菌根真菌在石斛大面積栽培中的應用的製作方法

2023-07-22 02:52:26 2

專利名稱：菌根真菌在石斛大面積栽培中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體地說涉及一項在石斛大面積栽培中應用菌根真菌以縮短石斛生產周期，提高石斛產量和質量的實用技術。

背景技術：
石斛是我國傳統的名貴中藥，具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳等功效。藥理學研究表明，石斛屬植物具有增強機體免疫力，抗腫瘤，抗衰老，抗血小板凝聚等作用。我國目前供藥用的石斛屬(Dendrobium)植物有30多種，主要分布在華南及西南地區。中華人民共和國藥典(2005版)收載金釵石斛(D.nobile Lindl.)，鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall.exLindl.)或馬鞭石斛(D.fimbriatum Hook.Var.oculatum Hook.)及其近似種的新鮮或乾燥莖可做中藥石斛使用。多年來，由於產區藥農的過度採挖，使得中藥石斛的藥用資源受到嚴重破壞，金釵石斛和鐵皮石斛這兩種植物的自然資源已瀕臨枯竭，均已被列為國家重點保護的珍稀瀕危物種。
由於石斛屬植物種子細小，萌發困難，同時無性繁殖係數低，加上其特殊的生活環境，給此類藥材的大面積栽培帶來很大困難。科學工作者和藥農最廣泛採用的是組織培養和人工栽培相結合的方法來繁殖鐵皮石斛和金釵石斛。該方法存在的主要問題是無菌組培苗的移栽成活率低，抗病性差，易感染病原菌；人工栽培石斛的生產周期長，一般要5-7年才能收穫。從目前情況看，石斛繁殖困難的問題還沒有從根本上得到解決，導致生產上無法提供大量產品供藥用。
根據蘭科植物與真菌形成菌根結構的特點，我們自1987年開始從事自養型蘭科藥用植物菌根真菌的分離、培養，並進行了利用菌根真菌促進石斛、白芨等蘭科藥用植物生長和提高有效成分含量等方面的研究，並取得了較好效果。隨後，我們自1992年開始進行蘭科菌根真菌在石斛等蘭科藥用植物生長中的應用研究。我們從野生石斛的根中已經分離獲得多種內生真菌，對它們促進石斛生長發育的關係進行了系統研究，從中篩選出對石斛的生長發育具有促進作用的優良菌株。將這些菌株用於石斛的栽培生產，對於提高石斛的產量和質量，保護石斛的自然資源具有重大的理論意義和實用價值。


發明內容
本發明的目的在於提供一種應用菌根真菌大面積栽培石斛的方法，該方法石斛繁殖率高，栽培成活率高，可以縮短栽培石斛的生產周期，提高石斛的產量和質量，解決石斛藥用資源短缺的問題。
為實現上述目的，本發明採用的技術是先分別培養菌根真菌和石斛苗，當石斛苗移栽到大田時加入菌根真菌共生栽培。本發明採用的4種小菇屬菌根真菌經培養鑑定，分別為分離自鐵皮石斛的石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，分離自天麻的紫萁小菇MO-1(Mycenaosmundicola)，分離自墨蘭的蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)和分離自福建金線蓮(花葉開唇蘭)的開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)。這4種真菌於2002年1月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海澱區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所，保藏編號分別為MD-1CGMCC No.0685；MO-1CGMCC No.0689；MO-2CGMCC No.0688；MA-1CGMCC No.0687；保藏和存活證明見附件。
具體地說，本發明所述技術的步驟方法如下(除有特殊說明外，本發明中所述的比例均為重量百分比) 1.菌根真菌的培養 將上述4種菌根真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化後，分別轉接於PDA平皿中，於22-28℃恆溫培養10-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，並以小碎塊接入液體培養基中分別進行發酵培養製成種子菌種。種子菌種可以進一步接入液體或固體培養基進行放大培養。
真菌液體培養的培養基含有葡萄糖、無機鹽類成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量為1.5-4％；無機鹽類成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量為硫酸鎂0.1-0.3％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量為2-5％。培養基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振蕩培養或發酵罐通氣培養，培養容器裝量10-60％。培養基滅菌後接入上述菌根真菌，種子菌種接種量為培養容器裝量的5-20％。菌根真菌液體培養的培養條件為振蕩轉速80-150轉/分鐘，18-28℃暗培養10-30天。培養結束後可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用。
