經過發酵生產l－絲氨酸的方法

2023-07-21 22:30:36

專利名稱：經過發酵生產l－絲氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及生產L-絲氨酸的方法和構建棒桿菌的方法，其中，L-絲氨酸用於生產在藥物，化學藥品和化妝品領域中使用的胺基酸混合物。
作為通過發酵製備L-絲氨酸的常規方法，已報導這樣一種方法，即其中能夠將甘氨酸和糖轉化成L-絲氨酸的細菌菌株在含有30g/L甘氨酸的培養基中用於生產至多14g/L的L-絲氨酸。通過該方法將甘氨酸轉化成L-絲氨酸的產量達到46％(Kubota K.農業生物化學，49,7-12(1985))。用能夠將甘氨酸和甲醇轉換成L-絲氨酸的細菌菌株，可從100g/L的甘氨酸中生產出53g/L的L-絲氨酸(T.Yoshida等，發酵和生物工程雜誌，79卷，第2期，181-183,1995)。在使用諾卡氏菌屬細菌的方法中，已知可通過培養那些對氧肟酸鹽、重氮絲氨酸等具有抗性的菌株而提高該細菌L-絲氨酸的生產力(日本專利公開No.57-1235)。然而，這些方法包括使用作為L-絲氨酸前體的甘氨酸並且包括複雜的操作且從費用的角度也是不利的。
作為可直接從糖發酵L-絲氨酸並且無需在培養基中添加L-絲氨酸前體的菌株，已知有穀氨酸棒桿菌，該菌對D-絲氨酸、α-甲基絲氨酸、O-甲基絲氨酸、異絲氨酸(isoserine)、絲氨酸氧肟酸鹽和3-氯丙氨酸具有抗性但是L-絲氨酸的積累低達0.8g/L(Nogei Kagakukaishi,48卷第3期，p201-208,1974)。因此，有必要進一步改進菌株以用於工業規模L-絲氨酸的直接發酵。
另一方面，關於棒桿菌，已經公開了能夠在細胞中自主複製並且具有藥物抗性標記基因的質粒(參考美國專利4,514,502)和將基因導入該細胞中的方法(公開的日本專利申請No.2-207791)和培養產生L-蘇氨酸或L-異亮氨酸細菌的可能性(美國專利4,452,890和4,442,208)。同樣，有關產生L-賴氨酸細菌的培養，已知一種包括摻入參與L-賴氨酸生物合成的基因至質粒載體中並在細胞中擴增該質粒的技術(公開的日本專利申請No.56-160997)。
在大腸桿菌的情況中，參與L-絲氨酸生物合成的酶包括相對於野生型中L-絲氨酸生產而言對反饋抑制敏感的酶並且已知有這樣一種實例，即其中導入突變基因從而可對反饋抑制脫敏而導致L-絲氨酸的增加(日本專利No.2584409)。作為這種基因，具體地已知有3-PGDH基因(下文，編碼3-PGDH蛋白的基因也將稱為「SerA」)。
此外，在棒桿菌的情況中，已知有這樣的實例，即其中3-PGDH基因的擴增影響了L-色氨酸的生產力(公開的日本專利申請No.3-7591)。
本發明的目的是提供將糖轉變為L-絲氨酸的微生物並且提供了利用微生物將糖轉變為L-絲氨酸的能力在培養基中積累L-絲氨酸的方法，即在工業規模的實踐中優越的生產L-絲氨酸的方法。
為實現上述目的而進行了深入研究，作為其結果，現在本發明人已發現從具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌，優選從L-絲氨酸分解活性缺陷型細菌或其具有對L-絲氨酸類似物抗性的突變體篩選至少一種磷酸絲氨酸磷酸酶和磷酸絲氨酸轉氨酶的活性增強的菌株並使用所篩選的菌株進行L-絲氨酸發酵將大幅度增強L-絲氨酸的積累。基於這一發現完成了本發明。
即，本發明涉及具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌，其中至少一種磷酸絲氨酸磷酸酶和磷酸絲氨酸轉氨酶的活性增強。
