一種動物細胞培養用微載體及其交聯方法

2023-07-22 15:58:36

專利名稱：一種動物細胞培養用微載體及其交聯方法
技術領域：
本發明涉及動物細胞培養用微載體，更具體地說是涉及一種無動物來源成分的含 精氨酸配基的微載體以及精氨酸配基與基質的交聯方法，屬於生化工程和細胞工程領域，
背景技術：
微載體培養是目前公認的最有發展前途的一種動物細胞大規模培養技術，已廣泛 用於生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體以及具有特殊功能的效應 細胞等，已成為醫藥生物高技術產業的關鍵技術。動物細胞培養常常需要貼壁生長，在懸浮狀態下細胞生長緩慢，停止，甚至死亡。 微載體培養其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，作為載 體，使貼壁細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。它 將細胞的貼壁培養變為懸浮培養，這樣可以大大增加細胞生長的表面積以提高細胞的生長 密度。細胞貼壁主要是靠靜電引力和範德華力，取決於細胞與微載體表面理化性質和微載 體接觸概率有關。微載體其工作原理即是在經過共價交聯的載體微球(主要提供固相吸 附表面)上引入電荷，使細胞以其表面所帶的性質相反的電荷互相吸引以達到貼壁目的。 而一般細胞在進入生理PH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加 快細胞貼壁速度。目前市場上常用的微載體有兩類，它們都是帶有不同基團的葡聚糖交聯 而成的大分子，一類是以帶正電荷的化合物二乙基氨基乙基(DEAE)作為配基，用於一般的 動物細胞培養，如GE的Cytodex 1 ；另一類微載體用變性的動物明膠——豬膠原蛋白(Pig collagen)作為配基，通過共價交聯在葡聚糖微球表面形成一層明膠膜，為細胞的貼壁生長 提供附著，從而增加細胞附著和增殖。商品化的第二類微載體有GE的Cytodex 3。Cytodex 3常被選用作體外貼壁培養困難的細胞的微載體。特別是對上皮形態細胞的貼壁培養，更有 其獨特的優點。其他細胞如肝細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、成肌細胞等，也用這種微載體進 行過常規培養。利用豬膠原蛋白生產微載體，是將葡聚糖微球先用環氧氯丙烷 (Epichlorohydrin, ECH)活化，然後在鹼性條件下將經過變性的豬膠原蛋白交聯於葡聚糖 表面(圖1)。但因這種微載體含有豬膠原蛋白，當用於生物製品的產業化過程會遇到很多 的困難並增加很多工作量。首先，添加動物來源成分，會給生物製品下遊純化增加負擔，並 且會在最終產品中存在殘留；注入健康人體會產生嚴重的副反應；另外，添加動物來源成 分會增加生物製品外源性病毒的風險。因此，對細胞大規模培養原輔材料的質量控制，除了 對其支持細胞增殖能力的控制之外，還應考慮是否含有動物來源成分從而引起的安全性問 題。目前已有的微載體大多以動物膠原及其衍生物作為包被材料，但隨著對生物製品 安全性和質量要求的不斷提高和行業對藥品生產GMP要求的不斷完善，在生產過程中添加 含動物源性材料一直是各國的監管機構在生物安全性方面監管時高度關注的一項內容。使 用不含有任何動物來源成分的原輔材料進行疫苗等生物製品的生產，必然會成為生物製藥領域的發展趨勢。為克服因應用含動物來源成分的微載體於細胞大規模培養過程中而帶來引入病 毒的風險以及由此引起的產品申報和監管困難，市場上迫切需要一種不含動物膠原等動物 源性材料作配基的新型微載體，以建立在整個生產過程中無動物來源成分的細胞培養系統 和方案
發明內容