菌根真菌固體培養的培養基中天然纖維性或澱粉性物質可以為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5。固體培養基的加水量為以上3種原料總重量的1-4倍。培養基pH 5.0-6.5。試管、玻璃罐頭瓶或塑膠袋等器皿靜置培養，培養容器裝量50-80％。培養基滅菌後接入液體培養的小菇屬真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養容器裝量的5-15％。固體培養的培養條件為18-28℃暗培養，待菌絲從培養基頂部長入底部或長滿培養基時(2個月左右)取出備用。
2.石斛苗的培養 石斛原球莖經過原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗等步驟的培養，培育成苗。壯苗步驟可以將苗接在壯苗培養基上單獨培養，也可以在壯苗培養的後期接入菌根真菌的PDA平皿培養的菌片，菌片直徑3-15mm，每瓶苗接入1-5片菌片，或接入菌根真菌的液體培養物0.2-1.5ml，或接入菌根真菌的固體培養物0.2-1.5g，菌苗共培養時間為10-90天。經壯苗後的石斛苗可以在繼代培養基上繼代培養。各步驟所用培養基及培養時間分別為 (1)用於原球莖增殖的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，附加萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和激動素(KT)，其加入量為每升(L)培養基加入NAA0.1-1.0mg，IBA0.1-0.8mg，KT0.1-0.8mg。培養時間45-120天。
(2)用於原球莖分化的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，附加IBA和KT，其加入量為每升(L)培養基加入IBA0.2-1.0mg，KT0.2-1.0mg。培養時間45-120天。
(3)用於壯苗的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，附加NAA、IBA和KT，其加入量為每升(L)培養基加入NAA0.2-1.5mg，IBA0.2-1.5mg，KT0.2-1.5mg。培養時間60-120天。
(4)用於石斛苗繼代培養的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基附加馬鈴薯(煮汁)100-300g。培養時間60-120天。
石斛原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養中，所用的每升(L)1/2MS基本培養基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g。原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養中，所用的每升(L)培養基中均要添加活性炭0.5-4g。培養基pH 5.0-6.5。用玻璃三角瓶或玻璃罐頭瓶等器皿靜置光照培養，培養容器裝量10-50％。苗的培養條件為15-28℃光照培養，光照強度1500-5000Lux，光照時間8-12小時/天。
3.石斛苗與菌根真菌的共生栽培、田間管理及收穫 石斛苗與菌根真菌的共生栽培基質有以下幾種 (1)基質1中可以有蛭石、珍珠巖、鋸末加刨花和碎石頭，這4種材料加入量之間的比例按重量計為蛭石∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶碎石頭＝1-2∶1∶2-5∶1-3； (2)基質2中可以有闊葉樹樹皮、腐殖土和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹樹皮∶腐殖土∶碎石頭＝3-6∶1-2∶1-5； (3)基質3中可以有泥炭土、珍珠巖、鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這4種材料加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-2∶1∶2-5∶3-6； (4)基質4中可以有鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這2種材料加入量之間的比例按重量計為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-3∶2-6； (5)基質5中可以有鋸末加刨花、闊葉樹樹皮和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮∶碎石頭＝1-3∶2-6∶2-5； (6)基質6中可以有碎磚、闊葉樹樹皮和碎木炭，這3種材料加入量之間的比例按重量計為碎磚∶闊葉樹樹皮∶碎木炭＝1-5∶2-8∶1-4； (7)基質7中可以有鋸末加刨花、碎木炭和闊葉樹樹皮，這3種材料加入量之間的比例按重量計為鋸末加刨花∶碎木炭∶闊葉樹樹皮＝2-5∶1-3∶3-7； (8)基質8中可以有闊葉樹樹皮和蕨樹根，這2種材料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹樹皮∶蕨樹根＝2-5∶1-3； 