物學13833-842；Morbach等(1996)應用微生物學和生物技術45612-620)。此類突變體的例子是穀氨酸棒狀桿菌菌株ATCC13032ΔilvA，其ilvA基因攜有缺失。
可用分批法或補料分批法或重複補料分批法連續或不連續地培養根據本發明產生的微生物以生產泛酸。已知培養方法的概要描述於Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所用培養基應以適當方式滿足各個微生物的需求。多種微生物培養基的描述見於美國細菌學學會出版的「普通細菌學方法手冊」(Washington D.C.，USA，1981)。作為碳源，可使用糖和碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，澱粉和纖維素；油和脂肪，如豆油，葵花子油，花生油和椰子脂；脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸；醇，如甘油和乙醇；和有機酸，如乙酸。這些物質可以單獨使用，也可以以混合物的形式使用。作為氮源，可使用有機含氮化合物，如蛋白腖，酵母提取物，肉汁浸膏，麥芽膏，玉米浸出汁，大豆粉和尿素或無機化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨使用，也可以以混合物的形式使用。作為磷源，可使用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽。培養基中還必須含有生長所必需的金屬鹽，如硫酸鎂或硫酸鐵。最後，除了上述物質外，還可使用必需的生長調節物質，如胺基酸和維生素。另外，為了再增加泛酸的產量，可在培養基中混合加入泛酸的前體，如天冬氨酸，β-丙氨酸；酮異戊酸，酮泛解酸，泛解酸和任選加入它們的鹽。可以一次性加足的形式將上述培養基成分加入培養物中，或在培養過程中以適當的方式補料。
為了控制培養物的pH，可以適當的方式使用如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨水的鹼性化合物，或如磷酸或硫酸的酸性化合物。為了控制泡沫，可使用抗泡沫劑，如脂肪酸聚乙二醇酯。為了維持質粒的穩定性，可在培養基中加入選擇性作用的適當物質，如抗生素。為了維持需氧條件，可在培養物中通入氧氣或含氧氣的氣體混合物，如空氣。培養溫度一般為20℃-50℃左右，優選為25℃-45℃左右。連續培養直至生產出最高產量的泛酸。一般在10小時-160小時之內即可達到這一目的。
用已知方法可測定所形成泛酸的濃度(Velisek；層析科學60，515-560(1992))。為了對泛酸進行微生物學檢測，一般使用植物乳桿菌菌株ATCC8014(U.S.Pharmacopeia 1980；AOAC International1980)。另外，也可以使用其它檢測生物，如乳酸片球菌NCIB6990對泛酸濃度進行微生物學檢測(Sollberg和Hegna；酶學方法62，201-204(1979))。
根據布達佩斯條約，將下列微生物保藏於德國微生物和細胞培養物保藏中心[Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen](DSMZ，Braunschweig，德國)·大腸桿菌K12菌株DH5αmcr/pEKEx2panBC，保藏號為DSM12456·大腸桿菌K12菌株DH5αmcr/pECM3ilvBNCD，保藏號為DSM12457·穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032ΔilvA，保藏號為DSM12455

圖1pUR1的限制性圖譜和測序片斷的基因座。圖2質粒pEKEx2panBC的限制性圖譜。圖3質粒pECM3ilvBNCD的限制性圖譜。
實施例下文中將根據實施方案的例子更完整地闡明本發明。實施例1從穀氨酸棒狀桿菌中克隆，測序和表達泛酸生物合成基因panB和panC1.克隆panB和panC基因如Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9(1990)84-87)所述分離穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體DNA，並用限制性內切核酸酶Sau3A切割。凝膠電泳分離之後，提取大小範圍為3-7kb和9-20kb的DNA片斷，再連接到載體pBR322唯一的BamHI界面上。用連接物轉化(Hanahan，分子生物學雜誌166(1983)557-580)大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87(1990)4645-4649)。接種至含10μg/ml四環素的LB瓊脂平板上之後，根據其對四環素的敏感性鑑定攜有插入物的菌落。利用混合克隆的質粒製品(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊(1989)冷泉港實驗室出版社)，分離出8組各含有400個質粒，9組各含有500個質粒，前者插入物大小為9-20kb，後者插入物大小為3-7kb。利用電穿孔(Wehrmann等，1994，微生物學1403349-3356)用此基因庫轉化大腸桿菌panB突變體SJ2(Cronan等，1982，細菌學雜誌149916-922)。將轉化物直接鋪於含15g/l瓊脂的CGXII培養基上(Keilhauer等，細菌學雜誌(1993)1755595-5603)。由能在不補加泛酸的情況下生長的克隆中分離質粒DNA(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊(1989)冷泉港實驗室出版社)。通過再轉化可以證實有8個質粒能異源性地互補大腸桿菌突變體SJ2的panB缺損。
用這8個質粒繪製限制性圖譜。研究了其中一個質粒載體，下文將其稱為pUR1，它含有長度為9.3kb的插入物(圖1)。對大腸桿菌panC突變體DV39(Vallari和Rock 1985，細菌學雜誌164136-142)的轉化表明載體pUR1同樣也能互補此突變體的panC缺損。2.測序panB和panC基因根據Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)745463-5467)的雙脫氧鏈終止法測序pUR1中大小為2.2kb的插入物片斷(圖1)。為此，首先利用外切核酸酶III產生亞克隆，然後藉助於標準引物(德國Boehringer Mannheim公司生產的通用引物和反向引物)測定亞克隆的序列。用Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)生產的自動雷射螢光測序儀(A.L.F.)對測序物進行凝膠電泳分析。用HUSAR程序包(Release 4.0，EMBL，Cambridge，GB)分析所得的核苷酸序列。該核苷酸序列示於SEQ ID NO1。經分析鑑定出兩個開放閱讀框。一個開放閱讀框長度為813bp，將其鑑定為panB基因，它編碼271個胺基酸的多肽，該多肽示於SEQ ID NO2。第二個開放閱讀框被鑑定為panC基因，它含有837個鹼基對。它編碼279個胺基酸的多肽，該多肽示於SEQ ID NO3。3.表達panB和panC基因將panB和panC基因克隆至穀氨酸棒狀桿菌表達載體pEKEx2(Eikmanns等，1994，微生物學1401817-1828(1994))，其中兩個基因處於能被IPTG誘導的強tac啟動子的控制之下。克隆分兩步進行。首先，利用PCR擴增panB基因的開始部分。為此，藉助於相應引物將SalI界面插入panB起始密碼子前19bp處(引物15』GATCGTCGACCATCACATCTATACTCATGCCC3』)。選擇第二個引物以使擴增片斷中含有panB內部的EcoRI位點(引物25』ACCCGATGTGGCCGACAACC3』)。根據Sambrook等(分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社(1989))所述，以質粒pUR1為基質進行PCR，其退火溫度為62℃。用限制性內切核酸酶SalI和EcoRI切下大小為468bp的所得PCR產物，並連接於經類似處理的載體pEKEx2中。用連接物轉化大腸桿菌菌株DH5αmcr。從DH5αmcr/pEKEx2panB』型轉化體中分離載體pEKEx2panB』。
