核苷酸分子septin1sr1及其在製備免疫製劑中的應用的製作方法

2023-07-22 11:19:41 2

專利名稱：：核苷酸分子septin1sr1及其在製備免疫製劑中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞生物學領域，提供了一種核苷酸分子，即SEPTIN1SR1，本發明還提供了該核酸分子在製備免疫製劑中的應用。
背景技術：
：S印tin是一個GTP酶家族，最早是在5"acc/ar卿ycescereWw'ae酵母中被鑑定的。S印tin的功能研究主要有兩方面首先是S印tin蛋白形成10nni直徑的頸絲環繞胞漿膜內側的母芽頸一周，作為胞質運動相關蛋白的載物臺[Bi，E.，Maddox,P.,Lew,DJ.，"a丄(1998)/Ce"^io丄142:130卜1312.;Boyne,JR.,Yosuf，國.，Bieganowski，P.,etW(2000)/CeW113:4533-4543.]。次之，S印tin與極性生長的調節有關[Barral，Y.'Mermall,V.，Mooseker，MS.,eta丄(2000).#o〗Ce".5,841-851;Takizawa,PA.，Derisi,幾.，Wilhelm,JE.，eta丄(2000).5bj'e/7ce.290,341-344]。然而，尚未有人報導關於S印tinl在製備免疫製劑中的應用。自身免疫性疾病(autoimmunediseases)是指機體對自身抗原發生免疫反應而導致自身組織損害所引起的疾病。自從Donath與Landsteiner提出此概念以來，許多疾病相繼被列為自身免疫性疾病，常見的自身免疫病有系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、硬皮病、甲狀腺機能元進、青少年糖尿病v原發性血小板紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結腸炎以及許多種皮膚病、慢性肝病，等等。這些病名對許多人來說並不很陌生。這類疾病的治療有一個共同點，都需要用免疫抑制劑來抑制針對自身機體的免疫反應。最常用的是腎上腺皮質激素類製劑，如強的松、氫化可的松、地塞米松等，大家往往將其簡稱"激素"。如果療效不佳，還可能用環磷醯胺、氨甲喋呤等所謂細胞毒性藥物，這些藥既可用來抑制免疫，又用於治療癌症。所有免疫抑制劑有個主要的共同的不良作用，它們會不同程度地影響機體的抗感染、抗腫瘤免疫功能。因此，眾多專家一直在研究其他治療方法。自身免疫性疾病的發病機制很複雜，但自身反應性T細胞、B細胞的激活，是自身免疫性疾病發病過程中一個必然的環節。因而，許多學者將自身免疫性疾病分為T細胞介導的、自身抗體介導的、及聯合介導的自身免疫性疾病三種。B細胞激活後的重要產物——自身抗體已作為診斷自身免疫性疾病的標誌物，而目前還沒有常規檢測自身反應性T細胞的特異性指標。因此，自身免疫性疾病的治療和相關藥物是目前醫藥界一個重要課題。
發明內容本發明的目的是提供一種用於製備免疫製劑的核酸分子。本發明的另一個目的是提供上述核酸分子的應用。本發明提供了一種用於製備免疫製劑的核酸分子，它的序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。在本發明中被稱為SEPTIN1SR1。在本發明中，術語"核苷酸分子SEPTIN1SR1"指具有抑制SEPTIN1蛋白活性並且含有與AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU序列高度同源的核苷酸序列。該術語還包括與AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU的同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。該術語還包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地l-5個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數個(通常為IO個以內，較佳地為5個以內)核苷酸。例如，在AUUCAUCGAGGAGCAAUUU或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU後(3'端)加入若干dT(脫氧胸苷)後形成的序列。本發明中，SEPTIN1SR1的序列可以包括ATTCATCGAGGAGCAATTT和AAATTGCTCCTCGATGAAT。