上述栽培基質中用到的材料的大小為碎刨花、碎木炭直徑0.5-2cm，闊葉樹樹皮直徑0.5-4cm，碎石頭、碎磚直徑1-5cm，蕨樹根直徑0.5-3cm； 栽培中還要用到山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹或其他雜木樹的自然落葉，用時粉碎並浸溼，碎樹葉直徑0.5-2cm； 上述材料中的闊葉樹樹皮、鋸末和刨花、蕨樹根、腐殖土等可直接使用，或高溫滅菌，或提前兩個月鋪好使其熟化，或堆積並蓋塑料布發酵1-2個月，使其熟化以消除病蟲害。
4種菌根真菌的液體培養物或固體培養物，在用於與石斛的共生栽培時，可以單獨使用，或分別培養後任意選擇兩種或兩種以上共同使用。石斛苗和菌根真菌按以下方法共生栽培 (1)地上遮陽栽培在具有遮陽網的露天大棚，或塑料薄膜溫室，或玻璃溫室中進行栽培，栽培基質厚度5-20cm。栽培時以2-5株石斛苗為一叢進行栽培，先在石斛苗根的基部放置0.5-5g溼的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的菌根真菌液體培養物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養物0.3-2.0g，最後用栽培基質埋住石斛苗的根部，苗叢栽培的株、行距為8-18cm。
(2)立體遮陽栽培在地上搭架分層立體栽培，在硬質材料的盆或盒等容器的底部平鋪一層共生栽培基質，栽培基質厚度3-10cm。栽培時以2-5株石斛苗為一叢進行栽培，先在石斛苗根的基部0.5-5g溼的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的菌根真菌液體培養物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養物0.3-2.0g，最後用栽培基質埋住石斛苗的根部。叢苗栽培的株、行距為8-18cm。
石斛苗與菌根真菌共生栽培後需要的生長條件環境溫度為5-30℃，光照量為正常日光量的1/3或1/2，避免直射光，或照度為2000-10000Lux；在石斛與菌根真菌共生的過程中每年可以補施液體培養或固體培養的菌根真菌0-5次。
與菌根真菌共生栽培的石斛，在上述栽培條件下生長2-3年可以收穫，收穫時採用「存一去二或存二去三」的方法收穫栽培石斛的莖，即剪去二年或三年生的莖，保存一年或二年以下的幼莖；或採用「存二去三或存三去四」的方法收穫栽培石斛的莖，即剪去三年或四年生的老莖，保存二或三年以下的幼莖；收穫的新鮮石斛莖直接加工成產品，或陰乾，或60℃以下烘乾。

具體實施例方式 實施例一 1.紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)的培養 將MO-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化一次後，轉接於PDA平皿中，25℃恆溫培養18天，用φ8mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，分別以小碎塊接入液體培養基中發酵培養。液體培養基的組成按重量百分含量計算為葡萄糖2.5％，磷酸二氫鉀0.15％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.15％，麥麩3％(煮汁)。培養基pH 5.6，500mL三角瓶裝培養基250mL，高壓滅菌後接入MO-1真菌。培養條件為搖床震蕩轉速120轉/分鐘，23℃暗培養25天後用勻漿機打碎菌體及發酵物備用。
2.鐵皮石斛苗的培養 鐵皮石斛種子在無菌條件下萌發、分化形成原球莖，原球莖經過原球莖增殖、原球莖分化成苗和壯苗等步驟的培養，培育成苗。
原球莖增殖的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖30g，肌醇100mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，吲哚丁酸(IBA)0.2mg，激動素(KT)0.2mg，瓊脂7.5g。培養基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶裝量35mL，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛原球莖。培養條件24-26℃光照培養80天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。
原球莖分化的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖20g，肌醇80mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激動素(KT)0.5mg，活性炭1g，瓊脂7.0g。培養基pH 5.8。100mL玻璃三角瓶裝量30mL，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛原球莖。培養條件24-26℃光照培養60天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。
