東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的dgge分析方法
2023-08-04 11:01:56 2
東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的dgge分析方法
【專利摘要】一種東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的DGGE分析方法，主要解決傳統方法不能全面、準確的反映酸菜內的種群結構、細菌多樣性的問題，方法：1、酸菜樣品的預處理；2、提取酸菜樣品中微生物的總DNA；3、以提取的微生物的總DNA為模板，進行16SrRNA的PCR擴增；4、將PCR產物在進行DGGE電泳分析，電泳結束後染色、掃描儀成像，在PCR-DGGE圖譜上標記特異性條帶，切膠回收，最後在NCBI資料庫進行Blast比對，獲得微生物信息。即完成東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的DGGE分析方法，用於分析酸菜內細菌的多樣性。
【專利說明】東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的DGGE分析方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種自然發酵酸菜內細菌多樣性的分析方法【背景技術】
[0002]酸菜是將新鮮白菜用鹽水在密閉容器中泡製一段時間後形成的發酵蔬菜製品，自然發酵的酸菜賦予了其獨特的風味，這種獨特的發酵方式決定了其中微生物區系的多樣性，在酸菜發酵過程中會產生多種細菌，這些細菌分別在酸菜發酵的不同時期控制酸菜的發酵作用，使酸菜產生獨特的風味。
[0003]人們對酸菜內複雜的細菌種群的研究，多採用傳統的分離、純化和鑑定方法，不僅繁雜耗時，而且受培養條件和主觀因素影響較大，不能反映出酸菜內細菌的多樣性的真實情況，結果準確性及可靠性差，因此，傳統的培養方法不能全面客觀地反映酸菜內細菌的種群結構、細菌多樣性等信息。
[0004]DGGE(denatured gradient gel electrophoresis)變性梯度凝膠電泳最初是Fisher和Lerman等人 於20世紀80年代初期發明的主要用來檢測DNA片段中的點突變，後來該技術被廣泛用於微生物分子生態學研究的各個領域，目前已經發展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。原理是雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯醯胺凝膠電泳時，其遷移行為決定於其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區分。DGGE技術在一般的聚丙烯醯胺凝膠基礎上，加入了變性劑(尿素和甲醯胺)梯度或是溫度梯度，不同序列的DNA片段在各自相應的變性劑濃度下解鏈，發生空間結構的變化，導致電泳速度急劇下降，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區分開來。
【發明內容】
[0005]本發明東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的DGGE分析方法，按以下步驟進行:
[0006]1、酸菜樣品的預處理及菌體收集。
[0007]2、採用FastPrep結合CTAB法進行酸菜樣品中微生物的總DNA的快速提取。
[0008]3、以提取微生物的總DNA為模板，採用16S rRNA基因V3區具有特異性的引物對，進行細菌16S rRNA的PCR擴增，將PCR反應的產物用8% (質量/體積)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0009]4、將PCR產物按照如下條件進行DGGE電泳分析:選擇變性劑濃度梯度為35%~55%，現將電泳緩衝液預熱至60°C，以150V電壓預電泳lOmin，然後向每個加樣孔加入15 μ I的PCR產物，在150V電壓下，電泳7h。
[0010]5、電泳結束後對DGGE產物進行染色、掃描儀成像，得到DGGE圖譜。經過膠圖分析，在酸菜樣品細菌DGGE圖譜上標記特異性條帶，切膠回收。
[0011]6、回收的DNA條帶需重新進行PCR擴增，然後對產物進行測序，將測得的序列在NCBI資料庫進行Blast比對，確定細菌的歸屬，即完成東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的DGGE分析方法。
[0012]本發明的積極效果:
[0013]本方法能全面準確的反映酸菜內細菌的種群結構、細菌多樣性，與純培養方法相t匕，該方法具有操作簡便、快速、重複性好等優勢，在快速的同時還能對比分析大量樣品，因此它可以對比分析同一種酸菜不同發酵階段的細菌群落差異，也可以研究不同自然發酵酸菜的細菌群落差異。採用DGGE分析可以檢測到菌群中相對含量1%以上的菌，並可對微生物圖譜進行分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為酸菜發酵液樣品PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0015]圖2為酸菜發酵液樣品細菌總DNA的PCR-DGGE圖譜。
【具體實施方式】
[0016]為了更好地理解本發明，下面具體講述本發明的具體實施步驟:
[0017]1.酸菜發酵液樣品的預處理:
[0018]樣品為東北地區任意採集的自然酸菜樣品，樣品多點取自酸菜發酵汁液，混合後在5mL酸菜發酵液樣品中加入5mL PBS緩衝液，渦旋震蕩30s，然後350rpm離心5min，收集上清，12000rpm離心5min後，棄上清，收集菌體，在沉澱中加入800 μ L TE緩衝液回溶，用於微生物總DNA的提取。