本發明中，SEPTIN1SR1的序列可以包括5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3，或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。本發明中，SEPTIN1SR1的序列可以是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。本發明中，SEPTIN1SR1的序列可以是ATTCATCGAGGAGCAATTT禾口AAATTGCTCCTCGATGAAT。本發明中，SEPTIN1SR1的序列可以是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'和5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3，。本發明還提供了上述核酸分子的製備方法，即按本發明中，SEPTIN1SR1的序列可以將各核糖核酸基團或者脫氧核糖核酸基團依次脫水縮合。本發明還提供了上述核酸分子在製備免疫製劑中的應用。本發明的SEPTIN1SR1是SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以特異性的阻滯淋巴細胞的分裂或促進淋巴細胞其凋亡。研究表明，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤、腦、心臟、外周血白細胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，S印tinl蛋白只在外周血、胸腺和脾臟的淋巴細胞中大量表達，這說明S印tinl蛋白主要在淋巴細胞中發揮功能，而不會對其它組織或者細胞起作用。細胞水平實驗顯示，以表達正常S印tinl的細胞為對照，S印tinlS206A(即在S印tinl蛋白206位胺基酸殘基由絲氨酸突變為A)突變體會使細胞不進入G2期，即細胞不能分裂；S印tinlS206E(即在S印tinl蛋白206位胺基酸殘基由絲氨酸突變為E)突變體使G2期細胞大大增加，即促進細胞分裂。這說明S印tinl可調控細胞分裂，尤其是206位的絲氨酸殘基。這也說明，如果將S印tinl蛋白206位胺基酸殘基由絲氨酸突變為A、抑制S印tinl蛋白活性或者使S印tinl蛋白失活，就白的抑制劑或者失活劑，施用於細胞，就可以使細胞停止分裂。另一方面，一旦篩選到了S印tinl蛋白的增強劑，施用於細胞，就可以使細胞加速分裂生長。綜上所述，S印tinl可調控細胞分裂，尤其是淋巴細胞的細胞分裂。S印tinl的突變體或者抑制劑可以特異性的促進淋巴細胞的分裂停滯或者凋亡。而本發明的SEPTIN1SR1作為SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以特異性的阻滯淋巴細胞的分裂或促進淋巴細胞其凋亡，因而，可以與適當的載體結合製成免疫製劑。本發明中，所述的免疫製劑可以用於治療和緩解自身免疫性疾病。本發明中，所述的自身免疫性疾病包括系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、甲狀腺機能亢進、青少年糖尿病、原發性血小板紫癜和自身免疫性溶血性貧血等。上述疾病的共同點就是自身反應性T細胞、B細胞的激活。本發明的S印tiril是淋巴細胞正常生長增殖所必需的。SEPTIN1SR1作為SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以使細胞不進入G2期，即細胞不能分裂；將其施用於上述自身免疫性疾病患者，就可以特異性的使淋巴細胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細胞的生長增殖，骨髓移植(Bonemarrowtransplantation)是各種血液腫瘤、再生不良性貧血症、重度地中海型貧血症以及一些先天性免疫缺乏症或代謝性疾病救命的根本治療方法。在骨髓移植手術期間，由於成熟免疫細胞被一率殺滅，患者的免疫力極其低下，需要住在無菌室進行治療，給患者帶來了非常大的痛苦。SEPTIN1SR1作為SEPTIN1蛋白的抑制劑，可以特異性的促進淋巴細胞的分裂停滯或者凋亡，將其用於骨髓移植及其前期準備工作，就可以特異性的使淋巴細胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細胞的生長增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態、縮短患者的恢復時間，減輕患者及其家屬的負擔。