壯苗培養的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖30g，肌醇120mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激動素(KT)0.2mg，活性炭2g，瓊脂8.5g。培養基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶裝量40mL，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛苗。培養條件24-26℃光照培養100天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。鐵皮石斛苗培養至株高3.5cm以上，有節3個以上的壯苗即可進行栽培。
石斛苗繼代的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入馬鈴薯(煮汁)200g，蔗糖25g，肌醇100mg，活性炭2g，瓊脂7g。培養基pH 5.8。100mL玻璃罐頭瓶裝量30％，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛的壯苗。培養條件為24-26℃光照培養，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。暫時不能移栽的鐵皮石斛的壯苗可以在此培養基上培養。
3.鐵皮石斛苗與紫萁小菇MO-1的共生栽培 共生栽培的基質選用基質5，其中鋸末加刨花、闊葉樹樹皮和碎石頭的加入量之間的比例按重量計為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮∶碎石頭＝2∶2∶3。鋸末加刨花和闊葉樹樹皮直接使用。採用立體遮陽的方法進行栽培。在木質託盤的基部平鋪一層4-6cm厚的共生栽培基質，栽培時以3株鐵皮石斛苗為一叢進行栽培，先在鐵皮石斛苗根的基部放置2g左右的溼的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的紫萁小菇MO-1液體培養物2ml左右，使鐵皮石斛的根與MO-1菌接觸，最後用栽培基質埋住石斛苗的根部。叢苗栽培的株、行距為10cm。
在露天搭架，分層放置木質託盤，並架設遮陽網，避免直射光，最忌夏秋中午前後的直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛適宜的環境溫度為18-23℃，其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。石斛生長需較高的空氣溼度，但栽培基質中不宜積水。
鐵皮石斛苗與紫萁小菇MO-1共生栽培後，每年在春秋兩季補施液體培養或固體培養的紫萁小菇MO-12-4次。鐵皮石斛培養2-4年收穫，採用存二去三或存三去四的方法，即收穫生長了三或四年的老莖，保存二或三年以下的幼莖。收穫的鐵皮石斛陰乾。
實施例二 1.石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)和蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)的培養將MD-1和MO-2分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化一次後，分別轉接於PDA平皿中，25℃恆溫培養10天，用φ8mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，分別以小碎塊接入液體培養基中發酵培養。液體培養基的組成按重量百分含量計算為葡萄糖3％，磷酸二氫鉀0.3％，硫酸鎂0.15％，麥麩3％(煮汁)。培養基pH 6.0。500mL三角瓶裝培養基200mL，高壓滅菌後分別接入MD-1和MO-2真菌。培養條件為搖床震蕩轉速100轉/分鐘，25℃暗培養10天，作為MD-1和MO-2真菌的種子菌種。
將液體培養的MD-1和MO-2真菌的種子菌種分別接入固體培養基中進行培養。固體培養基的組成為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝1∶1∶0.5。固體培養基的加水量為以上3種原料總重量的2.5倍。培養基pH 5.5。培養基裝在玻璃罐頭瓶中，培養容器裝量60-70％。培養基滅菌後分別接入液體培養的MD-1和MO-2真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養容器裝量的10％左右。培養條件為22-23℃靜置暗培養。待MD-1和MO-2真菌的菌絲從培養基頂部長入底部或長滿培養基時取出，將兩種菌根真菌培養物按約1∶1的比例混合，備用。
2.金釵石斛苗的培養 金釵石斛種子在無菌條件下萌發、分化形成原球莖，原球莖經過原球莖增殖、原球莖分化成苗和壯苗等步驟的培養，培育成苗。