另外，本發明涉及上文所述的磷酸絲氨酸磷酸酶和磷酸絲氨酸轉氨酶的活性均增強的棒桿菌；上文所述的由於L-絲氨酸分解活性有缺陷而具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌；上文所述的由於其具有對L-絲氨酸類似物的抗性而具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌；上文所述的經過在其細胞中增加上述棒桿菌編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的基因和編碼磷酸絲氨酸轉氨酶的基因的拷貝數而增強了磷酸絲氨酸磷酸酶和磷酸絲氨酸轉氨酶的活性的棒桿菌；以及上文所述的具有導入其中的編碼D-3-磷酸甘油酸脫氫酶基因且其中L-絲氨酸的反饋抑制被脫敏的棒桿菌。
另外，本發明涉及生產L-絲氨酸的方法，包括在培養基中培養上文所述的棒桿菌以便在培養基中積累L-絲氨酸並從培養基中收集L-絲氨酸。


圖1顯示L-絲氨酸對各種菌株3-PGDH的反饋抑制方式。水平軸表示在該酶溶液中L-絲氨酸的濃度。縱軸表示L-絲氨酸存在時3-PGDH活性對L-絲氨酸不存在時的百分比。符號◆顯示L-絲氨酸對ATCC14067菌株3-PGDH的反饋抑制方式。符號■顯示L-絲氨酸對AJ13377菌株3-PGDH的反饋抑制方式。符號▲顯示L-絲氨酸對AJ13324菌株3-PGDH的反饋抑制方式。符號×顯示L-絲氨酸對AJ13325菌株3-PGDH的反饋抑制方式。符號*顯示L-絲氨酸對AJ13327菌株3-PGDH的反饋抑制方式。
圖2顯示質粒pVK7和pVK6的構建。
圖3說明了攜帶serB的質粒pSB的構建。
圖4說明了攜帶serC的質粒pSC的構建。
圖5說明了攜帶serB和serC的質粒pBC8和pBC14的構建。
本發明中提及的棒桿菌為伯傑氏細菌鑑定手冊，第8版，第599頁(1974)中定義的一組微生物，它們是不具有酸抗性並且無孢子形成能力的需氧格蘭氏陽性桿菌。這些棒桿菌包括棒桿菌屬的細菌、屬於迄今分類進短桿菌屬但目前統一到棒桿菌屬中的短桿菌屬細菌以及與棒桿菌屬和微桿菌屬細菌密切相關的短桿菌屬的細菌。
本發明的棒桿菌是具有L-絲氨酸生產力的且其中磷酸絲氨酸磷酸酶或磷酸絲氨酸轉氨酶的活性被增強的棒桿菌。例如，經過在具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌細胞中增加編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的基因(下文稱為「serB」)或編碼磷酸絲氨酸轉氨酶的基因(下文稱為「serC」)的拷貝數可獲得該細菌。
另外，本發明的棒桿菌可經過賦予增強了磷酸絲氨酸磷酸酶和磷酸絲氨酸轉氨酶活性的棒桿菌以L-絲氨酸生產力來獲得。
作為具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌，可提到的有，例如，L-絲氨酸分解活性缺陷型棒桿菌，對L-絲氨酸類似物有抗性的棒桿菌，以及L-絲氨酸分解活性缺陷型且對L-絲氨酸類似物有抗性的棒桿菌。
在本發明中，L-絲氨酸類似物包括重氮絲氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸。
對L-絲氨酸類似物有抗性且具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌，更優選其中的L-絲氨酸分解活性缺陷型棒桿菌可使用野生型或具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌作為親本菌株進行人工突變或誘導。