本發明的SEPTIN1基因可以採用各種常規的製備方法製備。本發明的SEPTIN1基因序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明的SEPTIN1核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。在本發明中，術語"SEPTIN1基因"指編碼具有SEPTIN1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列號為(NCBI登陸號NM一052838)的序列及其簡併序列。該簡併序列是指該核酸序列開放閱讀框中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與該核酸序列開放閱讀框序列同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出神經元分化相關基因SEPTIN1的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與剛—052838開放閱讀框序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與剛—052838開放閱讀框序列的同源性至少70%,較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼序列號為NP—443070胺基酸序列的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為l-90個，較佳地1-6個，更佳地1-20個，最佳地1-IO個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。獲得了SEPTIN1基因序列後，就可以將SEPTIN1基因序列插入適當的表達載體，以獲得重組表達質粒。一旦獲得了含有SEPTIN1基因序列的重組表達質粒，就可將其轉化到相應宿主中進行蛋白表達。本發明的SEPTIN1SR1，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。SEPTIN1SR1可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的人SEPTIN1可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的SEPTIN1還可與其他治療劑一起使用。當本發明的SEPTIN1SR1被用作藥物時，可將治療有效劑量的該抑制劑施用於哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。本發明中，所述的免疫製劑是由含有效治療量的SEPTIN1SRI和藥學上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至5微克/千克體重。本發明還提供了一種用於治療自身免疫性疾病的試劑盒。該試劑盒中包括SEPTIN1SR1。該試劑盒還可含有使用說明、分子標記、將S印tinl蛋白的抑制劑引入細胞或者組織所需的其他試劑，例如緩衝液等。將SEPTIN1SR1引入細胞或者組織，可以將細胞的有絲分裂停滯在S期，即使細胞不分裂，或者使細胞發生凋亡，從而抑制病變的淋巴細胞生長增殖。本發明的SEPTIN1SR1可以特異性的促進淋巴細胞的分裂停滯或者凋亡。將SEPTIN1SR1用於自身免疫性疾病患者，就可以特異性的使淋巴細胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細胞的生長增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態、縮短患者的恢復時間，減輕患者及其家屬的負擔。圖1為S印tinl的組織表達譜圖。其中，1為心臟、2為腦、3為胎盤、4為肺、5為肝、6為骨胳肌、7為腎、8為胰腺、9為脾臟、IO為胸腺、ll為前列腺、12為睪丸、13為卵巢、14為小腸、15為大腸、16為外周血白細胞。圖2為s印tinl蛋白在17種人類細胞系中的表達情況圖。圖3為s印tinl蛋白與CK2互作IB-免疫印跡雜交試驗的結果。圖4為s印tinl蛋白在Jurkat細胞株的定位結果。