適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法
2023-07-22 08:59:36 1
適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種適合雙向電泳的馬尾松針葉總蛋白質提取方法，首先將馬尾松針葉蛋白質提取出來，然後採用雙向電泳方法將蛋白質各成分和次生代謝物（如色素、酚類、醌類等）成分進行分離，最後採用考馬斯亮藍染色法進行定性分析和/或採用質譜儀對分離的蛋白質進行定性和定量分析。本發明採用的雙向電泳分析方法分離得到的蛋白點多，經PDQuest圖像分析軟體檢測，蛋白點多於1000個，且圖譜清晰，無橫向、縱向條紋，該方法重複性和穩定性好，是良好的適用於針葉類植物總蛋白提取的分析的方法。
【專利說明】適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法。
【背景技術】
[0002]馬尾松(Pinus massoniana),屬於松科松亞屬針葉樹種，是我國南方重要的脂材兩用樹種，它用途廣泛、經濟價值高，是我國林漿紙(板)、松脂和建築等行業的主要原料樹種。其生長迅速，生產力高，適應性強，遍布於華中華南各地。但近年來，由於氮氧化物的過度排放，導致大氣汙染嚴重。這些物質在大氣中氧化並隨降水返回地面形成酸沉降導致馬尾松冠層針葉脫落，從而進一步給馬尾松林帶來嚴重破壞。為了弄清酸性沉降危害馬尾松的破壞機理，需要提取其針葉中的蛋白分析酸性沉降對其針葉細胞蛋白表達變化的影響情況。而作為高大喬木類樹種，其針葉中含有大量核酸、多糖、多酚等次生代謝幹擾物質，應用文獻報導的蛋白提取方法不能有效的去除這些物質。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是:提供一種適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法，建立適用於馬尾鬆蛋白質組分有效分離、分析的方法，能對馬尾松針葉的總蛋白質進行分離，該方法為馬尾松植物及其他松柏科裸子植物材料蛋白質組學研究提供實驗基礎和參考。
[0004]本發明的技術解決方案是:首先將馬尾松針葉蛋白質提取出來，然後採用雙向電泳方法將蛋白質各成分和次生代謝物(如色素、酚類、醌類等)成分進行分離，最後採用考馬斯亮藍染色法進行定性分析和/或採用質譜儀對分離的蛋白質進行定性和定量分析；該提取方法具體包括以下步驟:
(1)採集馬尾松針葉，用超純水洗淨，並用濾紙吸去葉面水分，迅速放入液氮中速凍，並移至-80°c冰箱保存備用；
(2)稱取2g上述步驟保存的馬尾松葉片迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細粉，研磨過程中按1:2的質量體積比加入提取緩衝液、0.2g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成勻漿液；所用提取緩衝液組成為:20 mM (m mol/L) Tris-HCl (pH 7.5),250 mM蔗糖，10mM EDTA, I mM苯甲基磺醯氟(PMSF，使用前加入)，0.07% 二硫叔糖醇DTT (使用前加入)，I% v/v Triton X-100 ；
(3)研磨後的勻漿液裝入50ml_20°C預冷離心管中，加入同體積的ρΗ7.5的Tris-HCl飽和酹(酹提取蛋白)，放入振蕩器中振蕩15-30 min後，_4°C低溫離心機15000rpm離心15min ,取酹相；
(4)步驟(3)酚相中加入3倍體積的醋酸銨(溶劑為甲醇)，放入_20°C冰箱沉澱過夜；
(5)步驟(4)的過夜物-4°C低溫離心機15000rpm離心15min,取沉澱；
(6)洗滌步驟(5)沉澱三次，前一次用醋酸銨洗滌，後兩次用冷丙酮(均在-20°C冰箱預冷使用，含有質量體積比為0.07%的二硫蘇糖醇(DTT))，每次洗完後，_4°C低溫離心機15000rpm離心15min，獲得沉澱，將蛋白沉澱用真空離心濃縮乾燥儀真空冷凍乾燥，得到馬尾松針葉全蛋白粉末，備用；
(7)步驟(6)蛋白乾粉在4°C按mg蛋白400μ L裂解液的質量體積比加入裂解液裂解樣品，裂解液溶解的樣品放於冰浴上超聲助溶10分鐘，-4°C 15000 rpm離心30 min去除沉澱，得到蛋白質提取液，取上清液測量樣品蛋白濃度；採用考馬斯亮蘭法(Bradford)測定其蛋白濃度，對蛋白質進行定量；現用現配的裂解液由如下試劑構成-J M尿素，2 M硫脲，4% w/V 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)，2% v/v兩性電解質所用的載體兩性電解質為 carrier ampholytes, GE), 1% w/v DTT (使用前加入),0.5% v/v IPG 緩衝液，溶劑為水；