原球莖增殖的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖15g，肌醇90mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，吲哚丁酸(IBA)0.2mg，激動素(KT)0.1mg，瓊脂7.5g。培養基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶裝量25mL，121℃滅菌20分鐘，接入金釵石斛原球莖。培養條件24-26℃光照培養60天，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天。
原球莖分化的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖25g，肌醇80mg，吲哚丁酸(IBA)0.3mg，激動素(KT)0.2mg，活性炭1.5g，瓊脂9.0g。培養基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶裝量30mL，121℃滅菌20分鐘，接入金釵石斛原球莖。培養條件24-26℃光照培養50天，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天。
壯苗培養的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖35g，肌醇120mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.8mg，激動素(KT)0.1mg，活性炭3g，瓊脂8.5g。培養基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶裝量40mL，121℃滅菌20分鐘，接入金釵石斛苗。培養條件24-26℃光照培養100天，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天。在壯苗培養至70天時，向培養基中接入蘭小菇MO-2的固體培養物約2g，與金釵石斛苗共同培養至出瓶移栽。金釵石斛苗培養至株高3.5cm以上，有節3個以上的壯苗即可進行栽培。
3.金釵石斛苗與MD-1石斛小菇和蘭小菇MO-2的共生栽培 共生栽培的基質選用基質2，其中闊葉樹樹皮、腐殖土和碎石頭的加入量之間的比例按重量計為闊葉樹樹皮∶腐殖土∶碎石頭＝2∶1∶2。闊葉樹樹皮和腐殖土提前兩個月左右堆積使其熟化後使用。採用地上遮陽的方法，在塑料薄膜溫室中進行栽培。在溫室鋪一層10-12cm厚的共生栽培基質，栽培時以3-4株金釵石斛苗為一叢進行栽培，先在金釵石斛苗根的基部放置2g左右的溼的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的MD-1和MO-2真菌固體培養物的混合物1.5g左右，使金釵石斛苗的根與MD-1和MO-2的混合物接觸，最後用栽培基質埋住石斛苗的根部。苗叢栽培的株、行距為10cm。
石斛適宜的環境溫度為18-23℃，其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。溫室內要有遮陽網，避免直射光，最忌夏秋中午前後的直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛生長需較高的空氣溼度，但栽培基質中不宜積水。
金釵石斛苗與石斛小菇MD-1和蘭小菇MO-2共生栽培後，每年在春秋兩季補施液體培養或固體培養的石斛小菇MD-1和蘭小菇MO-22-4次。金釵石斛培養2-4年收穫，採用存二去三或存三去四的方法，即收穫生長了三或四年的老莖，保存二或三年以下的幼莖。收穫的金釵石斛陰乾。
比較例 菌根真菌對石斛苗生長的影響 將石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)分別用液體培養基搖床震蕩暗培養15天。液體培養基組成按重量百分含量計算為葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.25％，硫酸鎂0.15％，麥麩2％(煮汁)。培養基pH 5.6，將兩種菌的液體培養物等量混合，用勻漿機打碎，備用。
由原球莖分化的鐵皮石斛苗和金釵石斛苗，分別單獨在壯苗培養基上培養90天。壯苗培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖30g，肌醇100mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激動素(KT)0.1mg，活性炭2g，瓊脂7.5g。培養基pH5.8。
在共生栽培基質1上，用石斛苗與液體培養的MD-1和MA-1混合培養物進行共生栽培，考察菌根真菌對鐵皮石斛和金釵石斛生長的影響。以不加菌根真菌栽培的鐵皮石斛和金釵石斛的生長情況作為對照。共生栽培在玻璃溫室中進行。基質1中蛭石、珍珠巖、鋸末加刨花和碎石頭的加入量之間的比例按重量計為蛭石∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶碎石頭＝1∶0.5∶2∶1。
