檢測治療性外來體的方法

2023-08-04 20:09:56

檢測治療性外來體的方法【專利摘要】本發明人描述了一種檢測治療性外來體的方法，所述方法包括檢測外來體的活性。所述活性可以選自以下組：（a）免疫調節活性；（b）補體抑制活性；（c）蛋白酶體活性；（d）糖酵解酶活性；（e）抗氧化活性；（f）細胞外基質（ECM）修飾活性；（g）NT5E（CD73）外生-5』-外核苷酸酶活性；（h）離子穩態活性；以及（i）分子伴侶活性。如果所述外來體被檢測到具有一種或多種這些活性，所述外來體可能包括具有治療活性的治療性外來體。【專利說明】檢測治療性外來體的方法【
技術領域：
】[0001]本發明涉及醫學、細胞生物學、分子生物學和遺傳學領域。本發明涉及醫學領域。【
背景技術：
】[0002]外來體一度被認為是細胞的「垃圾袋」，用來丟棄不需要的蛋白質1O然而，外來體越來越多地被認為具有重要的生理功能，尤其是在細胞通訊中。[0003]外來體是許多細胞類型都有分泌的50-100nm的雙脂質膜泡2。它們屬於一類叫做微粒的分泌的細胞產物，其廣泛囊括了所有分泌的膜泡。除了外來體，微粒還包括微泡(100-1000ηm)、核外粒體(50-200ηm)、膜顆粒(50-80ηm)、外來體狀囊泡(20-50nm)和凋亡囊泡(50-500iim)。這些不同類別的微粒的主要區別參數是它們的大小，其中有最明確定義的類別是外來體。[0004]外來體在蔗糖中的密度為1.10至1.19克/毫升，在100，OOOg沉澱，具有富含膽固醇的脂質膜，其含有鞘磷脂、神經醯胺、脂筏和暴露的磷脂醯絲氨酸。外來體的生物合成是一個複雜的過程，涉及到通過生物合成和內吞途徑的複雜的細胞內膜運輸和物質分揀(cargosorting)。證實這種複雜生物合成的證據就是外來體的明顯特徵是擁有內質網和核內體的標識，例如Alix、Tsgl01、Rab蛋白等等。外來體在通過多泡體(MVBs)與質膜融合而釋放之前存儲在多泡體內。[0005]外來體被發現調節細胞間通訊，特別是在免疫或腫細胞中3Λ最近，當本發明人公布了人ESC起源的MSC的外來體把心肌缺血再灌注(ΜΙ/R)受傷小鼠模型中的梗死面積減少約50%時，延伸此項功能到包括組織修復9a°。這些外來體是使用HPLC上的尺寸排阻而純化為直徑約50-100ηm均勻大小的微粒，它們同時攜帶蛋白質和RNA載荷9，n，12。[0006]然而，MSC外來體的這種心臟保護作用的機制尚不確定。一部分原因可能是由於本發明人缺乏對外來體的一般生物效能的理解。儘管進行了大量針對來自各種細胞類型和生物液體的外來體的蛋白質組學和RNA概況的分析，外來體的蛋白質和RNA的生物效能在很大程度上仍然未被調查。截至目前，大多數生物效能的研究還局限在免疫細胞對外來體所作出的免疫反應上，特別是樹突細胞2，但這些生物反應的分子或生化基礎還沒有被闡明。【
發明內容】[0007]為了解決這個缺陷，本發明人對HPLC純化的外來體進行了全面的蛋白組學分析來首先確定存在於這些外來體中的蛋白，然後使用這些蛋白質來預測外來體內生物活性或潛能的類型。這繼而通過生化或細胞測定而得以證實。[0008]總共檢測到了866個獨特的基因產物，它們可以根據功能分成32個過度代表的生物過程，這表明外來體有潛力發揮廣譜的生物化學或細胞作用。為了評估這種潛力，本發明人選擇了這些蛋白，對於這些蛋白，可以評估其生化和/或細胞活動的測定是可以獲得的且該測定的總和可以證實外來體廣譜的生物化學和細胞潛力，並提供對MSC外來體的心臟保護性質的候選分子機理。[0009]這裡考察的蛋白質包括分解葡萄糖以生成ATP和NADH的糖酵解酶，增加糖酵解的PFKB3，水解AMP為能夠通過腺苷受體激活信號級聯的腺苷的CD73，抑制膜攻擊複合物(MAC)形成的CD59，和蛋白酶體20S。[0010]根據本發明的第一方面，本發明人提供了一種用於檢測治療性外來體的方法。該方法可以包括檢測外來體活性。該方法可以包括免疫調節活性。它可以包括補體抑制活性。它可以包括蛋白酶體活性。它可以包括糖酵解酶活性。