圖5為s印tinl蛋白被CK2體內磷酸化的結果。圖6為s印tinl蛋白被CK2體外磷酸化的結果。圖7為septinl蛋白在Jurkat細胞株內被SEPTIN1SR抑制的結果。圖8為空載體轉染Jurkat細胞株的細胞周期分析結果。橫坐標為基因組數。為圖9-ll空白對照，由流式細胞儀分析而得。圖9為野生型s印tinl蛋白轉染Jurkat細胞株的細胞周期分析結果。橫坐標為基因組數。為圖10-ll的對照，由流式細胞儀分析而得。圖10為s印tinl蛋白S206A突變體轉染Jurkat細胞株的細胞周期分析結果。橫坐標為基因組數，由流式細胞儀分析而得。可見，與圖8和9相比，G2期細胞幾乎沒有。圖11為s印tinl蛋白S206A突變體轉染Jurkat細胞株的細胞周期分析結果。橫坐標為基因組數，由流式細胞儀分析而得。可見，與圖8和9相比，G2期細胞明顯增加。具體實施方式下列實施例中，未註明具體條件的實驗方案，通常按照常規條件，如Sambrook等人的《分子克隆》實驗室手冊(NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或者按照生產商建議的條件進行操作。實施例1S印tinl的組織中的表達情況1.1Northern探針製備用ClontechMultipleTissuenorthen膜檢測成人組織中s印tinl基因的分布情況，所用探針為克隆到的s印tinl全長開放閱讀框(即NCBI登陸號腦—052838所示核苷酸序列中第188到1291位)。1)用s印tinl基因的特異的引物從構建好並己經測序的質粒中擴增得到PCR產物。PCR產物用QIAquickPCR純化試劑盒純化後，用GeneQuantII型紫外分光光度計測定純化後DNA的濃度。2)DNA模板經100。C熱變性2min後，用隨機引物標記試劑盒以隨機引物標記法摻入Y-32PdCTP。標記反應結束後，加入EDTA至終濃度20隱ol/L中止反應，IOO'C熱變性5min，置於冰上。3)將探針用MicroSpinG-25純化柱純化。純化前後分別取樣lW稀釋IOO倍，取3W稀釋液點樣在WhatmanDE81濾紙上，用Monitor900型放射性檢測儀測定其放射強度(cps)。將純化後的放射性強度除以純化前的放射性強度記為摻入率，摻入率大於30%則認為探針製備合格。1.2Northen雜交1)將雜交膜用2XSSC液潤溼後將膜帶RNA的一面朝上放入雜交管中，每10cm2膜面積加入lml甲醯胺預雜交液，預雜交液含50%甲醯胺，5XSSPE，lXDenhardt試劑，2%SDS,1000mg/L小牛胸腺DNA。42。C預雜交2-4小時。2)預雜交結束後，將純化後的標記探針加入剩餘的預雜交液中。42'C雜交48小時。3)雜交反應結束後，將雜交液棄去，加入雜交洗脫液l(2XSSC，0.05%SDS)室溫洗滌3次，每次30min，其間不停晃動膜。然後加入雜交洗脫液2(0.IXSSC，O.1%SDS)，5(TC洗滌2次，每次30min。用Monitor900型放射性檢測儀測定整張膜上的放射強度。如果背景的放射強度過高，可以適當的提高洗膜溫度，再次洗滌。4)將洗滌完畢的膜放入保鮮袋中封口，進行放射自顯影.結果顯示，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤、腦、心臟、外周血白細胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，S印tinl的mRNA僅在外周血、胸腺、脾臟等組織中有表達，而且在胸腺中表達量最高。詳見圖l。實施例2western-blot分析s印tinl蛋白在17種人類細胞系中的表達情況1、17種人類細胞系的培養所選17種細胞均來自中國科學院細胞庫，其組織來源及培養條件如下tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11(2)分別取每種上清10W進行SDS-PAGE電泳。(3)用BIORAD轉移系統，將蛋白從聚丙烯醯胺凝膠轉至硝酸纖維素薄膜上，冰浴中轉移2hr，電壓為100V。置於麗春紅染色液中510min,水洗去染料，標記蛋白標準分子量條帶。(4)封閉將膜放置於30ml封閉緩衝液中，室溫下置於搖床震蕩lhr。(5)—抗反應按推薦的稀釋比加入s印tinl特異性抗體(購於SANTACRUZ公司)，將膜浸於稀釋好的一抗中，室溫下搖床孵育2hr;用洗滌緩衝液洗膜4次，每次10min;(6)二抗反應按1:1,0000的稀釋比加入HRP耦聯的抗羊抗體，將膜浸於稀釋好的二抗中，室溫下搖床孵育lhr;用洗滌緩衝液洗膜4次，每次10min。