目前已有的動物細胞培養用微載體大多以動物膠原及其衍生物作為包被材料，本 發明的目的是提供一種無動物來源成分的含精氨酸配基的微載體。本發明的另一個目的是提供這種微載體精氨酸配基與葡聚糖基質的交聯方法。為實現上述目的，本發明使用以下技術方案本發明利用精氨酸(Arginine)或全人工合成的多聚精氨酸(Poly-Arginine)作 為配基，用烯丙基甘油醚作為交聯活化劑將之交聯於葡聚糖珠表面而合成的一種無動物來 源成分的微載體。由精氨酸聚合而成的多肽鏈，具有和動物明膠相似的性質，為細胞提供一 個具有多聚正電荷的粘附生長環境，有利於細胞的快速附著和擴展，有利於細胞的高密度 生長。它即模仿了動物明膠的表面結構，但又不引入動物源性物質，克服了細胞大規模培養 過程中因引入動物來源成分可能帶來的產品質量及安全性問題。本發明的技術路線是利用烯丙基甘油醚通過葡聚糖凝膠表面的羥基，將葡聚糖珠 活化。溴化後通過氨基將精氨酸或多聚精氨酸交聯於活化的葡聚糖微球表面。具體的實施步驟為(見圖2):第一步，葡聚糖微球乾粉加水膨脹後，加入NaOH以提供鹼性環境；第二步，加入烯丙基甘油醚，攪拌並保溫，使烯丙基甘油醚的環氧基打開並與葡聚 糖微球表面的羥基進行反應，形成共價鍵；第三步，加入溴水，將烯丙基甘油醚的醚鍵打開，在鹼性條件下與精氨酸或多聚精 氨酸的氨基進行反應，通過精氨酸的ε _氨基將其交聯於葡聚糖表面形成微載體。本發明的技術效果在於(1)通過烯丙基甘油醚的交聯，在葡聚糖珠表面接臂，從而使得多聚精氨酸配基向 外延伸，以減少細胞黏附時的位阻效應。(2)通過烯丙基甘油醚的環氧基和葡聚糖珠交聯的配基具有穩定性好和配基脫落 率低的優點，這對微載體本身的性質以及產品質量至關重要。(3)由精氨酸聚合而成的多肽鏈，具有和動物明膠相似的性質，都含有大量的陽性 電荷，可以模仿動物明膠的表面結構，但又不引入動物源性物質。


圖1為以豬膠原蛋白為配基，葡聚糖凝膠為基質的微載體合成路線圖；圖2為通過烯丙基甘油醚交聯多聚精氨酸，以葡聚糖凝膠作為基質的微載體合成 路線圖；圖3為用精氨酸作配基的微載體培養Vero細胞的顯微鏡照片。
具體實施例方式下列實施例中所用方法，如無特別說明均為常規方法。實施例1、微載體的製備如圖2所示，本發明微載體 配基與基質的交聯步驟如下1.烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球將IOOg葡聚糖乾粉加入三頸燒瓶中，加入IOOOg水並攪拌使其充分溶脹。加入 IlOg固體硫酸鈉，30°C下攪拌1小時。加入70g固體NaOH後並充分攪拌溶解後，加入烯丙基甘油醚。將溫度升高至55°C 並反應過夜。反應完畢後用約10倍體積的水洗滌凝膠，然後再用10倍體積的乙醇與10倍 體積的水依次洗滌各一次。2.溴化烯丙基甘油醚將IL烯丙基甘油醚活化的葡聚糖微球加入到三頸瓶中並加入250mL水。加入30g 的無水乙酸鈉並充分攪拌。加入溴水直至懸液呈黃色，後繼續溴化10分鐘。加入甲酸鈉終 止反應至黃色消失。繼續攪拌30分鐘後將凝膠在一燒結玻璃漏鬥中抽乾。3.交聯精氨酸(多聚精氨酸)配基將IOOg配基溶解於IL水中並製成0. lg/mL的配基溶液，加入到抽乾的葡聚糖凝 膠中並用NaOH調pH值至9.0。45°C反應24小時後，依次用IOOmM的Tris緩衝液(pH8. 0)， 50mM醋酸緩衝液(pH4. 0)，浸洗5次，然後用0. 9%的NaCl溶液浸洗一次。將洗滌好的微載體放置於燒結玻璃漏鬥中，用丙酮脫水後在70°C的烘箱中徹底幹 燥。將乾燥好的微載體放置於密閉容器中保存。步驟1 3的反應體系中所涉及的各物料用量可按比例放大。合成後的多聚精氨酸微載體，顆粒的直徑分布在30 μ m到300 μ m之間，表面電荷 的密度為30 200 μ mol/mL,培養試驗表明此微載體適於Vero細胞貼壁生長，細胞密度可 達 8X105/mL。實施例2、用微載體培養非洲綠猴腎細胞系(Vero細胞)1、細胞培養為檢驗以上製備的微載體的性能，我們將其用於非洲綠猴腎細胞系(Vero細胞) 的培養，並與商品化的豬膠原蛋白微載體(Cytodex 3)作對照試驗，方法如下首先將微載體在PBS (磷酸鹽緩衝液)溶液中溶脹並高壓滅菌。接種前將微載體用 含青黴素/鏈黴素的培養基洗滌兩次。Ig的微載體乾粉大約可膨脹到12mL的體積。用細胞 培養基烯釋至微載體濃度為6g/L。將細胞接種於12孔培養板中，接種密度為2 X IO5ceIls/ mL。然後將ImL的微載體懸液加入到相應的培養孔，並於7% C02的培養箱中保溫過夜。