植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T構建及啟動子活性鑑定的製作方法

2023-07-22 07:41:06

專利名稱：植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T構建及啟動子活性鑑定的製作方法
植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T構建及啟動子活性鑑
定
技術領域：
本發明屬於植物基因工程技術領域，主要涉及植物線粒體通用表達載體PSK-E-P/ T的構建策略和實施，包括載體構建中關鍵性元件之一的來自「津研四號」品種黃瓜線粒體 質粒PC3序列、基因cob啟動子序列和基因atp9終止子序列，以及啟動子活性鑑定與相關 方法。
背景技術：
線粒體是植物的重要細胞器，與植物的能量代謝、光呼吸作用、雄性不育和細胞凋 亡等重要生命現象相關。雄性不育(CMS)在開花植物中廣泛存在，CMS品系的培育是高等植 物傳統雜交育種的關鍵環節，在農業生產中佔有舉足輕重的作用。最近的研究顯示CMS與 mtDNA和核基因組相互有關，mtDNA的重排或基因變異可導致CMS發生，某些核基因產物如 MshURFlA和RFlB等通過影響mtDNA結構或阻止mtDNA中CMS相關基因的表達恢復育性。 因此，在應用上，可以利用本發明的線粒體表達載體載體，將與CMS相關基因導入植物線粒 體中，改變原有植物的線粒體遺傳特性，在分子水平培育細胞質雄性不育等雜交育種所需 要的植物重要品系，從根本上改變目前不育系建立中使用的繁瑣回交育種程序。另外，還可 以利用線粒體作為生物反應器(bioreactor)，大量生產外源蛋白質。在國際上，植物線粒體基因工程研究起步不久，我國尚處空白階段。

發明內容本發明的目的是解決植物線粒體遺傳轉化中的分子生物學操作問題，提供一種自 主構建的植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T及其關鍵元件來源、啟動子活性檢測。首先，本發明提供了一種首次發現的黃瓜線粒體質粒pC3，其序列如序列表序列 1，以及含有所述質粒PC3克隆序列的質粒及相關菌株。其次，本發明提供了一種黃瓜線粒體基因cob上遊啟動子995bp序列，如序列表序 列2，和黃瓜線粒體基因atp9下遊終止子896bp序列，如序列表序列3。以上所述黃瓜線粒體質粒pC3序列、啟動子和終止子序列是構建植物線粒體通用 表達載體pSK-E-P/T中的關鍵性元件。第三，本發明提供了 一種含有以上所述三個關鍵性元件序列的植物線粒體通用 表達載體pSK-E-P/T質粒的表達盒序列，如序列表序列4，以及植物線粒體通用表達載體 pSK-E-P/T圖譜及詳細構建過程。第四，本發明還提供了以所述的植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T為出發質粒 構建的所有表達載體，以及含有這些植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T質粒的E. coli的 DH5a工程菌株。第五，本發明還提供了鑑定植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T啟動子活性 的啟動子IacZ報告基因融合質粒PDW9PC和帶有綠色螢光蛋白GFP基因的表達質粒
3pSK-E-GFP。本發明的優點和有益效果本發明首次發現黃瓜線粒體質粒pC3，在此基礎上，通過PCR獲得黃瓜線粒體基因 cob上遊啟動子序列及基因atp9下遊轉錄終止子序列，構建成植物線粒體通用表達載體 pSK-E-P/T，該載體能在大腸桿菌中複製，非常方便外源基因的克隆和重組子篩選。經測定 啟動子-IacZ報告基因融合質粒在大腸桿菌中酶活性和螢光顯微鏡觀察pSK-E-GFP轉化大 腸桿菌的綠色螢光，證明表達載體上啟動子具有轉錄活性。本發明內容提供了通過線粒體 轉化途徑研究細胞凋亡等與線粒體相關的重要生命科學熱點問題的新型分子生物學技術 工具，推動植物線粒體基因工程理論和應用研究。