它可以包括抗氧化活性。它可以包括細胞外基質(ECM)修飾活性。它可以包括NT5E(⑶73)外生-5』-外核苷酸酶活性。它可能包括離子穩態活性。它可以包括分子伴侶活性。它可包括上述的任何一個或多個活性。[0011]活性可以包括免疫調節活性。免疫調節活性可以通過檢測表DlO中列出的蛋白質的活性來檢測。[0012]活性可以包括補體抑制活性。補體抑制活性可以通過檢測表Dl中列出的蛋白質的活性來檢測。[0013]該活性可以包括蛋白酶體活性。蛋白酶體活性可以通過檢測表D2中列出的一個或多個，優選全部蛋白質的活性來檢測。[0014]該活性可以包括糖酵解酶活性。糖酵解酶活性可以通過檢測表D3中列出的一個或多個，優選全部，蛋白質的活性來檢測。[0015]該活性可以包括抗氧化活性。抗氧化活性可以通過檢測表D4中列出的一個或多個，優選全部，蛋白質的活性來檢測。[0016]該活性可以包括細胞外基質(ECM)修飾活性。細胞外基質(ECM)修飾活性可以通過檢測表D5中列出的一個或多個，優選全部，蛋白質的活性來檢測。[0017]該活性可以包括NT5E(CD73)外生-5』-外核苷酸酶活性。NT5E(CD73)外生_5』-外核苷酸酶活性可以通過檢測表D6中列出的一個或多個，優選全部，蛋白質的活性來檢測。[0018]該活性可以包括離子穩態活性。離子穩態活性可以通過檢測表D7中列出的一種或多種，優選全部，蛋白質來檢測。[0019]該活性可以包括分子伴侶活性。分子伴侶活性可以通過檢測表D8中列出的一種或多種，優選全部，蛋白質來檢測。[0020]該活性可以包括免疫調節活性。免疫調節活性可以通過檢測表DlO中列出的一種或多種，優選全部，蛋白質來檢測。[0021]如果一項活性被檢測到，外來體可能能夠抑制補體介導的細胞裂解。它也可以可替代的或可附加的，能夠減少梗死面積，例如在心肌缺血和再灌注損傷的小鼠或豬模型中檢測到的，或其能夠降低氧化應激，例如在過氧化氫(H2O2)誘導的細胞死亡的體外試驗中測定到的。它可以是上述兩個活動。[0022]如果一項活動被檢測到，外來體有可能包括一個具有治療活性的治療性外來體。[0023]該治療活性可以包括保護心臟的活性。[0024]該治療活性治療一個或多個疾病，其選自心力衰竭、骨髓疾病、皮膚疾病、燒傷和退行性疾病如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、癌症、心肌梗死、皮膚創傷、皮膚失調、皮膚病變、皮炎、銀屑病、溼疣、尋常疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮膚癌、異位性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚T細胞淋巴瘤、潰瘍、特徵是最初的損傷誘導導致炎症和免疫失調導致慢性組織重組的病理狀況，包括纖維化和功能喪失，腎缺血性損傷，囊性纖維化，鼻竇炎和鼻炎或者骨科疾病。[0025]本發明的第二方面提供一種方法，其包括以下步驟:(a)從間充質幹細胞條件培養物(MSC-CM)中分離外來體，任選地，包括從其他組分中基於分子量、尺寸、形狀、組成或生物活性分離外來體，以及(b)檢測所分離的外來體中上述活性，優選通過檢測上述一種或多種蛋白質的活性。[0026]本發明的第三方面提供生產外來體的方法，所述方法包括:(a)獲得間充質幹細胞條件培養物(MSC-CM);(b)濃縮間充質幹細胞條件培養物，例如用超過1000kDa的膜進行超濾；(c)將濃縮的間充質幹細胞條件培養物進行體積排阻色譜，如使用TSKGuard柱SWXL,6X40mm,或TSK凝膠G4000SWXL,7.8x300mm柱；(d)選擇UV吸收的部分，例如，在220nm處，表現出動態光散射，如由準彈性光散射(QELS)檢測出的；其中，步驟(d)舉例包括通過保留時間為11-13分鐘，如12分鐘來洗脫收集組分；並且檢測外來體中上文所述的活性，優選通過檢測一種或多種上文所述的蛋白質的活性。