在溫室鋪一層10-12cm厚的共生栽培基質，栽培時均以3株石斛苗為一叢進行栽培，先在石斛苗根的基部放置2g左右的溼的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的MD-1和MA-1真菌液體培養物的混合物1.5ml左右，使石斛苗的根與MD-1和MA-1的混合物接觸，最後用栽培基質埋住石斛苗的根部。對照則用栽培基質埋住石斛苗的根部直接栽培即可。苗叢栽培的株、行距為10cm。
石斛適宜的環境溫度為18-23℃，其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。溫室內要有遮陽網，避免直射光，最忌夏秋中午前後的直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛生長需較高的空氣溼度，但栽培基質中不宜積水。
石斛苗與石斛小菇MD-1和開唇蘭小菇MA-1共生栽培後，每隔4個月補施一次石斛小菇MD-1和開唇蘭小菇MA-1固體培養物的混合物。石斛苗於栽培2年後收穫，將與菌根真菌共生栽培的石斛苗和對照石斛苗連根取出，洗淨培養基質，觀察苗的形態，發現接菌栽培的石斛苗與對照石斛苗相比，節間明顯膨大。收穫的石斛苗於55℃乾燥後稱量苗的乾重，統計分析結果表明，與對照鐵皮石斛苗相比，接菌栽培的鐵皮石斛苗的乾重有顯著提高，提高了24％；與對照金釵石斛苗相比，接菌栽培的金釵石斛苗的乾重有顯著提高，提高了19％。以葡萄糖為標準品，用苯酚-硫酸法測定鐵皮石斛苗中多糖的含量，結果表明，與對照鐵皮石斛苗相比，接菌栽培的鐵皮石斛苗中多糖含量提高了2-3倍，多糖含量最高可達15.1％，已接近野生藥材。以石斛鹼為標準品，用酸性染料比色法測定金釵石斛苗中總生物鹼的含量，結果表明，與對照金釵石斛苗相比，接菌栽培的金釵石斛苗中總生物鹼含量能提高30-50％，總生物鹼含量最高可達2.3％。
從以上結果可以看出，這4種菌根真菌對石斛的生長發育有明顯促進作用。採用該項新技術，石斛生長周期可由傳統栽培的5-7年縮短到2至3年；產量提高20％。與不接菌根真菌栽培的石斛苗(對照)相比，該項技術使石斛苗中多糖和生物鹼等化學成分含量提高至接近野生石斛含量水平，從而保證了菌根共生後石斛藥材的質量，為今後菌根真菌應用於石斛規範化栽培提供了科學依據。另外，該技術栽培方法簡單、投資少、不施任何化肥和農藥，生產出的石斛為綠色產品。
權利要求
1.一種應用菌根真菌大面積栽培石斛的方法，包括步驟
(1)菌根真菌的發酵培養
將4種菌根真菌MD-1，MO-1，MO-2，MA-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化後，分別轉接於含PDA培養基的平皿中，於22-28℃恆溫培養10-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，並以小碎塊接入液體培養基中進行發酵培養；
由平皿固體菌種轉接液體培養的MD-1，MO-1，MO-2和MA-1真菌可以直接使用，也可以作為種子菌種，種子菌種再進一步接入液體或固體培養基進行放大培養；
真菌液體培養的培養基含有葡萄糖、無機鹽類成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振蕩或發酵罐通氣暗培養，培養結束後可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用；
真菌固體培養的培養基含有天然纖維性或澱粉性物質，真菌用試管、玻璃罐頭瓶或塑膠袋等器皿靜置暗培養，待菌絲大部分或全部長滿培養基時取出備用；
(2)石斛苗的培養
石斛苗由石斛原球莖經過原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗等步驟的培養，用玻璃三角瓶或玻璃罐頭瓶等器皿靜置光照培養，培育成苗；經壯苗後的石斛苗可以在繼代培養基上繼代培養；
壯苗步驟可以將苗接在壯苗培養基上單獨培養，也可以在壯苗培養的後期接入菌根真菌共生培養一段時間，再出瓶用於大面積栽培；
原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗、苗的繼代培養等步驟所用的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，添加蔗糖、肌醇、瓊脂，或添加活性炭、添加不同種類和濃度的植物激素，或添加馬鈴薯提取物；
(3)石斛苗與菌根真菌的共生栽培、田間管理及收穫
石斛苗與菌根真菌大面積共生栽培的栽培基質含有樹皮、樹葉、蕨樹根、鋸末、刨花、木炭、石頭、磚、蛭石、珍珠巖、腐殖土、泥炭土；
石斛苗和菌根真菌按以下方法共生栽培
①地上遮陽栽培在具有遮陽網的露天大棚，或塑料薄膜溫室，或玻璃溫室中進行栽培，栽培時先在石斛苗根的基部放置少量碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的液體或固體菌根真菌適量，最後用栽培基質埋住石斛苗的根部；
②立體遮陽栽培在地上搭架分層立體栽培，在硬質材料的盆或盒等容器的底部平鋪一層共生栽培基質，栽培時先在石斛苗根的基部放置適量碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的液體或固體菌根真菌適量，最後用栽培基質埋住石斛苗的根部；