(8)取步驟(7)的蛋白質提取液進行第一向等電聚焦電泳:按上樣量500yg，上樣體積450μ1，用水化液對已定量好的蛋白樣品進行稀釋；將蛋白樣品加入水化盤內後，再將線性 IPG 膠條(pH 4-7,17cm, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個膠條用IOml礦物油覆蓋膠條，進行水化；水化結束後進行等電聚焦；等電聚焦的參數設置如下:30伏水化，10小時；200伏(升壓模式為step-n-hold), I小時；500伏(升壓模式為step-n-hold), I小時；1000伏(升壓模式為st印-n-hold)，l小時；8000伏(升壓模式為gradiet)，4小時；8000伏(升壓模式為step-n-hold),60000Vh ；500 伏(升壓模式為 step-n-hold,保持)；
(9)膠條平衡處理:將步驟(8)等電聚焦完成後的IPG膠條進行平衡2次，第一次膠條平衡緩衝液為:每Iml膠條平衡緩衝液母液加入IOmg 二硫蘇糖醇(DTT);第二次膠條平衡緩衝液為:每Iml膠條平衡緩衝液母液加入25mg碘乙醯胺；每次平衡時間為15min ；二次平衡緩衝液配製如下:膠條平衡緩衝液母液:6mol/L的尿素，質量體積比2.5%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，50 mmol/L的Tris-HCl (pH為6.8)，體積比30%的甘油，溶劑為水；
(10)第二向聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳:將平衡好的膠條轉移到第二向垂直板膠(15%分離膠，4%濃縮膠)的上端；用0.5%的低熔點瓊脂糖密封(避免產生氣泡)，加入電極緩衝液(含0.001%溴酚藍顯色劑)進行SDS - PAGE凝膠電泳，恆定電流20mA/gel，待溴酚藍至膠底端關閉電源；
(11)電泳結束後對膠條採用考馬斯亮藍(CBBR-250)染色法進行染色分析或對蛋白質進行質譜檢測:電泳完成後，取下凝膠，置於固定液中進行固定，時間為30 min;固定好的凝膠置於CBB R-250染色液中，室溫下染色3小時以上；倒出染色液,加入脫色液進行脫色；15分鐘後更換脫色液，繼續脫色3小時左右，其間更換數次脫色液，至凝膠背景合適，蛋白點鮮明為止；固定、染色以及脫色過程均在脫色搖床上晃動進行；固定液配方:40% v/v乙醇，10% v/v冰乙酸，溶劑為水；染色液考馬斯亮藍CBB R-250配方:0.116% w/v考馬斯亮藍(CBB)R-250，25% v/v乙醇，8% v/v冰乙酸，溶劑為水；脫色液配方:25% v/v乙醇，8% v/V冰乙酸，溶劑為水。
[0005]本發明具有以下優點:
1、在馬尾松針葉總蛋白提取過程中，本發明經過大量實驗研究，對提取緩衝液、樣品洗滌液和裂解液的組成及配比進行大量篩選，以葉片總蛋白的提取率和總蛋白中各蛋白的提取完整性為指標進行篩選，優化得到最佳配比的提取緩衝液、樣品洗滌液和裂解液，採用本發明提取緩衝液液、樣品洗滌液和裂解液對馬尾松針葉總蛋白的提取率高，且能保證各蛋白全部提出，為後續分析和鑑定蛋白質提供有利依據。
[0006]2、以上所述的馬尾松針葉蛋白質的提取和雙向電泳分析方法，步驟(11)所述的質譜檢測和分析，米用E1-MS或MS-MS串聯質譜法分析。
[0007]3、以上所述的馬尾松針葉蛋白質的提取和雙向電泳分析方法中，整個過程的溶液配製用超純水，實驗過程所需的二硫叔糖醇和碘乙醯胺均需現用現加。
[0008]4、本發明所述的馬尾松針葉蛋白質的提取和雙向電泳分析方法，經過大量實驗篩選，首先可以高效的將針葉中的蛋白質提取出來，然後根據松科植物中所含化合物的特點，在大量實驗優選條件下，採用雙向電泳方法不僅能將蛋白質和次生代謝物(如:色素、酚類、醌類等)成分進行分離，而且能將針葉中各蛋白質成分進行分離，實驗結果表明，本發明採用的雙向電泳分析方法分離得到的蛋白點多，經TOQuest圖像分析軟體檢測，蛋白點多於1000個，且圖譜清晰，無橫向、縱向條紋，重複性好，可在馬尾松針葉蛋白質組學中直接運用，並且本發明再對分離的蛋白質採用考馬斯亮藍染色法定性分析和/或採用質譜儀對蛋白質進行定性和定量分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為實施例中溫室培養2年生馬尾松針葉總蛋白質雙向電泳圖譜。
[0010]圖2為實施例中鼎湖山保護區成年植株馬尾松針葉總蛋白質雙向電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0011]根據下述實施例，可以更好地理解本發明的技術解決方案。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0012]以下實施例所用的離心機為高速冷凍離心機(Beckman)、雙向電泳為雙向電泳Ettan2~2A (GE Healthcare)。
[0013]實施例1:馬尾松針葉總蛋白質的提取和雙向電泳分析方法具體包括以下步驟:
(1)採集馬尾松針葉，用超純水洗淨，並用濾紙吸去葉面水分，放入液氮中速凍，並移至-80°c冰箱保存備用；