[0027]本發明的第四方面提供一種檢測外來體是否含有治療活性的方法，該方法包括檢測如上所述的酶活性，其中，如果檢測到酶活性，那麼外來體包含治療活性。[0028]本發明的實施，除另有說明外，將會使用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，其均在本領域普通技術人員的能力範圍內。這些技術在文獻中都有解釋。見，例如J.SambrookjE.F.Fritsch和T.Maniatisj1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二片反，Booksl-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等人，(1995和周期性的補充；CurrentProtocolsinMolecularBiology,第9、13和16章，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons；J.M.Polak和James0，D.McGee,1990，InSituHybridization!PrinciplesandPractice;OxfordUniversityPress；M.J.Gait(編輯)，1984，OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlbergj1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymologyjAcademicPress；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolN0.1byEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(編輯)，DavidLane(編輯)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2)，1855。HandbookofDrugScreening,由RamakrishnaSeethalajPrabhavathiB.Fernandes編輯(2001，NewYork,NYjMarcelDekkerjISBN0-8247-0562-9)；和LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,由JaneRoskams和LindaRodgers編輯，2002，ColdSpringHarborLaboratory，ISBN0-87969-630-3。全部這些文獻均通過引用併入本文。【專利附圖】【附圖說明】[0029]圖1是一個圖解，其顯示先前在MSC條件培養物裡鑑定的739種蛋白與在純化的外來體中鑑定的866種蛋白質的交叉。[0030]圖2是一個圖解，其顯示外來體蛋白的蛋白質組分析。外來體中866種基因產物可以在功能上分成32個過度代表的生物過程和三個未被充分代表的生物過程(P〈0.001)。421個在條件培養物(CM)中發現但不存在在於外來體中的蛋白按照功能分成11過度代表和2個未被充分代表的生物過程。黑條代表外來體中的基因產物的作用，白條代表在CM中找到但在外來體中未找到的基因產物的作用。[0031]圖3A至3D是顯示外來體調節糖酵解的示意圖。[0032]圖3A是糖酵解的示意圖。[0033]圖3B是條件培養物(CM)和外來體(EXO)中磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶M2亞型(PKm2)和pPFKFB3的Western印記分析。[0034]圖3C是MSC外來體中GAPDH、PGK和PKm2通過使用市售的測定試劑盒測定ATP或丙酮酸的生產來測定的酶活性。一個單位(U)的酶活性被定義為在37°C下每分鐘產生I微摩爾產物。[0035]圖3D，外來體對寡黴素處理的細胞中ATP生產的影響。