通過限制性消化從質粒pUR1中切下大小為1761bp的EcoRI片斷，該片斷含有panBC簇的另一半。將所述片斷克隆至已含有panB PCR產物，並已被EcoRI線性化的pEKEx2panB』載體中。用相應的連接物轉化大腸桿菌菌株DH5αmcr。從DH5αmcr/pEKEx2panBC型轉化體中分離載體pEKEx2panBC(圖2)，其中panBC基因簇處於tac啟動子的控制之下。實施例2從穀氨酸棒狀桿菌中克隆和測序編碼二羥酸脫水酶的ilvD基因1.分離穀氨酸棒狀桿菌的ilvD突變體用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍誘變(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社(1989))穀氨酸棒狀桿菌菌株R127(Haynes 1989，FEMS微生物學通訊61329-334)。為此，將5ml穀氨酸棒狀桿菌的過夜培養物與250μl N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(5mg/ml二甲基甲醯胺)混合，並於30℃，200rpm保溫30分鐘(Adelberg 1958，細菌學雜誌76326)。隨後用無菌的NaCl溶液(0.9％)將細胞洗滌2次。通過在含15g/l瓊脂的極限培養基平板CGXII上進行影印鋪板(Keilhauer等，細菌學雜誌1755595-5603)，分離出僅在加入L-纈氨酸，L-異亮氨酸和L-亮氨酸(各0.1g/l)時才能生長的突變體。
測定這些突變體的粗提取物中二羥酸脫水酶的酶活性。為此，在60ml LB培養基中培養克隆，離心收集指數生長期的細胞。用0.05M磷酸鉀緩衝液將細胞沉澱物洗滌1次並重新懸浮於相同緩衝液中。超聲處理10分鐘(Branson-Sonifier W-250，Branson Sonic Power公司，Danbury，USA)以破碎細胞。隨後於4℃，以13,000rpm離心30分鐘以除去細胞碎片，將上清液用作酶檢測試驗中的粗提取物。酶檢測試驗中的反應物中含有0.2ml 0.25M Tris/HCl，pH8，0.05ml粗提取物和0.15ml 65mMα，β-二羥基-β-甲基戊酸。將檢測物置於30℃保溫，10，20和30分鐘之後取出200μl樣品，利用HPLC分析方法(Hara等，1985，Analytica Chimica Acta 172167-173)測定其酮甲基戊酸的濃度。如表1所示，菌株R127/7未表現出二羥酸脫水酶活性，而異構還原酶和乙醯羥酸合成酶活性同合成支鏈胺基酸的其它酶一樣仍然存在。表1穀氨酸棒狀桿菌菌株中多種酶的比活(μmol/min和mg蛋白質)
2.克隆穀氨酸棒狀桿菌的ilvD基因如Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9(1990)84-87)所述分離穀氨酸棒狀桿菌R127的染色體DNA。用限制性酶Sau3A(BoehringerMannheim)裂解所述DNA並通過蔗糖密度梯度離心(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社(1989))分離之。使用含大小範圍約為6-10kb之片斷的組分與載體pJC1(Cremer等，分子和普通遺傳學220(1990)478-480)連接。為此，用BamHI使載體pJC1線性化和脫磷酸化。將5ng載體與20ng上述染色體DNA組分連接，通過電穿孔(Haynes和Britz，FEMS微生物學通訊61(1989)329-334)轉化突變體R127/7。檢測轉化體在未添加支鏈胺基酸的CGXII瓊脂平板上生長的能力。在所檢測的5,000個轉化體中，影印鋪板並於30℃保溫2天後，8個克隆可在極限培養基平板上生長。按Schwarzer等(Bio/Technology(1990)984-87)所述從這些克隆中製備質粒。對質粒DNA的限制性分析表明所有8個克隆中都含有相同的質粒，下文稱之為pRV。該質粒攜有4.3kb的插入物，並通過再次轉化檢測其互補ilvD突變體R127/7的能力。利用亞克隆，將負責互補突變體R127/7的區域限定為2.9kb ScaI/XhoI片斷。3.測序ilvD基因根據Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)745463-5467)的雙脫氧鏈終止法測定2.9kb ScaI/XhoI片斷的核酸序列。此方法中使用了Auto-Read測序試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。用Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)生產的自動雷射螢光測序儀(A.L.F.)進行凝膠電泳分析。用HUSAR程序包(Release 4.0，EMBL，Cambridge，GB)分析所得的核苷酸序列。該核苷酸序列示於SEQ ID NO4。經分析鑑定出一個長度為1836bp的開放閱讀框，將其鑑定為ilvD基因，它編碼612個胺基酸的多肽，該多肽示於SEQ ID NO5。實施例3構建穀氨酸棒狀桿菌的ilvA缺失突變體用Schfer等(基因14569-73(1994))所述的基因交換系統在穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032的ilvA基因中摻入缺失。為了構建失活載體pK19mobsacBΔilvA，首先從存在於載體pBM21(Mckel等，1994，分子微生物學13833-842)之EcoRI片斷上的ilvA基因中除去內部的241bp BglII片斷。為此，用BglII切割載體，通過瓊脂糖凝膠電泳除去ilvA內部的BglII片斷之後再重新連接。隨後，以EcoRI片斷的形式從載體中分離不完整的基因，並連接到已用EcoRI線性化的載體pK19mobsacB(Schfer 1994，基因14569-73)中。通過轉化至大腸桿菌菌株S17-1(Hanahan 1983，分子生物學雜誌166557-580)導入所得的失活載體pK19mobsacBΔilvA，並通過接合轉移至穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032(Schfer等，1990，細菌學雜誌1721663-1666)。得到穀氨酸棒狀桿菌的卡那黴素抗性克隆，其中失活載體整合於基因組內。為了選擇載體的切除，將卡那黴素抗性克隆鋪於含蔗糖的LB培養基(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社(1989))上，該培養基中含有15g/l瓊脂，2％葡萄糖/10％蔗糖，得到因第二次重組事件而再次失去載體的菌落(Jger等，1992，細菌學雜誌，1745462-5465)。接種於含和不含2mM L-異亮氨酸以及含和不含50μg/ml卡那黴素的極限培養基平板(含15g/l瓊脂的CGXII培養基(Keilhauer等，細菌學雜誌175(1993)5595-5603))之後，分離出36個克隆，它們因載體的切除而成為卡那黴素敏感型和異亮氨酸營養缺陷型，其中不完整的ilvA基因(ΔilvA等位基因)此時存在於基因組中。將其中一個克隆稱為菌株ATCC13032ΔilvA供進一步使用。實施例4表達穀氨酸棒狀桿菌的ilvBN，ilvC和ilvD基因為了進行表達，將乙醯羥酸合成酶(ilvBN)和異構還原酶(ilvC)(Cordes等，1992，基因112113-116和Keilhauer等，1993，細菌學雜誌，1755595-5603)和二羥酸脫水酶(ilvD)(實施例2)的基因克隆至載體pECM3中。載體pECM3是pECM2(Jger等，1992，細菌學雜誌1745462-5465)的衍生物，pECM2缺失長度約為1kbp，攜有卡那黴素抗性基因的BamHI/BglII DNA片斷的結果產生了pECM3。
在載體pKK5(Cordes等，1992，基因112113-116)中，基因ilvBNC已經以克隆的形式存在於載體pJC1(Cremer等，1990，分子和普通遺傳學220478-480)中。從所述載體中分離出5.7kb的XbaI-ilvBNC片斷，並和載體pRV含有ilvD基因的3.1kb XbaI片斷一起導入經XbaI線性化的載體pECM3中。將此時的連接物轉化至大腸桿菌菌株DH5αmcr。質粒pECM3ilvBNCD(圖3)得自DH5αmcr/pECM3ilvBNCD型轉化體。
利用電穿孔(Haynes 1989，FEMS微生物學通訊61329-334)和氯黴素抗性選擇，將質粒pECM3ilvBNCD導入菌株ATCC13032ΔilvA，得到菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD。另外，利用電穿孔(Haynes1989，FEMS微生物學通訊61329-334)和卡那黴素抗性選擇，將質粒pEKEx2panBC導入菌株ATCC13032和菌株ATCC13032ΔilvA，得到菌株ATCC13032/pEKEx2panBC和ATCC13032ΔilvA/pEKEx2panBC。利用電穿孔(Haynes 1989，FEMS微生物學通訊61329-334)和卡那黴素及氯黴素抗性選擇，將質粒pEKEx2panBC和pEKEX2導入菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD，得到菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEX2和ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCDpEKEx2panBC。實施例5構建需要泛酸的穀氨酸棒狀桿菌panC突變體藉助於失活載體pK18mob(Schfer等，1994，基因14569-73)，產生了穀氨酸棒狀桿菌R127 panC突變體。