(7)ECL發光反應把膜用三倍稀釋或不稀釋的ECL發光試劑顯影曝光。結果顯示，S印tinl主要在T細胞(Jurkat，ATCC;6T-CEM，購自中國科學院生命科學學院)和B細胞(EB-3,ATCC)中表達。實施例3S印tinl在Jurkat細胞中的定位本發明中，首先將全長s印tinl的cDNA構建入Ds-Red-Cl螢光表達載體。將所得的RFP一s印tinl重組子轉染入Jurkat細胞中，培養48小吋，經過固定處理後，雷射共聚焦顯微鏡下觀察。具體步驟如下(1)收取懸浮培養的Jurkat細胞，充分打散後滴加在塗有多聚賴氨酸的載波片上，靜置5min後置於4X的多聚甲醛中室溫固定10min(分鐘)。(2)PBS洗三遍，於O.2%TritonX-100中室溫打孔15min。(3)PBS洗三遍，於含有10%馬血清、1%BSA的TBS中室溫封閉1hr(小時)。(4)TTBS洗一遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的一抗(抗s印tinl抗體，1:20)，37°C孵育2hr。(5)TTBS洗三遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的二抗(Rhodamine-抗羊，1:100)，37°C孵育lhr。(6)TTBS洗三遍，於lPgDAPI溶液中37°C染色20min。(7)TTBS洗三遍，封片，上螢光顯微鏡觀察。結果顯示，發現s印tinl呈細胞質分布(如圖4)，且其分布具有一定的極性，另外，其分布隨細胞周期的變化有所不同，在細胞分裂的全過程中，s印tinl極有可能在紡錘體兩極的中心粒周圍分布，在中期以後，s印tinl還會在兩細胞分裂溝處聚集。實施例4pull-down檢測s印tinl蛋白與CK2激酶的互作1、將瞬時轉染有PCMV-Myc-CK2a的細胞裂解液(細胞數5X106)與50pl50%的穀胱甘肽瓊脂糖珠和2(^g的GST在搖床上4。C孵育2h.2、4°C，2000rpm離心2分鐘。3、將上清轉移到新的離心管中，分為兩等份，各加入50pl穀胱甘肽瓊脂糖珠，其中一管加入10(ag的GST蛋白，另一管加入l(Vg的GST-s印tinl融合蛋白，4°C搖床孵育2小時。4、2000rpm離心2分鐘，上清取到新的離心管中，4°C保存，以備後用。5、用lml冰浴的裂解緩衝液(20mMTris-clpH8.0,500mMNaCl，lmMEDTA'1%NP-40)洗珠子，2000rpm離心l分鐘，棄上清，再重複洗3次。6、用20pl20mM的還原穀胱甘肽(在50mM的Tris-ClpH8.O的緩衝液中)從珠子上洗脫GST融合蛋白和與它結合的蛋白。2000rpm離心2分鐘。7、洗脫的蛋白加入等體積的2XSDS-PAGE上樣緩衝液，煮沸4分鐘。8、WesternBlotting檢測。結果顯示，如圖3所示，S印tinl與CK2能相互作用。實施例5CK2激酶在體外、體內磷酸化s印tinl1、體外磷酸化(1)取His-CK2a激酶0.2tig,底物蛋白5yg(GST-s印tinl，GST-s印tinl-206A)'加入lXKinasebuffer(cellsignal公司)，反應體系中另含有200pMr-32p-ATP(5|aCi/(xl)。(2)在30'C讓反應物作用30分鐘，然後加5pl5XSDS上樣緩衝液終止反應。(3)取20^1反應產物經12%SDS-聚丙稀醯胺凝膠電泳分離，膠染色、脫色。(4)真空乾燥儀上幹膠60'C2小時，冷卻後，壓上X-光片，-8(TC曝光。(5)顯影2、體內磷酸化(1)將PCMV-HA-CK2a分別與PCMV-myc-s印tin1、PCMV-myc-s印Unl(206A)共轉染人H1299細胞系(2)37°C培養48hr後收穫細胞並裂解。(3)向每500(il細胞裂解液中加入3(alanti-myc—抗(sigma)，25^1ProteinGPlus/ProteinAAgarose(sigma公司)，置於4。C搖床緩慢震蕩1小時。(4)2000rpm離心l分鐘後用lXPBS洗滌Agarose三次(5)向Agarose中加入2XSDS-PAGE上樣緩衝液，煮沸4分鐘。取上清20pl進行SDS-PAGE電泳(6)用磷酸化蛋白染色試劑盒(invitrogen)染色結果顯示，在體外和體內，S印tinl均可被CK2激酶磷酸化。體外磷酸化詳見圖5，體內磷酸化詳見圖6。