H9C2心肌細胞用臺氏緩衝液(Tyrode’sbuffer)洗漆兩次，然後在含有20μηιο1線粒體抑制劑、寡黴素、6mmol葡萄糖培養基，有或無0.1μg/ml外來體的臺氏緩衝液中孵育15分鐘、30分鐘和60分鐘。細胞ATP濃度使用ATPlitel步發光ATP檢測測定系統測量，並相對於沒有外來體、15分鐘處的樣品進行標準化。*P=0.0173，**p=0.0090[0036]圖4A和4B是顯示外來體中20S蛋白酶體的示意圖。[0037]圖4A，MSC條件培養物(CM)和外來體(Exo)使用特異於PMSA1-7肽的抗體的Western印跡分析。[0038]圖4B，使用市售的蛋白酶體活性測定試劑盒(Millipore)測定MSC外來體中的蛋白酶體活性。蛋白酶體活性通過測量螢光探針肽在乳胞素(Iactacystin)(—種蛋白酶體抑制劑)存在或不存情況下的降解速率來測量。一個單位(U)酶活性被定義為在37°C下每分鐘產生Iumol產物。*Ρ=0.00023[0039]圖5Α至5C是顯示外來體通過ΝΤ5Ε(外生_5』-外核苷酸酶⑶73)磷酸化ERK和AKT的不意圖。[0040]圖5Α，使用特異性抗體針對MSCCM和外來體的CD73的Western印跡分析。[0041]圖5B，條件培養基(CM)和外來體(Exo)中⑶73活性通過來源於AMP水解的磷酸根離子的產生而測量。[0042]圖5C，H9C2細胞血清飢餓過夜，然後在有或沒有ImM茶鹼的培養基中溫育一小時。然後將細胞在已用50μM的AMP、0.1μg/ml外來體或AMP和外來體預是溫育30分鐘的培養基中暴露5分種。然後將這些細胞收穫並裂解。將IOyg的總蛋白用1:2000稀釋的兔抗pERK的1/2、1:2000稀釋的兔抗ERK1/2、1:500稀釋的兔抗pAKT或1:500稀釋的兔抗AKT進行免疫印記。[0043]圖6A至6B是顯示外來體抑制膜攻擊複合物(MAC)形成的示意圖。[0044]圖6A，MSC條件培養物(CM)和外來體(Exo)用CD59特異性抗體進行的Western印跡分析。[0045]圖6B，洗滌SRBC，然後重新懸浮於含有C5b6和C7的PBS中，存在或不存在外來體。將混合物在37°C下溫育15分鐘，然後加入C8和C9，用或不用封閉⑶59抗體來另外溫育30分鐘。將細胞離心，由裂解的SRBC釋放在上清液中的血紅蛋白量通過415nm處的吸光度而測量。陽性對照(總溶血)是用TritonX-100完全裂解的細胞的上清液。陰性對照是不加補充成分的樣品。陽性對照的吸光度值歸一化到100%*P=2.8E-06,**P=3.51E-08。[0046]圖7是顯示MSC外來體具有TLR配體的示意圖。[0047]圖8是顯示MSC外來體不激活TLR2的示意圖。[0048]圖9是顯示MSC外來體激活TLR4的示意圖。[0049]圖10是顯示MSC外來體誘導THP-1細胞的促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的生廣的不意圖。[0050]圖11是顯示⑶4+小鼠T細胞誘導分化成Treg(a)或Thl7(b)細胞的的示意圖。[0051]圖12A和圖12B是顯示通過先天免疫調節適應性免疫的示意圖。[0052]圖13是顯示外來體的伴刀豆球蛋白A激活的淋巴細胞增殖試驗的示意圖。【具體實施方式】[0053]哺乳動物細胞分泌含有蛋白質和RNA的外來體。可以假設，可以從健康的細胞中收穫和純化這些外來體用於補充和支持患病或不良細胞中的細胞資源，使這些細胞開始恢復和修復。例如，本發明人已經證明，從人類胚胎幹細胞來源的間充質幹細胞獲得的外來體可以挽救急性心肌缺血-再灌注損傷後的心肌細胞免於細胞死亡。在這裡，本發明人描述了這些外來體的生化性質。這些性質可以用來識別、選擇或評估外來體製劑用於治療病變的或不良細胞的治療潛力。[0054]處於作為損傷或疾病後果的苦惱中的細胞往往有著相似的細胞功能障礙。它們增加的線粒體膜通透性造成了ATP和NADH生產的減少，ROS水平增加和離子穩態的喪失，包括Na、Ca、K和Cl。