在石斛生長的過程中可以根據需要補施液體或固體菌根真菌；
石斛苗出瓶後與菌根真菌共生栽培2-3年後即可收穫。
2.如權利要求1所述的培養方法，其中所述的4種小菇屬真菌分別為石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，保藏編號CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏編號CGMCC No.0689，蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏編號CGMCC No.0688，和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏編號CGMCC No.0687。
3.如權利要求1和2所述的方法，其特徵在於小菇屬4種菌根真菌液體培養的培養基中葡萄糖的加入量按重量計為1.5-4％；無機鹽類成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量按重量計為硫酸鎂0.1-0.3％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量按重量計為2-5％；培養基pH5.0-6.5；三角瓶或其他容器振蕩培養或發酵罐通氣培養，培養容器裝量10-60％；培養基滅菌後接入上述4種小菇屬真菌，種子菌種接種量為培養容器裝量的5-20％；液體培養的培養條件為振蕩轉速80-150轉/分鐘，18-28℃暗培養10-30天；培養結束後可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用。
4.如權利要求1和2所述的方法，其特徵在於小菇屬4種菌根真菌固體培養的培養基中天然纖維性或澱粉性物質可以為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5；固體培養基的加水量為以上3種原料總重量的1-4倍；培養基pH5.0-6.5；試管、玻璃罐頭瓶或塑膠袋等器皿靜置培養，培養容器裝量50-80％；培養基滅菌後接入液體培養的小菇屬真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養容器裝量的5-15％；固體培養的培養條件為18-28℃暗培養，待菌絲從培養基頂部長入底部或長滿培養基時取出備用。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於石斛苗的培養中，
(1)原球莖增殖培養的培養基中添加的植物激素為萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和激動素(KT)，其加入量為每升(L)培養基加入NAA0.1-1.0mg，IBA0.1-0.8mg，KT0.1-0.8mg；培養時間45-120天；
(2)原球莖分化成苗的培養基中添加的植物激素為IBA和KT，其加入量為每升(L)培養基加入IBA0.2-1.0mg，KT0.2-1.0mg；培養時間45-120天；
(3)壯苗培養基中添加的植物激素為NAA、IBA和KT，其加入量為每升(L)培養基加入NAA0.2-1.5mg，IBA0.2-1.5mg，KT0.2-1.5mg；培養時間60-120天；
壯苗培養中，可以接入菌根真菌的PDA平皿培養的菌片，菌片直徑3-15mm，每瓶苗接入1-5片菌片，或接入菌根真菌的液體培養物0.2-1.5ml，或接入菌根真菌的固體培養物0.2-1.5g；菌苗共培養時間為10-90天；
(4)石斛苗繼代培養的培養基中添加馬鈴薯(煮汁)的量為每升(L)培養基加入100-300g；培養時間60-120天；
石斛原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養中，所用的每升(L)1/2MS基本培養基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g；原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養中，所用的每升(L)培養基中均要添加0.5-4g的活性炭；培養基pH5.0-6.5；用試管或玻璃瓶等器皿培養，培養容器裝量10-50％；苗的培養條件為15-28℃光照培養，光照強度1500-5000Lux，光照時間8-12小時/天。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於石斛苗與菌根真菌的共生栽培基質有以下幾種
(1)基質1中可以有蛭石、珍珠巖、鋸末加刨花和碎石頭，這4種材料加入量之間的比例按重量計為蛭石∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶碎石頭＝1-2∶1∶2-5∶1-3；
(2)基質2中可以有闊葉樹樹皮、腐殖土和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹樹皮∶腐殖土∶碎石頭＝3-6∶1-2∶1-5；