二、細胞計數與觀察在顯微鏡下觀察分別用精氨酸微載體及豬膠原蛋白微載體連續培養6小時、24小 時與72小時的細胞生長情況(圖3)。顯微鏡照片顯示，用精氨酸微載體培養Vero細胞， 圖3中顯示接種6小時後細胞開始附著，培養24小時後細胞已開始貼壁生長；培養72小時 後，微載體表面已為細胞所覆蓋。用精氨酸合成的非動物源性微載體與市售的豬膠原蛋白 微載體的效果無區別。細胞培養用微載體主要用於大規模、高密度的動物細胞培養，而動物細胞培養是疫苗及抗體及基因工程藥物生產的關鍵技術。由於微載體的加入，使貼壁培養的動物細胞 能夠帖服於微載體表面而懸浮生長，從而極大的提高了生長密度並縮短了生長時間。對照 試驗表明， 用精氨酸合成的非動物源性微載體適於Vero細胞貼壁生長，並能實現細胞高密 度培養，細胞計數顯示細胞密度可達8X105/mL，與市售的豬膠原蛋白微載體的效果無區 別。精氨酸微載體和豬膠原蛋白微載體對細胞生長曲線及生長密度的作用相同，完全可以 替代豬膠原蛋白微載體用於動物細胞的大規模培養。
權利要求
一種動物細胞培養用微載體，由配基與基質通過交聯劑交聯而成，其特徵在於配基為精氨酸聚合而成的多肽鏈。
2.如權利要求1中所述的動物細胞培養用微載體，其特徵在於其配基由天然精氨酸或 全人工合成多聚精氨酸聚合而成。
3.如權利要求1中所述的動物細胞培養用微載體，其特徵在於基質為葡聚糖。
4.如權利要求1至3任一權利要求項中所述的的動物細胞培養用微載體，其特徵在於 配基通過交聯劑烯丙基甘油醚交聯於基質表面。
5.一種用於權利要求4中所述的動物細胞培養用微載體的交聯方法，其特徵在於配基 通過交聯劑烯丙基甘油醚與基質連接。
6.如權利要求5中所述的動物細胞培養用微載體的交聯方法，包括以下步驟(1)烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球將I00g葡聚糖乾粉加入三頸燒瓶中，加入1000g水並攪拌使其充分溶脹，加入110g固 體硫酸鈉，30°c下攪拌1小時，加入70g固體NaOH後並充分攪拌溶解後，加入烯丙基甘油 醚，將溫度升高至55°C並反應過夜，反應完畢後用約10倍體積的水洗滌凝膠，然後再用10 倍體積的乙醇與10倍體積的水依次洗滌各一次；(2)溴化烯丙基甘油醚將1L烯丙基甘油醚活化的葡聚糖微球加入到三頸瓶中並加入250mL水，加入30g的無 水乙酸鈉並充分攪拌，加入溴水直至懸液呈黃色，後繼續溴化10分鐘，加入甲酸鈉終止反 應至黃色消失，繼續攪拌30分鐘後將凝膠在一燒結玻璃漏鬥中抽乾；(3)交聯精氨酸(多聚精氨酸)配基將100g配基溶解於1L水中並製成0. lg/mL的配基溶液，加入到抽乾的葡聚糖凝膠中 並用NaOH調pH值至9. 0，45°C反應24小時後，依次用100mM的Tris緩衝液(pH8. 0), 50mM 醋酸緩衝液(PH4. 0)，浸洗5次，然後用0. 9%的NaCl溶液浸洗一次，將洗滌好的微載體置 於燒結玻璃漏鬥中，用丙酮脫水後在70°C的烘箱中徹底乾燥，將乾燥好的微載體放置於密 閉容器中保存，步驟⑴ ⑶反應體系中所涉及的各物料用量可按比例放大。
全文摘要
本發明公開了一種動物細胞培養用微載體及交聯方法。該微載體是利用精氨酸(Arginine)或全人工合成的多聚精氨酸(Poly-Arginine)作為配基，用烯丙基甘油醚作為交聯活化劑將之交聯於葡聚糖珠表面而合成的一種無動物來源成分的微載體。該微載體由精氨酸聚合而成的多肽鏈，具有和動物明膠相似的性質，為細胞提供一個具有多聚正電荷的粘附生長環境，有利於細胞的快速附著和擴展及細胞的高密度生長。該精氨酸配基既模仿了動物明膠的表面結構，但又不引入動物源性物質，克服了細胞大規模培養過程中因引入動物來源成分可能帶來的產品質量及安全性問題。
文檔編號C08B37/02GK101864391SQ201010178279
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月18日 優先權日2010年5月18日
發明者張平, 張洪 申請人:博格隆(上海)生物技術有限公司