也有由於變性蛋白質的積累導致的ER應激、包涵體形成和過度先天免疫反應。為了開始恢復和修復的過程，細胞必須首先糾正這些細胞功能障礙。由於外來體是含有蛋白質和RNA的分泌的磷脂囊泡，它們有傳遞可以迅速啟動必要的細胞活性以糾正這些細胞功能障礙的酶和RNA的潛能。[0055]在這裡，本發明人描述了治療性外來體的生化性質。這些生化性質包括[0056]a.補體活性的抑制(下表Dl)[0057]b.降解變性蛋白質的蛋白酶體活性(下表D2)[0058]c.生成ATP和NADH的糖酵解酶(下表D3)[0059]d.生成NADPH的戊糖磷酸途徑的酶[0060]e.抗氧化活性(下表D4)[0061]f.MMP/TIMP活性(下表D5)[0062]g.激活生存信號通路的⑶73外生-5』外核苷酸酶活性(下表D6)[0063]h.恢復離子穩態的ATP酶膜通道或轉運通道，如鈣、鈉、質子、鉀和氯通道(下表D7)[0064]1.保持蛋白質結構完整性的分子伴侶活性(下表D8)[0065]潛在的治療性外來體不應該只有具有這些生化活性的蛋白質，蛋白質還必須具有酶活性。因此，這些蛋白質的酶活性成為代替外來體製劑的治療功效的替代標記。[0066]本發明人因此提供了大量用於定義、鑑別和評估治療性外來體的生化測定。[0067]檢測治療性外來體[0068]本發明人描述了衍生自間充質幹細胞(MSC)的顆粒，例如外來體的生物學性質，特別是生化性質。[0069]根據這裡描述的方法和組合物，外來體包括以下一個或多個:Ca)補體抑制活性；(b)蛋白酶體活性；(c)糖酵解酶活性，(d)抗氧化活性；(e)細胞外基質(ECM)修飾活性；(f)NT5E(⑶73)外生-5』-外核苷酸酶活性；(g)離子穩態活性；(h)分子伴侶活性，可以包括治療活性，以及(i)免疫調節活性。[0070]一種包含這樣性質的外來體可以自然治療一些疾病，如下所述，換言之，是一種治療性外來體。術語「外來體」在本文檔中的使用在上下文允許的情況下應該被理解為包括「治療性外來體」。[0071]外來體可以通過幾種手段的任何一種從MSC中獲得，例如通過從MSC分泌、出芽或散布。例如，外來體可以從MSC生產、滲出、發射或脫落。如果是細胞培養中的MSC，外來體可被分泌到細胞培養基中。[0072]外來體可特別包括囊泡。這裡所描述的治療性外來體可以包括本文所描述的外來體的任何一個或多個性質。[0073]外來體可以包括由脂雙層限制的囊泡或扁平球體。外來體的可包括40_100nm的直徑。外來體可以通過核內體膜的向內出芽形成。外來體可以具有?1.13-1.19克/ml的密度，並在蔗糖梯度上漂浮。外來體富含膽固醇和鞘磷脂，如GM1、GM3、浮艦蛋白(flotillin)和src蛋白激酶Lyn的脂筏標記。外來體可以包括一種或多種存在於間充質幹細胞或間充質幹細胞條件培養物(MSC-CM)中的蛋白質，如一個擁有MSC或MSC-CM的特徵的或者特異於MSC或MSC-CM的蛋白質。[0074]本發明人提供了一個外來體，其包括在MSC中發現的或是在通過培養MSC而條件化的介質中發現的一個或多個含有治療活性的基因。這樣的治療性外來體可以通過檢測顯示一個或多個活性的外來體來鑑別，這些活性選自:a)補體抑制活性；(b)蛋白酶體活性；(c)糖酵解酶活性；(d)抗氧化活性；(e)細胞外基質(ECM)修飾活性；(f)NT5E(⑶73)外生-5』-外核苷酸酶活性；(g)離子穩態活性；(h)分子伴侶活性；以及(i)免疫調節活性。[0075]外來體可以包括由MSC分泌的分子。這樣一個外來體和包含在其中的分子的任何分子組合(包括特定的蛋白質或多肽)可以被用於補充MSC或被MSC條件化的培養物的活性或者代替MSC或被MSC條件化的培養物，以用於例如治療或預防疾病的目的。[0076]外來體可能包括在細胞骨架中發現的細胞溶質蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白，細胞內的膜融合和運輸，如膜聯蛋白和Rab蛋白，信號轉導蛋白，如蛋白激酶、14-3-3和異三聚體G蛋白，代謝酶，如過氧化物酶、丙酮酸和脂質激酶和烯醇化酶-1,以及四跨膜蛋白家族，例如⑶9、⑶63、⑶81和⑶82。