實施例6檢測s印tinl的磷酸化突變體對Jurkat細胞生長及周期的影響1、分別將PCMV-myc，PCMV-myc-s印tinl,PCMV-myc-s印tinl(S206A),PCMV-myc-s印tinl(S206E)質粒轉染Jurkat細胞2、37°C培養60hr後流式細胞儀檢測個細胞的周期結果顯示，s印tinl(S-A)突變體(即將s印tinl蛋白第206位絲氨酸突變為丙氨酸(alanine，Ala，A))導致細胞凋亡增加，G2/M期細胞明顯減少，而s印tinl(S-E，即將s印tinl蛋白第206位絲氨酸突變為穀氨酸(glutamicacid，Glu,E))突變體則不能誘導細胞凋亡，但引起細胞G2/M期增高。這提示，s印tinl可以維持細胞分裂的正常進行，s印tinl206位絲氨酸突變時，細胞不能正常分裂。實施例7細胞中RNA幹擾s印tinl的表達1、將合成的siRNA溶於去RNAase的ddH20中，製成50mM的工作母液2、取5W脂質體(GIBC0公司脂質體Lipfectmine2000)與250WOPTI—MEM培養基混合均勻，靜置5min3、取25PlsiRNA工作母液與250riOPTI—MEM培養基混合均勻4、將2與3溶液混合均勻，室溫靜置20min5、將lXl(r的懸浮細胞離心收集並用lXPBS洗滌一次，用40CmiOPTI—MEM培養基重懸後與4所得溶液混合，加入6孔板一孔6、37°C培養5hr後更換完全培養基7、繼續培養48-60hr後收穫細胞，取出一半細胞進行western-blot檢測s印tinl的表達情況，同時另一半細胞用於流式細胞檢測。結果顯示，在l^g/ml的PHA刺激下，60小時內幹擾septinl的Jurkat細胞的增殖水平。在培養了60小時後，幹擾組與對照組相比，細胞增殖幅度大大降低。權利要求1.一種分離出的核酸分子，其特徵在於，它的序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。2.—種如權利要求1所述的核酸分子，其特徵在於，它的序列包括ATTCATCGAGGAGCAATTT和AAATTGCTCCTCGATGAAT。3.—種如權利要求1所述的核酸分子，其特徵在於，它的序列包括5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3,或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。4.一種如權利要求1所述的核酸分子，其特徵在於，它的序列是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'或者5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3'。5.—種如權利要求1所述的核酸分子，其特徵在於，它的序列是ATTCATCGAGGAGCAATTT和AAATTGCTCCTCGATGAAT。6.—種如權利要求1所述的核酸分子，其特徵在於，它的序列是5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT墨3，和5'-AUUCAUCGAGGAGCAAUUUdTdT-3，。7.—種如權利要求1、2、3或者4所述的核苷酸分子的製備方法，其特徵在於，按權利要求l、2、3或者4所述的核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團或者脫氧核糖核酸基團依次脫水縮合。8.如權利要求1、2、3或者4所述的核苷酸分子在製備免疫製劑中的應用。全文摘要本發明屬於生物醫藥領域，提供了一種核苷酸分子，即SEPTIN1SR1，本發明還提供了該核酸分子在製備免疫製劑中的應用。本發明的核苷酸序列包括序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。本發明的SEPTIN1SR1可以特異性的促進淋巴細胞的分裂停滯或者凋亡。將SEPTIN1SR1用於自身免疫性疾病患者，就可以特異性的使淋巴細胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細胞的生長增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態、縮短患者的恢復時間，減輕患者及其家屬的負擔。文檔編號A61K31/7088GK101240273SQ20071003718公開日2008年8月13日申請日期2007年2月6日優先權日2007年2月6日發明者丁向明,龍餘,餘文博,唐麗莎申請人:復旦大學