圖1為重組質粒pUC-pC3-CMP構建圖。圖2為重組質粒pSK-CMT構建圖。圖3為植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T構建圖。圖4為融合質粒PDW9PC中線粒體cob基因啟動子活性檢測的β -半乳糖苷酶顯 色。用pCPl和pCP2引物(詳見序列表引物序列1)擴增黃瓜線粒體基因cob啟動子 序列，以分別在引物PCPl和PCP2中引入的EcoRI和BamHI酶切點酶切1006bp長度的擴增 產物，並與缺失啟動子的質粒Ρ·191%Ω連接，形成融合質粒pDm9PC並轉化到大腸桿菌 DH5a中。以含的菌株為對照，測定含融合質粒pDm9PC菌株的β -半乳糖苷 酶活性。當向菌液中加入ONPG(鄰硝基酚一B--D半乳糖苷)後，可以很清楚地看到插入了 啟動子的PDW9PC融合質粒菌株與ONPG發生顯色反應，顏色為黃色。圖5為以植物線粒體表達質粒pSK-E-GFP轉化大腸桿菌後綠色螢光蛋白檢測圖。A、B:依次為480nm波長藍光激發下，視野中的pSK-E-GFP轉化和非轉化大腸桿菌 DH5a菌體，C、D 依次為普通光源照射下，視野中的pSK-E-GFP轉化和非轉化大腸桿菌DH5 a 菌體，E、F 依次為兩種視場疊加後SK-E-GFP轉化和非轉化大腸桿菌DH5 α菌體；在螢光顯微鏡下分別觀察經488nm波長藍光激發後轉化和未轉化大腸桿菌DH5 a 菌株的發光情況，結果顯示pSK-E-GFP轉化的菌體發出綠色螢光；而未轉化對照組菌體則 沒有螢光，說明線粒體表達載體上的cob基因啟動子具有轉錄活性。
具體實施方式實施例1 黃瓜線粒體質粒pC3的發現與其序列的克隆發明者通過電鏡、Sl核酸酶消化及環形DNA分子結構與核酸電泳遷移行為的綜合 分析方法，在國際上首次發現「津研四號」等一些品種黃瓜的線粒體基因組中存在550bp 的環形DNA質粒，並命名為pC3。提取「津研四號」黃瓜線粒體基因組DNA，從中分離和純化 質粒PC3，然後對其進行Sl核酸酶消化、末端平滑化和加腺嘌呤處理，然後連接到T-Vector 上，對克隆的非全長PC3進行測序，長度為537bp，序列分析發現其中含有單一性常用限制性內切酶SmaI和XbaI位點。用SmaI消化純化的質粒pC3並克隆到載體pUC18中，構建成 pUC-pC3/SmaI重組質粒，測序所克隆的全長pC3為550bp (詳見序列表序列1)，pC3是目前 國際上發現最小的線粒體環形DNA質粒。本發明的策略就是利用pC3在黃瓜線粒體中能獨 立遺傳的性質，在其上裝配線粒體來源的啟動子和終止子，並在啟動子和終止子之間引入 常用的多克隆酶切點，構建成植物線粒體通用表達載體關鍵的表達盒。實施例2 黃瓜線粒體基因cob上遊啟動子序列的獲得與克隆根據GenBank已發表的黃瓜線粒體細胞色素B基因(GenBank accession numberAF288044),使用 http//www. fruitfly. org 真核生物 promoter prediction 和PlantCARE軟體，分析該基因上遊的轉錄啟動子範圍在1006bp之內(AF288044 2041-3047)，並在此區間設計上遊引物pCMPl和下遊引物pCMP2 (詳見引物序列2)，以提取 的黃瓜線粒體總DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物經BamH I和Pst I克隆到帶有黃 瓜線粒體質粒PC3的重組質粒pUC-pC3/smaI上，形成的新重組子命名為pUC-pC3_CMP (詳 見說明書附圖1)。對所克隆的995bp長度序列與GenBank進行比對分析，證明為預期的黃 瓜線粒體cob基因啟動子序列。實施例3 黃瓜線粒體基因atp9下遊轉錄終止子序列的獲得與克隆根據 GenBank 已發表的黃瓜線粒體 atp9 基因(GenBank accession number AF288043)，使用誦.softberry. com終止子分析軟體，確定轉錄終止子為該基因下遊 896bp序歹Ij (AF288043 =9530-10426)，並設計引物pCMTl和pCMT2(詳見引物序列3)，以提 取的黃瓜線粒體總DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增產物經EcoR I和Kpn I酶切後克隆 到pSK載體上，形成的重組子命名為pSK-CMT (詳見說明書附圖2)，所克隆的896bp長度序 列與GenBank對比，證明為預期的黃瓜線粒體atp9基因終止子序列。實施例4 植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T的構建以SacI和PstI雙酶切實施例2得到的重組子pUC-pC3_CMP，並將切下的帶有黃瓜 線粒體質粒PC3和黃瓜線粒體基因cob上遊啟動調控序列共1. 45kb長度的片段連接到實 施例3得到的重組子pSK-CMT上(詳見說明書附圖3)，構建成有表達盒的植物線粒體通用 表達載體pSK-E-P/T。