特別是，外來體可以包括一個或多個四跨膜蛋白。外來體可以包括mRNA和/或microRNA。[0077]術語「顆粒」，其包括外來體，在本文中的使用可以被解釋為一個獨立的實體。所述顆粒可以是從間充質幹細胞(MSC)或間充質幹細胞條件培養物(MSC-CM)分離出來的物質。該顆粒可以負責至少一個MSC或MSC-CM活性。該顆粒可負責，並執行，實質上大部分或所有的MSC或MSC-CM的功能。例如，該顆粒可以是MSC或MSC-CM的替代品(或生物替代品)。[0078]當術語「顆粒」在本文中使用時，其應被理解為包括(只要情況允許)外來體的同義ο[0079]外來體可用於MSC或MSC-CM可被投入使用的任何治療目的。[0080]外來體優選具有至少一個間充質幹細胞的性質，例如治療性質。外來體可以具有生物性質，例如生物活性。外來體可以具有MSC的任何生物活性。例如,外來體可以具有MSC的治療或恢復活性。[0081]已知使用MSC條件化的介質(如間充質幹細胞條件化的培養物或MSC-CM，如下所述)包括MSC的生物活性，能夠替代MSC本身-參見例W02009/105044。因此，MSC的生物學性質或生物活性可能對應於經過間充質幹細胞條件化的培養物的生物性質或活性。因此，外來體可以包括間充質幹細胞條件化的培養物(MSC-CM)的一個或多個生物性質或活性。[0082]這裡所描述的治療性外來體可能從間充質幹細胞條件培養物(MSC-CM)中分離出來，並檢測以下一種或多種活性的存在:(a)補體抑制活性；(b)蛋白酶體活性；(C)糖酵解酶活性；(d)抗氧化活性；(e)細胞外基質(ECM)修飾活性;(f)NT5E(CD73)外生-5』-外核苷酸酶活性；(g)離子穩態活性；(h)分子伴侶活性；以及(i)免疫調節活性。[0083]活性檢測[0084]每一種上述活性均可以在治療性外來體中通過本領域中已知的多種方式進行檢測。例如，相關活性可以通過檢測負責治療性外來體活性的蛋白質或多肽的存在來檢測。這可以通過例如使用同源抗體和本領域已知的免疫測定法和Western印跡等檢測抗體和蛋白質之間的結合實現。[0085]概言之，I個酶活性單位(U)定義為每分鐘生產I微摩爾產品所需的活性。[0086]檢測活性的Western印記方案[0087]一個使用Western印跡雜交經由蛋白質或多肽檢測活力的範例方案載列如下。[0088]在4-12%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離12μg外來體，電轉染到硝酸纖維素膜上。把膜轉移到SNAP1.d.系統(Milliporeinc.，Billerica，MA)的膜支架中，封閉並和抗人一抗一起溫育，抗人一抗包括小鼠抗GAPDH(1:100稀釋)，小鼠抗PGK(1:60)，小鼠抗P⑶(1:60)，兔抗？?1^83(1:60)，小鼠抗丙酮酸激酶(PK，1:200)，小鼠抗20S蛋白酶體α1-7(1:200)，小鼠抗0)73(1:60)和小鼠抗CD59(1:200)。然後，印跡與辣根過氧化物酶偶聯的第二抗體一起孵育。所用的第二抗體是山羊抗小鼠IgG(1:1250)或驢抗兔IgG(1:1250)。所有的抗體均獲得自SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,除鼠抗PK購自AbeamInc.，Cambridge,MA外。然後將印跡與HRP-增強的化學發光底物(ThermoFisherScientificInc.,Waltham,MA)一起孵育,然後曝光於X射線膠片。[0089]液相色譜-質譜(LCMS)或質譜(MS)[0090]也可以使用如質譜的其他方法來檢測存蛋白質或多肽在外來體中的存在。