為了構建panC失活載體，首先通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增穀氨酸棒狀桿菌panC基因大小為168bp的中間片斷(長度為837bp之基因的核苷酸265-432)。使用載體pUR1為基質(見實施例6)，利用兩個20聚體的引物1和引物2作為引物引物15』GTTCGCACCCGATGTGGAGG3』和引物25』ATGCACGATCAGGGCGCACC 3』。根據Sambrook等(分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社(1989))的方法進行PCR，退火溫度為55℃。立即克隆之後將所得片斷連接至載體pUC18的SmaI位點，再以EcoRI/SalI片斷的形式導入失活載體pK18mob(Schfer等，1994，基因14569-73)。用以此方式得到的載體pK18mob』panC』轉化大腸桿菌菌株S17-1，隨後通過接合導入穀氨酸棒狀桿菌R127中。用卡那黴素抗性進行選擇，結果得到穀氨酸棒狀桿菌R127的克隆，其中整合載體利用同源重組事件整合至panC基因中。以此方式得到的菌株R127panC∷pK18mob』panC』適於檢測D-泛酸。實施例6定量檢測D-泛酸為了定量測定D-泛酸，構建了穀氨酸棒狀桿菌panC突變體R127panC∷pK18mob』panC』(見實施例5)，其生長直接依賴於培養基中的D-泛酸濃度。此菌株為泛酸營養缺陷型，在添加β-丙氨酸和D-泛解酸時未顯示出生長。
為了用此指示菌株測定泛酸，使用CGXII培養基(Keilhauer等，細菌學雜誌(1993)1755595-5603)作為檢測培養基。為此，每種情況下，在保溫管(Falcon 2057，Becton and Dickinson，New Jersey，USA)中將3ml以4/3比例濃縮的CGXII培養基與1ml無菌的校準溶液或含泛酸並接種有指示菌株的檢測溶液混合。每次接種使用的是60μl指示菌株的甘油培養物。30℃保溫40小時之後，測定檢測物的細胞密度(OD600)(Novaspec 4049分光光度計，LKB Biochrom，Cambridge，GB)，利用校準曲線確定泛酸濃度。到濃度為25μg/l時，菌株表現出對泛酸濃度線性依賴性的生長，光密度為0.5-10。為了產生指示菌株的甘油培養物，將此菌株保溫於未添加過的CGXII培養基中達24小時(D-泛酸飢餓)。隨後，將1050μl培養物與700μl甘油混合。將這種甘油培養物立即置於-70℃冷凍，按上述方法，將60μl用於測定D-泛酸。作為對照，使用的是Sigma(Deisenhofen，德國)生產的泛酸鈉。實施例7用多種穀氨酸棒狀桿菌菌株生產D-泛酸為了研究菌株形成泛酸的能力，於30℃，在60ml腦心浸制培養基(Difco Laboratories，Detroit，USA)中將菌株ATCC13032，ATCC13032/pEKEx2panBC，ATCC13032ΔilvA和ATCC13032ΔilvA/pEKEx2panBC預培養14小時。隨後，用0.9％NaCl溶液(w/v)將細胞洗滌2次，並用此懸浮液接種每個60ml CgXII培養基以使OD600為0.5。所用培養基與Keilhauer等(細菌學雜誌(1993)1755595-5603)所述的相同，但另外含有2mM L-異亮氨酸。Keilhauer等所述的CgXII培養基示於表2。表2CGXII培養基的組成
在菌株ATCC13032/pEKEx2panBC和ATCC13032ΔilvA/pEKEx2panBC的培養過程中，5小時之後，在培養基中再混入1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷。培養24小時之後，取樣，離心除去細胞，對上清液進行無菌過濾。藉助於實施例6所述的泛酸試驗測定上清液中泛酸的濃度。結果示於表3。表3多種穀氨酸棒狀桿菌菌株形成的D-泛酸
實施例9多種穀氨酸棒狀桿菌菌株在添加β-丙氨酸時生產的D-泛酸為了定量菌株形成的泛酸，於30℃，在60ml含有25mg/l卡那黴素和3mg/l氯黴素的腦心浸制培養基(Difco Laboratories，Detroit，USA)中將菌株ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2和ATCC13032ΔilvA/pECM3ilvBNCD pEKEx2panBC預培養14小時。隨後，用0.9％NaCl溶液(w/v)洗滌2次，並用此懸浮液接種每個60ml CgXII培養基以使OD600為0.5。此時所用培養基含有2mM L-異亮氨酸，25mg/l卡那黴素，3mg/l氯黴素和終濃度為20mM的β-丙氨酸。培養5小時之後，在每種情況下向培養基中加入終濃度為1mM的IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)。49和74小時之後，取樣，離心除去細胞，對上清液進行無菌過濾。如實施例6所述測定上清液中泛酸的濃度。結果示於表4。表4多種穀氨酸棒狀桿菌菌株積累的D-泛酸
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名稱Degussa Aktiengesellschaft(B)街道Weissfrauenstr.9(C)城市Frankfurt am Main(D)州Hessen(E)國家德國(F)郵政編碼D-60311(A)名稱Forschungszentrum Juelich GmbH(B)街道Leo-Brandt Strasse(C)城市Juelich(D)州Nordrhein-Westfalen(E)國家德國(F)郵政編碼D-52425(ii)發明題目使用棒狀細菌發酵生產D-泛酸的方法(iii)序列數5(iv)計算機可讀形式(A)數據載體軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度2164個鹼基對(B)類型核苷酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設無(iv)反義無(vi)來源(A)生物穀氨酸棒狀桿菌(B)菌株ATCC13032(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置351..1163(D)其它資料/起始密碼子＝351/EC編號＝4.1.2.12/產物＝「酮泛解酸羥基甲基轉移酶」/基因＝「panB」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1166..2002(D)其它資料/起始密碼子＝1166/EC編號＝6.3.2.1/產物＝「泛酸合成酶」/基因＝「panC」(xi)序列描述SEQ ID NO1GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA 60GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA 120AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA 180CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCACGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG 240TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT 300GAATCAAATC GGAATTTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC356Met Pro1ATG TCA GGC ATT GAT GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA 404Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe Arg Glu5 10 15GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG 452Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala20 25 30CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT 500Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val35 40 45 50GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG 548Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser55 60 65ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT 596Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr Ile Ala70 75 80ACG AAG CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG 644Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu85 90 95GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA 692Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met Arg Glu100 105 110ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG 740Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile Ala Gln115 120 125 130ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC 788Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly His Ile135 140 145GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TCC TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG 836Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gln150 155 160GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG 884Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg Ala Leu165 170 175GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG 932Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu180 185 190GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC 980Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile Gly Ile195 200 205 210GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC 1028Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln Asp Ala215 220 225TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC 1076Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala230 235 240ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT 1124Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile Ala Asp245 250 255ATC CAC GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG 1171Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser PheMet Gln260 265 270 1GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA 1219Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His His Lys5 10 15TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC 1267Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly His Ala20 25 30TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT 1315Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val Ala Ser35 40 45 50ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT 1363Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys Asp Asp55 60 65TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA 1411Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu Leu Glu70 75 80GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC 1459Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu Met Tyr85 90 95CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA 1507Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile Gly Thr100 105 110AAA TTG GAG GGT GCC AGC AGG CCT GGC CAT TTC GAT GGT GTG GCT ACC 1555Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val Ala Thr115 120 125 130GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT 1603Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala Tyr Phe135 140 145GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC 1651Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu Val Ala150 155 160GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC 1699Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile Arg Gly165 170 175GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT 1747Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser Ala Asp180 185 190CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG 1795Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly Leu Gln195 200 205 210CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC 1843Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala Arg Asp215 220 225ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC 1891Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu Ile Val230 235 240GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA 1939Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu Thr Gln245 250 255CCA GCG TTG GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC 1987Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg Leu Ile260 265 270GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC 2042Asp Asn Ile Glu Leu275GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT2102GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA2162CA 2164(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度271個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Pro Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe1 5 10 15Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr20 25 30Asp Ala Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu35 40 45Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr50 55 60Leu Ser Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr65 70 75 80Ile Ala Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr85 90 95Tyr Glu Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met100 105 110Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile115 120 125Ala Gln Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly130 135 140His Ile Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val145 150 155 160Val Gln Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg165 170 175Ala Leu Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro180 185 190Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile195 200 205Gly Ile Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln210 215 220Asp Ala Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu225 230 235 240Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile245 250 255Ala Asp Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe260 265 270(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度279個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His1 5 10 15His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly20 25 30His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val35 40 45Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys50 55 60Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu65 70 75 80Leu Glu Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu85 90 95Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile100 105 110Gly Thr Lys Leu Glu Gly A la Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val115 120 125Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala130 135 140Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu145 150 155 160Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile165 170 175Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser180 185 190Ala Asp Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly195 200 205Leu Gln Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala210 215 220Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu225 230 235 240Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu245 250 255Thr Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg260 265 270Leu Ile Asp Ash Ile Glu Leu275(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度2952個鹼基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設無(iv)反義無(vi)來源(A)生物穀氨酸棒狀桿菌(B)菌株ATCC13032(C)個體/分離物突變體R127(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置290..2125(D)其它資料/起始密碼子＝290/EC編號＝4.2.1.9