(3)基質3中可以有泥炭土、珍珠巖、鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這4種材料加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-2∶1∶2-5∶3-6；
(4)基質4中可以有鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這2種材料加入量之間的比例按重量計為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-3∶2-6；
(5)基質5中可以有鋸末加刨花、闊葉樹樹皮和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮∶碎石頭＝1-3∶2-6∶2-5；
(6)基質6中可以有碎磚、闊葉樹樹皮和碎木炭，這3種材料加入量之間的比例按重量計為碎磚∶闊葉樹樹皮∶碎木炭＝1-5∶2-8∶1-4；
(7)基質7中可以有鋸末加刨花、碎木炭和闊葉樹樹皮，這3種材料加入量之間的比例按重量計為鋸末加刨花∶碎木炭∶闊葉樹樹皮＝2-5∶1-3∶3-7；
(8)基質8中可以有闊葉樹樹皮和蕨樹根，這2種材料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹樹皮∶蕨樹根＝2-5∶1-3；
上述栽培基質中用到的材料的大小為碎刨花、碎木炭直徑0.5-2cm，闊葉樹樹皮直徑0.5-4cm，碎石頭、碎磚直徑1-5cm，蕨樹根直徑0.5-3cm；
栽培中還要用到山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹或其他雜木樹的自然落葉，用時粉碎並浸溼，碎樹葉直徑0.5-2cm；
上述材料中的闊葉樹樹皮、鋸末和刨花、蕨樹根、腐殖土等可直接使用，或高溫滅菌，或提前兩個月鋪好使其熟化，或堆積並蓋塑料布發酵1-2個月，使其熟化以消除病蟲害。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於石斛苗與菌根真菌共生栽培時，以2-5株石斛苗為一叢進行栽培，先在每叢石斛苗根的基部放置0.5-5g溼的碎樹葉，再在每叢石斛苗的根部放置上述製備好的菌根真菌液體培養物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養物0.3-2.0g，最後用栽培基質壓住苗的根部；苗叢栽培的株、行距為8-18cm；
採用地上遮陽栽培的方法進行石斛苗與菌根真菌共生栽培時，栽培基質厚度5-20cm；
採用立體遮陽栽培的方法進行石斛苗與菌根真菌共生栽培時，栽培基質厚度3-10cm；
石斛苗與菌根真菌共生栽培後需要的生長條件環境溫度為5-30℃，光照量為正常日光量的1/3或1/2，或照度為2000-10000Lux；在石斛與菌根真菌共生的過程中每年可以補施液體培養或固體培養的菌根真菌0-5次。
8.如權利要求1和7所述的方法，其特徵在於與菌根真菌共生栽培的石斛，在上述栽培條件下生長2-3年可以收穫，收穫時採用「存一去二或存二去三」的方法收穫栽培石斛的莖，即剪去二年或三年生的莖，保存一年或二年以下的幼莖；或採用「存二去三或存三去四」的方法收穫栽培石斛的莖，即剪去三年或四年生的老莖，保存二或三年以下的幼莖；收穫的新鮮石斛莖直接加工成產品，或陰乾，或60℃以下烘乾。
9.如權利要求1-8所述的方法，其特徵在於4種菌根真菌的液體培養物或固體培養物，在用於與石斛的共生栽培時，可以單獨使用，或分別培養後任意選擇兩種或兩種以上共同使用。
10.用於任一權利要求1-9所述方法的菌根真菌為小菇屬真菌石斛小菇MD-1(Mycenadendrobii)，保藏編號CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏編號CGMCC No.0689，蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏編號CGMCC No.0688，和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏編號CGMCC No.0687。
全文摘要
一種菌根真菌在石斛大面積栽培中的應用技術，所用的4種菌根真菌為小菇屬真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycen osmundicola)，蘭小菇(Mycena orchidicola)，開唇蘭小菇(Mycena anoectochila)；先分別培養菌根真菌和石斛苗，當石斛苗移栽到大田時加入菌根真菌共生栽培。採用該項新技術，可以大大縮短石斛的生長周期，提高石斛藥材的產量和有效成分的含量。該項技術栽培方法簡單、易於大面積推廣、投資少、不施任何化學肥料、激素和農藥，生產出的石斛藥材為綠色產品。
文檔編號C12N1/14GK1961652SQ20051011770
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月7日 優先權日2005年11月7日
發明者郭順星, 陳曉梅, 宋經元, 王春蘭, 孟志霞, 肖培根 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所