LCMS在「BasicsofLC/MSPrimer」(AgilentTechnologies)文件中有詳細說明，網址為http://www.chem.agilent.com/Library/Support/Documents/a05296.pdf[0091]使用液相色譜-質譜(LCMS)或質譜(MS)的一個範例方案載列如下。[0092]根據描述(20)，將兩毫升透析的外來體中的蛋白質進行還原、烷基化和胰蛋白酶消化。然後，通過將消化的混合物通過條件化的S印-PakC-18SPE柱(Waters,Milford,MA,美國)，並用3%的乙腈(ACN)(JT8&1^1^1^111?吐11找，町)和0.1%甲酸斤六)緩衝液清洗兩次，並用70%ACN和0.1%FA緩衝液洗脫將樣品進行脫鹽。然後，將洗脫下來的樣品通過真空離心除去有機溶劑乾燥至約10%的其初始體積。為了減少樣品的複雜性，通過一個配置了PolysulfoethylSCX柱(200mmX4.6mm(PolyLC,美國)的HPLC系統(Shimadzu,日本)進行了離線肽分餾。流動相A(5mMKH4P04+30%乙腈)和流相B(5mMKH4P04+30%乙腈+350mMKCl),lml/min。收集8個懼分，並用真空離心乾燥。分級的樣品被裝入到ShimadzumicroHPLC系統的自動進樣器,ShimadzumicroHPLC系統在線連接到配備了納米噴霧源(nanospraysource)的LTQFT超線性離子講質譜儀(ThermoElectron,Bremem,德國)。注射入的肽陷入Zorvax300SB_C18富集柱中(5mmx03mm,AgilentTechnologies,德國)並在其中脫鹽，並且洗脫進入納米鑽孔的C18填充柱(75μmx100A,MichromBioresources,Auburn,CA)0使用分流器(splittertoanmminute)以恆定流速20ηL/min到有效流速200ηL/min的901/min梯度洗脫進入質譜儀的肽。以數據依賴模式、通過進行FTMS中來自於每一個MS掃描的最強烈的峰中的八個峰的MS/MS掃描來操作LTQ。對於每個實驗，都通過一個自己編寫(home-written)的程序把八個SCX組分的MS/MS(dta)譜合併成一個單一的mascot通用文件。蛋白質鑑定通過內部的Mascot伺服器(版本2.2.04,MatrixScience,英國)在IPI人類蛋白質資料庫(版本3.34;69，164條序列，29，064，825個殘基)中搜索合併後的數據獲得。搜索參數是:使用胰蛋白酶的2個錯過的分裂的最大值；固定的修飾是半胱氨酸的氨甲醯甲基化修飾，可變修飾是蛋氨酸的氧化。肽前體和片段離子的質量公差分別設定為IOppm和0.SDa0如果發現兩個不同的肽具有高於同源性得分的得分，蛋白質鑑定接受為真陽性。[0093]補體抑制活性[0094]治療性外來體中補體抑制活性可以通過檢測蛋白質的任一個或多個或它們的活性來檢測，例如表Dl中所列出的，藉此鑑定它們為治療性外來體。[0095]表Dl[0096]【權利要求】1.一種檢測治療性外來體的方法，所述方法包括檢測外來體的選自以下組的活性:Ca)免疫調節活性；(b)補體抑制活性；(C)蛋白酶體活性；(d)糖酵解酶活性；(e)抗氧化活性；(f)細胞外基質(ECM)修飾活性；(g)NT5E(CD73)外生-5，-外核苷酸酶活性；(h)離子穩態活性；以及(i)分子伴侶活性。2.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括免疫調節活性，所述免疫調節活性通過檢測表DlO中所列的蛋白的活性進行檢測。3.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括補體抑制活性，所述補體抑制活性通過檢測表Dl中所列的蛋白的活性進行檢測。4.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括蛋白酶體活性，所述蛋白酶體活性通過檢測表D2中所列的一個或多個，優選所有的，蛋白的活性進行檢測。5.