[0019]2.酸菜發酵液中微生物總DNA的提取
[0020]採用Fast Prep (快速核酸提取儀)結合CTAB法進行微生物總DNA的快速提取。具體步驟如下:
[0021]⑴取預處理的步驟I中所述樣品於2mL破碎管中，加入0.5g玻璃珠，置於FastPr印核酸快速提取儀中，5.5m.s_l振蕩45s，快速裂解樣品。
[0022]⑵裂解:加入10% (質量/體積)SDS裂解液60 μ 1，混勻後12000rpm離心10min，轉移至1.5ml無菌離心管中，加入100 μ 15mol/l的Nacl,80ull0mol/1的CTAB, 65°C水浴20mino
[0023]⑶抽提:加入1ml的酚:氯仿:異戊醇=25:24:1 (體積比)，輕柔混勻，靜置lmin，12000rpm離心10min，取上清液再次進行抽提，加入1ml的氯仿:異戊醇=24:1 (體積比)，12000rpm離心10min,取上清液至無菌的1.5ml離心管中。
[0024]⑷沉澱:加500 μ I冰異丙醇，50 μ 13mol/L的NaAC，顛倒，靜置，混勻，_20°C放置30min,沉澱菌體，12000rpm 離心 lOmin。
[0025] (5)漂洗和風乾:棄上清液，加500 μ 170% (體積比)無水乙醇洗滌沉澱，輕輕混勻，12000rpm離心10min，棄上清，置於無菌操作臺中用垂直風吹乾，加30 μ ITE溶解沉澱，-20°C保存備用。
[0026]3.PCR 擴增
[0027]取1.5μ I提取的的總DNA為模板，採用16S rRNA基因V3區具有特異性的引物對進行 16S rRNA 的 PCR 擴增。引物序列為 V3F+GC: (5，-CGCCC GCCGCGCGCG GCGGG CGGGGCGGGGGC CCTACGG GAGGC AGCAG-3，)和 V3R: (5，-ATTACC GCG GCT GCT GG-3，)。[0028]擴增反應體系為50 μ 1，由下列成分組成:
【權利要求】
1.一種東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的DGGE分析方法，其特徵在於該方法按以下步驟進行: (1)、選擇酸菜樣品，對樣品進行預處理及菌體收集； (2)、採用FastPrep結合CTAB法進行酸菜樣品中微生物總DNA的快速提取； (3)、以提取的微生物的總DNA為模板，採用16SrRNA基因V3區具有特異性的引物對.進行細菌16S rRNA的PCR擴增，將PCR反應的產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測； (4)、將PCR產物進行DGGE電泳分析； (5)、電泳結束後對DGGE產物 進行染色、掃描儀成像，得到DGGE圖譜， 在酸菜樣品細菌DGGE圖譜上標記特異性條帶，切膠回收； (6)、回收的DNA條帶需重新進行PCR擴增，然後對產物進行測序，將測得的序列結果在NCBI資料庫進行Blast同源性對比分析，確定細菌的歸屬，即完成東北自然發酵酸菜中細菌多樣性的DGGE分析方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於在步驟(1)中，樣品為東北地區任意採集的自然酸菜樣品，樣品多點取自酸菜發酵汁液，混合後進行預處理。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於在步驟(1)中，對採集的酸菜樣品進行預處理，收集菌體，具體步驟如下:在5mL酸菜發酵液樣品中加入5mL PBS緩衝液，渦旋震蕩30s，然後350rpm離心5min,收集上清，12000rpm離心5min後,棄上清,收集菌體,在沉澱中加入800μL TE緩衝液回溶，用於微生物總DNA的提取。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於在步驟(2)中，採用FastPrep快速核酸提取儀結合CTAB法進行酸菜樣品中微生物總DNA的快速提取，具體步驟如下: ①取預處理的步驟(1)中所述樣品於2mL破碎管中，加入0.5g玻璃珠,置於Fast Prep核酸快速提取儀中，5.5m.s-1振蕩45s，快速裂解樣品； ②裂解:加入10%(質量/體積)SDS裂解液60μ1，混勻後12000rpm離心10min，轉移至`1.5ml 無菌離心管中，加入 100 μ I 5mol/l 的 Nacl, 80ull0mol/l 的 CTAB, 65°C水浴 `20min; ③抽提:加入1ml的酚:氯仿:異戊醇=25:24:1，輕柔混勻，靜置lmin，12000rpm離心`lOmin，取上清液再次進行抽提，加入1ml的氯仿:異戊醇=24:1，12000rpm離心10min，取上清液至無菌的1.5ml離心管中； ④沉澱:加500μI冰異丙醇，50μ I 3mol/L的NaAC，顛倒，靜置，混勻，-20°C放置30min,沉澱菌體，12000rpm 離心 IOmin; ⑤漂洗和風乾:棄上清液，加500μ 170% (積極比)無水乙醇洗滌沉澱，12000rpm離心`lOmin，棄上清，置於無菌操作臺中用垂直風吹乾，加30 μ ITE溶解沉澱，_20°C保存備用。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於其中步驟三中PCR擴增的反應體系為`50 μ I的反應體系，由下列成分組成:
6.根據權利要求1所述的 方法，其特徵在於其中步驟四中電泳儀器為Dcode的基因突變檢測系統，電泳條件為電壓150V，60°C下電泳7h，變性梯度為35%~55%。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952468SQ201410059200
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月21日 優先權日:2014年2月21日
【發明者】烏日娜, 武俊瑞, 於美玲, 嶽喜慶 申請人:瀋陽農業大學