/產物＝「二羥酸脫水酶」/基因＝「ilvD」(xi)序列描述SEQ ID NO4AGTACTTGGA GCGCCAAAAG GCACTGGGCA AGCCAGTTCA GTTGAACTTC GATGACGACA 60CCGATGGGAA TACAACACAA ACAGAAAGCG TTGAATCCCA AGAGACCGGA CAAGCCGCGT 120CTGAAACCTC ACATCGTGAT AACCCTGCGT CACAGCACTA GAGTGTAATA AGCCGTCCGA 180ACCAAAGGTC CACACCTCTG CACGAGTAGA AGCTCACCCA AGTTTTCAAA GTGCCGTTGA 240TTCTTGACAA CCACCCGCCG CTCTTTAGAG CAGATTTGAA AAGCGCATC ATG ATC 295Met Ile280CCA CTT CGT TCA AAA GTC ACC ACC GTC GGT CGC AAT GCA GCT GGC GCT 343Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala Gly Ala285 290 295CGC GCC CTT TGG CGT GCC ACC GGC ACC AAG GAA AAT GAG TTC GGC AAG 391Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe Gly Lys300 305 310CCA ATT GTT GCC ATC GTA AAC TCC TAC ACC CAG TTC GTG CCC GGA CAC 439Pro Ile Val Ala Ile Val Asn Ser Tyr Thr Gln Phe Val Pro Gly His315 320 325GTT CAC CTT AAG AAC GTC GGC GAT ATT GTG GCA GAT GCA GTG CGC AAA 487Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val Arg Lys330 335 340 345GCC GGT GGC GTT CCA AAG GAA TTC AAC ACC ATC GTC GAT GAC GGC ATC 535Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Val Asp Asp Gly Ile350 355 360GCC ATG GGA CAC GGC GGC ATG CTG TAC TCC CTG CCA TCC CGT GAA ATC 583Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg Glu Ile365 370 375ATC GCC GAC TCC GTC GAA TAC ATG GTC AAC GCA CAC ACC GCC GAC GCC 631Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala Asp Ala380 385 390ATG GTG TGT ATC TCC AAC TGT GAC AAG ATC ACC CCA GGC ATG CTC AAC 679Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly Met Leu Asn395 400 405GCA GCA ATG CGC CTG AAC ATC CCA GTG GTC TTC GTT TCC GGT GGC CCA 727Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser Gly Gly Pro410 415 420 425ATG GAA GCT GGC AAG GCT GTC GTC GTT GAG CGC GTT GCA CAC GCA CCA 775Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His Ala Pro430 435 440ACC GAC CTC ATC ACC GCG ATC TCC GCA TCC GCA AGC GAT GCA GTC GAC 823Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala Val Asp445 450 455GAC GCA GGC CTT GCA GCC GTT GAA CGA TCC GCA TGC CCA ACC TGT GGC 871Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr Cys Gly460 465 470TCC TGC TCC GGT ATG TTC ACC GCG AAC TCC ATG AAC TGC CTC ACC GAA 919Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Thr Glu475 480 485GCT CTG GGA CTT TCT CTC CCG GGC AAC GGC TCC ACT CTG GCA ACC CAC 967Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala Thr His490 495 500 505GCA GCA CGT CGC GCA CTG TTT GAA AAG GCC GGC GAA ACC GTC GTT GAA 1015Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val Val Glu510 515 520CTG TGC CGC CGC TAC TAC GGT GAA GAA GAC GAA TCC GTT CTG CCA CGT 1063Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu Pro Arg525 530 535GGC ATT GCC ACC AAG AAG GCA TTC GAA AAC GCA ATG GCA CTG GAT ATG 1111Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu Asp Met540 545 550GCC ATG GGT GGA TCC ACC AAC ACC ATC CTC CAC ATC CTC GCA GCT GCC 1159Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu Ala Ala Ala555 560 565CAG GAA GGC GAA GTT GAC TTC GAC CTC GCA GAC ATC GAC GAA CTG TCC 1207Gln Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp Glu Leu Ser570 575 580 585AAA AAC GTC CCC TGC CTG TCC AAG GTT GCA CCA AAC TCC GAC TAC CAC 1255Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp Tyr His590 595 600ATG GAA GAC GTC CAC CGC GCC GGT CGC ATT CCA GCA CTG CTC GGC GAG 1303Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu Gly Glu605 610 615CTC AAC CGC GGT GGC CTG CTG AAC AAG GAC GTC CAC TCC GTT CAC TCC 1351Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val His Ser620 625 630AAC GAC CTT GAA GGT TGG TTG GAT GAC TGG GAT ATC CGC TCT GGC AAG 1399Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg Ser Gly Lys635 640 645ACC ACC GAA GTA GCA ACC GAA CTC TTC CAC GCA GCC CCA GGT GGC ATC 1447Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly Gly Ile650 655 660 665CGC ACC ACC GAA GCA TTC TCC ACC GAG AAC CGC TGG GAC GAA CTC GAC 1495Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu Leu Asp670 675 680ACC GAC GCT GCC AAG GGC TGC ATC CGC GAC GTT GAA CAC GCC TAC ACC 