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括糖酵解酶活性，所述糖酵解酶活性通過檢測表D3中所列的一個或多個，優選所有的，蛋白的活性進行檢測。6.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括抗氧化活性，所述抗氧化活性通過檢測表D4中所列的一個或多個，優選所有的，蛋白的活性進行檢測。7.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括細胞外基質(ECM)修飾活性，所述細胞外基質(ECM)修飾活性通過檢測表D5中所列的一個或多個，優選所有的，蛋白的活性進行檢測。8.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括NT5E(⑶73)外生-5』-外核苷酸酶活性，所述NT5E(⑶73)外生-5』-外核苷酸酶活性通過檢測表D6中所列的一個或多個，優選所有的，蛋白的活性進行檢測。9.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括離子穩態活性，所述離子穩態活性通過檢測表D7中所列的一個或多個，優選所有的，蛋白的活性進行檢測。10.根據權利要求1的方法，其中所述活性包括分子伴侶活性，所述分子伴侶活性通過檢測表D8中所列的一個或多個，優選所有的，蛋白的活性進行檢測。11.根據前述任一項權利要求的方法，其中，如果一個活性被檢測到，所述外來體可能能夠:(i)抑制補體介導的細胞裂解減少梗死面積，例如在心肌缺血再灌注損傷的小鼠或豬模型中所檢測的，或者其能夠降低氧化應激，例如在過氧化氫(H2O2)誘導的細胞死亡的體外試驗中所檢測的，或(i)和(ii)二者。12.根據權利要求11的方法，其中治療活性包括心肌保護活性。13.根據權利要求11的方法，其中治療活性針對一種或多種選自以下組的疾病:心力衰竭、骨髓疾病、皮膚疾病、燒傷和退行性疾病如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、癌症、心肌梗死、皮膚創傷、皮膚失調、皮膚病變、皮炎、銀屑病、溼疣、尋常疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮膚癌、異位性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚T細胞淋巴瘤、潰瘍、特徵是最初的損傷誘導炎症和免疫失調導致慢性組織重構的病理狀況包括纖維化和功能喪失、腎缺血性損傷、囊性纖維化、鼻竇炎和鼻炎或者骨科疾病。14.一種方法，其包括以下步驟:(a)從間充質幹細胞條件培養物(MSC-CM)中分離外來體，任選地，包括從其它組分中基於分子量、尺寸、形狀、組成或生物活性分離外來體，以及(b)檢測所分離的外來體中的權利要求1所列的活性，優選通過檢測一種或多種權利要求2至9任一項所列的蛋白質的活性。15.—種生產外來體的方法，所述方法包括:(a)獲得間充質幹細胞條件培養物(MSC-CM)；(b)濃縮間充質幹細胞條件培養物，例如用超過1000kDa的膜進行超濾；(c)將濃縮的間充質幹細胞條件培養物進行體積排阻色譜，如使用TSKGuard柱SWXL，6x40mm或TSK凝膠G4000SWXL，7.8x300mm柱；(d)選擇UV吸收的部分，例如，在220nm處，表現出動態光散射，如由準彈性光散射(QELS)檢測出的；其中，步驟(d)舉例包括保留時間為11-13分鐘，如12分鐘來洗脫收集組分；並且檢測外來體中權利要求1所列的活性,優選通過檢測一種或多種權利要求2至9任一項所列的蛋白質的活性。16.一種參考附圖的圖1至13和如附圖的圖1至13中所示的基本上如下所述的方法。【文檔編號】G01N33/48GK103635800SQ201280017773【公開日】2014年3月12日申請日期:2012年2月10日優先權日:2011年2月11日【發明者】林賽娟申請人:新加坡科技研究局