實施例5 啟動子-IacZ報告基因融合質粒pDm9PC的構建與β -半乳糖苷酶活 性檢測用pCPl和pCP2引物(詳見引物1)擴增基因cob啟動子序列，以EcoRI和BamHI 雙酶切PCR產物並與缺失啟動子的pDm91aCQ檢測質粒相應的酶切點連接，形成融合質 粒pDm9PC。參考Miller的方法，分別測定pDm91ac Ω對照菌株和融合質粒pDm9PC，測 定半乳糖苷酶活性。在此過程中，當向菌液中加入ONPG後，可以很清楚地看到插入了 啟動子的p_19PC融合質粒菌株與ONPG發生顯色反應，顏色為黃色(詳見說明書附圖4)， 而對照質粒pDm91ac Ω菌株則無明顯反應。pDN19PC融合質粒菌株的β -半乳糖苷酶活 性明顯高於啟動子缺失質粒pDm91aC Ω (20倍以上)。由於真核生物細胞器起源於原核生 物，文獻報導真核生物細胞器來源的啟動子和基因在原核生物具有啟動和表達功能，因此， 以pDm9PC融合質粒在大腸桿菌中表達β -半乳糖苷酶活性實驗間接證明了植物線粒體通 用表達載體pSK-E-P/T中cob基因啟動子的活性。實施例6 帶有GFP基因的表達質粒pSK-E-GFP構建與綠色螢光檢測
本實驗室保留的質粒pET32-GFP中帶有發光水母(Aequorea Victoria)來源 的綠色螢光蛋白基因GFP (717bp)，且該基因兩端為EcoR I酶切位點。用EcoR I從載體 PET32-GFP上切下GFP基因序列並回收。同時用EcoR I酶切載體pSK_E_P/T，將GFP基因 克隆到表達載體pSK-E-P/T上。分別用EcoR I和Sal I酶切重組子以GFP基因的檢測連 接方向。挑選EcoR I酶切檢測時能切出一條約730bp GFP目的帶，且用Sal I酶切能切出 一條約IOObp目的帶的正向連接重組子，命名為pSK-E-GFP。用電轉化方法將線粒體表達載 體質粒pSK-E-GFP導入大腸桿菌DH5 α中，分別取轉化和非轉化菌液置於載玻片進行顯微 觀察。在螢光顯微鏡下經488nm波長藍光激發後明顯地觀察到轉化菌體發出綠色螢光，而 對照組大腸桿菌DH5ci菌株則沒有螢光(詳見說明書附圖5)。由此證明線粒體表達載體上 的cob基因啟動子具有轉錄活性。
權利要求
一種黃瓜線粒體質粒pC3，其序列如序列表序列1。
2.一種含有權利要求1所述質粒pC3克隆序列的質粒及相關菌株。
3.—種黃瓜線粒體基因cob上遊啟動子995bp序列，如序列表序列2。
4.一種黃瓜線粒體基因atp9下遊終止子896bp序列，如序列表序列3。
5.一種含有權利要求1、3和4所述序列的植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T質粒的 表達盒序列，如序列表序列4。
6.一種所含有權利要求5所述植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T質粒的E. coli的 DH5a工程菌株。
7.權利要求5所述植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T的圖譜。
8.以權利要求5所述的植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T為出發質粒構建的所有表 達載體。
全文摘要
一種植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T構建及啟動子活性鑑定。本發明首次發現黃瓜線粒體質粒pC3(序列1)，在此基礎上，通過PCR獲得黃瓜線粒體基因cob上遊啟動子序列(序列2)及基因atp9下遊終止子序列(序列3)，構建成植物線粒體通用表達載體pSK-E-P/T(序列4)，該載體上還帶有在大腸桿菌中複製的複製子及Ampr抗性基因，非常方便外源基因的克隆和重組子篩選。經測定啟動子-lacZ報告基因融合質粒在大腸桿菌中酶活性和螢光顯微鏡觀察pSK-E-GFP轉化大腸桿菌的綠色螢光，證明表達載體上啟動子具有轉錄活性。本發明提供了通過線粒體轉化途徑研究細胞凋亡等與線粒體相關的重要生命科學熱點問題的新型分子生物學技術工具。
文檔編號C12N1/21GK101974560SQ20101051120
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月19日 優先權日2010年10月19日 公開號201010511206.發明者喬明強, 周臘梅, 張秀明, 徐海津, 白豔玲, 董榮 申請人:南開大學