對L-絲氨酸類似物有抗性，L-絲氨酸分解活性缺陷型且具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌可按，例如，如下方式收集。以常規方法(與N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍接觸，等)對黃色短桿菌ATCC14067進行突變處理以獲得L-絲氨酸分解活性缺陷型突變株，然後從作為親本菌株的突變株收集對諸如重氮絲氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的L-絲氨酸類似物有抗性的細菌。另外，在獲得L-絲氨酸類似物抗性細菌後，可獲得L-絲氨酸分解活性缺陷型突變株。在以上述方法獲得的突變株中，存在以高濃度積累L-絲氨酸的菌株。
經過將下文所述突變的SerA導入親本菌株或L-絲氨酸分解活性缺陷型突變株中可獲得L-絲氨酸類似物抗性細菌。
術語「L-絲氨酸類似物抗性」是指細菌在含L-絲氨酸類似物的培養基中比野生型生長更快的特性。
更具體地說，例如，術語「重氮絲氨酸抗性」指細菌在含有重氮絲氨酸的培養基中較野生型細菌生長更快的特性。例如，在含有0.25g/L重氮絲氨酸的固體培養基上30℃在4-5天內形成菌落的菌株稱為具有重氮絲氨酸抗性。
類似地，術語「β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性」指細菌在含有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的培養基中較野生型細菌生長更快的特性。例如，在含有0.25g/Lβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的固體培養基上30℃在4-5天內形成菌落的菌株稱為具有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性。
下文將描述磷酸絲氨酸磷酸酶和磷酸絲氨酸轉氨酶活性的增強。
經過將serB或serC分別以可表達的形式導入棒桿菌可實現磷酸絲氨酸磷酸酶活性或磷酸絲氨酸轉氨酶活性的增強。經過藉助於分開的啟動子增強編碼各自的酶的基因的表達或者增強在單個啟動子控制下的兩個基因的表達可做到這一點。不論這些基因是在質粒上還是在染色體上，可經過增強諸如基因啟動子的表達控制序列，或者提高翻譯效率來增強表達。另外，可經過擴增染色體上的基因數來增強酶活性。而且可使用以使得所編碼的修飾酶比活增強的方式修飾的編碼磷酸絲氨酸磷酸酶或磷酸絲氨酸轉氨酶的修飾的基因實現這些酶活性的增強。
為了將SerB或SerC導入棒桿菌，可將含有SerB或SerC的DNA片斷與在棒桿菌中具有功能的載體連接以產生重組DNA，隨後將它導入具有L-絲氨酸生產力的棒桿菌宿主以轉化它。由於在轉化菌株的細胞中SerB或SerC的拷貝數增加，結果擴增了其磷酸絲氨酸磷酸酶活性或磷酸絲氨酸轉氨酶活性。將含有SerB及SerC兩者的重組DNA或者含有SerB的重組DNA以及含有SerC的重組DNA兩者導入棒桿菌將同時擴增磷酸絲氨酸磷酸酶活性和磷酸絲氨酸轉氨酶活性。
SerB和SerC的鹼基序列是已知的(SerB:GenBank；XO3046M30784,SerC;GenBank；D90728)。可合成以其鹼基序列為基礎的引物並使用大腸桿菌，黃色短桿菌或其它微生物的染色體DNA作模板經PCR方法收集這些微生物的SerB基因或SerC基因。至於該引物，司提到的是具有序列鑑定號15至18所示的鹼基序列的引物。
優選的是將SerB基因或SerC基因與能夠在大腸桿菌和/或棒桿菌細胞中自主複製的載體DNA連接以製備重組DNA，並且將此重組DNA導入前述的大腸桿菌細胞中。這種前提使下面的操作變得容易。能夠在大腸桿菌細胞中自主複製的載體優選為能夠在包括，例如pUC19,pUC18,pBR322,pHSG299,pHSG399,pHSG398和RSF1010的宿主細胞中自主複製的質粒載體。
當SerB基因和SerC基因位於分開的載體上以導入棒桿菌時，優選使用兩個具有互不相同的各自的標記基因的載體。
可利用轉座子(國際
發明者菅美喜子, 杉本雅一, 大住剛, 中松亙, 日比野涉, 伊藤美佳 申請人:味之素株式會社