1543Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala Tyr Thr685 690 695GCC GAC GGC GGC CTG GTT GTT CTT CGC GGC AAC ATC TCC CCT GAC GGC 1591Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro Asp Gly700 705 710GCA GTG ATC AAG TCC GCA GGT ATC GAA GAA GAG CTG TGG AAC TTC ACC 1639Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn Phe Thr715 720 725GGA CCA GCA CGA GTT GTC GAA AGC CAG GAA GAG GCA GTC TCT GTC ATC 1687Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gln Glu Glu Ala Val Ser Val Ile730 735 740 745CTG ACC AAG ACC ATC CAA GCT GGC GAA GTT CTG GTC GTC CGC TAC GAA 1735Leu Thr Lys Thr Ile Gln Ala Gly Glu Val Leu Val Val Arg Tyr Glu750 755 760GGC CCA TCA GGT GGA CCA GGC ATG CAG GAA ATG CTT CAC CCA ACC GCA 1783Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu His Pro Thr Ala765 770 775TTC CTC AAG GGA TCC GGC CTG GGC AAG AAG TGT GCA CTG ATC ACC GAC 1831Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile Thr Asp780 785 790GGC CGT TTC TCC GGA GGT TCC TCA GGA CTG TCC ATC GGC CAC GTC TCC 1879Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His Val Ser795 800 805CCA GAA GCA GCA CAC GGC GGA GTC ATT GGT CTG ATC GAA AAC GGC GAC 1927Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn Gly Asp810 815 820 825ATC GTC TCC ATC GAC GTT CAC AAC CGC AAG CTC GAA GTT CAG GTC TCC 1975Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gln Val Ser830 835 840GAC GAG GAA CTC CAG CGC CGC CGC GAC GCT ATG AAC GCC TCC GAG AAG 2023Asp Glu Glu Leu Gln Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser Glu Lys845 850 855CCA TGG CAG CCA GTC AAC CGT AAC CGC GTT GTC ACC AAG GCA CTG CGC 2071Pro Trp Gln Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala Leu Arg860 865 870GCA TAC GCA AAG ATG GCT ACc TCC GCT GAT AAG GGT GCA GTC CGT CAG 2119Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val Arg Gln875 880 885GTC GAC TAACCCTTTG TGAGTGTTTG AGCACCGGTT CCCTACTTTG GGTTCCGGTG 2175Val Asp890CTTTTTCATG TCTTGGCCTG TGTGGGCGTG GTGGAGCTCC CCGTTGCAAA TACTCACCAC2235AAGTTGCAGG ATTTCTGCTG GTTGTGGTGG ATTTTCCCGC TTTATAGCCC TATGCGTGCA2295ACTTTCGGAC CGATTCCAAA GGGCAAAGCC CTGTTTGTGG TGGATCCTTG CCCTGGAAGC2355TTTCAGGAAC CACAACTACC CCACTGACCC CAAAGTGGAT AGGCCCTATT CTTCCGTTTA2415AGCGCCTCAA ACACCTCTCC CCACACTTGA CCCATTAGGC AATTACGAAT CCTTAAACAG2475CCTTCTACAG CACCATGCCC CAAACCGAAC CCAGGCATGA AAAAGACCCT CACCAGGAGG2535GTCTTTTTCT AAAACTTTGG CTACGCGATT GGGTTCACAC CCGCACCGAA CCACCACAGC2595AGAACTGCCG CTGCGATGCC GATGACCACG AAGATCCACG AGCTCACCAG TGGACGCTTT2655GCCCAACCTC GGCCAGAGTC AAGGGAAATC TTGCCGGGGC CGGTGAACTG AAGTCCGACA2715ACCACGATAG TGAGGATCAG TGCCAGCATC AATGGCTCAC TAAGTTCACC CCAACCACCT2775TCATGAGTGT TGACTTGGTG AAGGGTGGTA AAGGATGTCG CCACCGTGGC TACCGCTGCT2835GCCACTGGGG TCATCAGACC AAGGAGCAGG AAGACACCAG CCGCAAGTTC AATAGATGGA2895AGCAGGATCG CGAGGATTTC AGGCCACTGG TAACCAGCGA ACTCTGCCTC GACTCTA 2952(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特徵(A)長度612個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Ile Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala1 5 10 15Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe20 25 30Gly Lys Pro Ile Val Ala Ile Val Asn Ser Tyr Thr Gln Phe Val Pro35 40 45Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val50 55 60Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Val Asp Asp65 70 75 80Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg85 90 95Glu Ile Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala100 105 110Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly Met115 120 125Leu Asn Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser Gly130 135 140Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His145 150 155 160Ala Pro Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala165 170 175Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr180 185 190Cys Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu195 200 205Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala210 215 220Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val225 230 235 240Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu245 250 255Pro Arg Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu260 265 270Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu Ala275 280 285Ala Ala Gln Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp Glu290 295 300Leu Ser Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp305 310 315 320Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu325 330 335Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val
340 345 350His Ser Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg Ser355 360 365Gly Lys Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly370 375 380Gly Ile Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu385 390 395 400Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala405 410 415Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro420 425 430Asp Gly Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn435 440 445Phe Thr Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gln Glu Glu Ala Val Ser450 455 460Val Ile Leu Thr Lys Thr Ile Gln Ala Gly Glu Va1 Leu Val Val Arg465 470 475 480Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu His Pro485 490 495Thr Ala Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile500 505 510Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His515 520 525Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn530 535 540Gly Asp Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gln545 550 555 560Val Ser Asp Glu Glu Leu Gln Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser565 570 575Glu Lys Pro Trp Gln Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala580 585 590Leu Arg Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val595 600 605Arg Gln Val Asp610
權利要求
1.能在棒狀桿菌屬微生物中複製的任選重組的DNA，所述DNA得自棒狀桿菌屬並含有至少一個下列核苷酸序列，所述序列選自a)SEQ ID NO1所示的編碼panB基因(酮泛解酸羥基甲基轉移酶)的序列，b)SEQ ID NO1所示的編碼panC基因(泛酸合成酶)，尤其是panBC操縱子的序列，和任選地c)SEQ ID NO4所示的編碼ilvD基因(二羥酸脫水酶)的序列。
2.根據權利要求1的可複製DNA，該DNA含有(i)SEQ ID NO1，SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡併性的範圍內對應於(i)中各個序列的序列中的至少一個序列或(iii)與(i)或(ii)中各個序列的互補序列雜交的序列中的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中功能上中性的有義突變。
3.通過導入一種或多種根據權利要求1或2的可複製DNA而轉化的微生物，尤其是棒狀桿菌屬微生物。
4.穿梭載體pECM3ilvBNCD，其特徵在於，限制性圖譜如圖3所示，並作為大腸桿菌DH5αmcr/pECM3ilvBNCD被保藏，保藏號為DSM 12457。
5.穿梭載體pEKEx2panBC，其特徵在於，限制性圖譜如圖2所示，並作為大腸桿菌DH5αmcr/pEKEx2panBC被保藏，保藏號為DSM 12456。
6.生產泛酸的方法，其特徵在於，在棒狀桿菌屬微生物中將panB和panC基因和任選地將其它編碼相應酶的核苷酸序列增強(過量表達)，並將這些微生物用於發酵。
7.根據權利要求6的生產方法，其特徵在於，還增強(過量表達)了ilvD基因。
8.根據權利要求6或7的方法，其特徵在於，還增強(過量表達)了ilvBNCD基因。
9.根據權利要求6或7的方法，其特徵在於，為了達到增強的目的，通過用攜有基因或核苷酸序列的這些質粒載體進行轉化增加了微生物中基因或核苷酸序列的拷貝數。
10.根據權利要求6或7的方法，其特徵在於，為了達到增強的目的，突變了位於結構基因上遊的啟動子和調控區域。
11.根據權利要求6或7的方法，其特徵在於，為了達到增強的目的，將表達盒摻入了結構基因的上遊。
12.根據權利要求6或7的方法，其特徵在於，為了達到增強的目的，延長了利用基質由上述序列讀出的mRNA的壽命和/或防止相應酶蛋白質被降解。
13.根據權利要求6至12的方法，其特徵在於，在棒狀桿菌中過量表達了根據權利要求1的基因，所述棒狀桿菌還表現出代謝物抗性或抗代謝物抗性突變。
14.根據權利要求6至12的方法，其特徵在於，為了達到過量表達的目的，培養基和/或控制發酵的方式被改變。
15.根據權利要求6至14的方法，其特徵在於，微生物中至少一個減少泛酸鹽(泛酸)形成的代謝途徑被消除。
16.根據權利要求6至15的方法，其特徵在於，所用的微生物中除了一個或多個基因以外，其餘涉及泛酸形成的代謝途徑基因單獨地或聯合地被過量表達。
17.根據權利要求15的方法，其特徵在於，代謝途徑中ilvA基因被消除。
18.根據權利要求6至17中一項或多項的方法，其特徵在於，使用了含有穿梭載體pECM3ilvBNCD的棒狀桿菌屬微生物。
19.根據權利要求6至17中一項或多項的方法，其特徵在於，使用了含有穿梭載體pEKEx2panBC的棒狀桿菌屬微生物。
20.通過發酵根據上述權利要求中一項或多項的棒狀桿菌屬微生物生產泛酸的方法，其特徵在於，a)panB或panC基因中的至少一個，優選為panBC，任選與ilvD基因聯合被增強(過量表達)，和b)培養基或微生物細胞中的泛酸被富集，和c)分離泛酸。
21.根據權利要求19和20的方法，其特徵在於，在發酵過程中混入泛酸前體，所述前體選自天冬氨酸，β-丙氨酸，酮異戊酸，酮泛解酸或泛解酸。
全文摘要
能在棒狀桿菌屬微生物中複製的任選重組的DNA,所述DNA得自棒狀桿菌屬並含有至少一個選自下列的核苷酸序列:a)SEQ ID NO:1所示的編碼panB基因(酮泛解酸羥基甲基轉移酶)的序列,b)SEQ ID NO:1所示的編碼panC基因(泛酸合成酶),尤其是panBC操縱子的序列,和任選地c))SEQ IDNO:4所示的編碼ilvD基因(二羥酸脫水酶)的序列。使用棒狀桿菌屬微生物發酵生產D－泛酸的方法,所述微生物中上述基因被增強。
文檔編號C12R1/15GK1256313SQ99120978
公開日2000年6月14日 申請日期1999年12月1日 優先權日1998年12月1日
發明者L·埃格林, G·希爾巴克, H·薩姆 申請人:底古薩－胡爾斯股份公司, 於利希研究中心有限公司