(2)稱取2g上述步驟保存的馬尾松葉片迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細粉，研磨過程中加入4ml提取緩衝液、0.2g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成勻漿液；提取緩衝液組成為:20 mM(m mol/L) Tris-HCl (pH 7.5) ,250 mM蔗糖，10 mM EDTA，I mM 苯甲基磺醯氟(PMSF，使用前加入)，0.07% 二硫叔糖醇DTT (使用前加入)，I % v/v Triton X-100 ；
(3)研磨後的勻漿液裝入50ml_20°C預冷離心管中，加入同體積的ρΗ7.5的Tris-HCl飽和酹(酹提取蛋白)，放入振蕩器入振蕩15-30 min後，_4°C低溫離心機15000rpm離心15min ,取酹相；
(4)步驟(3)的酚相中加入3倍體積的醋酸銨(溶劑為甲醇)，放入_20°C冰箱沉澱過夜；
(5)步驟(3)的過夜物-4°C低溫離心機15000rpm離心15min,取沉澱；
(6)洗滌步驟(5)沉澱三次，前一次用醋酸銨洗滌，後兩次用冷丙酮(均在_20°C冰箱預冷使用，含有質量體積比為0.07%的二硫蘇糖醇(DTT))，每次洗完後，_4°C低溫離心機15000rpm離心15min，獲得沉澱，將蛋白沉澱用真空離心濃縮乾燥儀真空冷凍乾燥，得到馬尾松針葉全蛋白粉末，備用；
(7)步驟(6)的蛋白乾粉在4°C按每mg蛋白400μ L裂解液的質量體積比加入裂解液裂解樣品，裂解液溶解的樣品放於冰浴上超聲助溶後10分鐘，_4°C下15000 rpm離心30 min去除沉澱，得到蛋白質提取液，取上清測量樣品蛋白濃度；採用考馬斯亮蘭法(Bradford)測定其蛋白濃度，對蛋白質進行定量；現用現配裂解液由如下試劑構成:7 M尿素，2 M硫脲，4% w/v 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)，2% v/v兩性電解質所用的載體兩性電解質為carrier ampholytes, GE, 1% w/v DTT (使用前加入),0.5% v/vIPG緩衝液，溶劑為水；
(8)取步驟(7)得到的蛋白質提取液進行第一向等電聚焦電泳:按上樣量500yg，上樣體積450μ1，用水化液對已定量好的蛋白樣品進行稀釋；將蛋白樣品加入水化盤內後，再將線性 IPG 膠條(pH 4-7,17cm, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個膠條用IOml礦物油覆蓋膠條，進行水化；水化結束後進行等電聚焦；等電聚焦的參數設置如下:30伏水化，10小時；200伏(升壓模式為step-n-hold), I小時；500伏(升壓模式為step-n-hold), I小時；1000伏(升壓模式為st印-n-hold)，l小時；8000伏(升壓模式為gradiet)，4小時；8000伏(升壓模式% step-n-hold),60000Vh ；500 伏(升壓模式為 step-n-hold,保持)；
(9)膠條平衡處理:將步驟(8)等電聚焦完成後的IPG膠條進行平衡2次，第一次膠條平衡緩衝液為:每Iml膠條平衡緩衝液母液加入IOmg 二硫蘇糖醇(DTT);第二次膠條平衡緩衝液為:每Iml膠條平衡緩衝液母液加入25mg碘乙醯胺；每次平衡時間為15min ；二次平衡緩衝液配製如下:膠條平衡緩衝液母液:6mol/L的尿素，質量體積比2.5%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，50 mmol/L的Tris-HCl (優選pH為6.8)，體積比30%甘油，溶劑為水；
(10)第二向聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳:將平衡好的膠條轉移到第二向垂直板膠(15%分離膠，4%濃縮膠)的上端；用0.5%的低熔點瓊脂糖密封(避免產生氣泡)，加入電極緩衝液(含0.001%溴酚藍顯色劑)進行SDS - PAGE凝膠電泳，恆定電流20mA/gel，待溴酚藍至膠底端關閉電源；
(11)電泳結束後對膠條採用考馬斯亮藍(CBBR-250)染色法進行染色分析或對蛋白質進行質譜檢測:電泳完成後，取下凝膠，置於固定液中進行固定，時間為30 min;固定好的凝膠置於CBB R-250染色液中，室溫下染色3小時以上；倒出染色液(可以回收利用3次以上)，加入脫色液進行脫色；15分鐘後更換脫色液，繼續脫色3小時左右，其間更換數次脫色液，至凝膠背景合適，蛋白點鮮明為止；固定、染色以及脫色過程均在脫色搖床上晃動進行；固定液配方:40% v/v乙醇，10% v/v冰乙酸，溶劑為水；染色液考馬斯亮藍CBB R-250配方:0.116% w/v考馬斯亮藍(CBB) R-250，25% v/v乙醇，8% v/v冰乙酸，溶劑為水；脫色液配方:25% v/v乙醇,8% v/v冰乙酸,溶劑為水。
[0014]通過上述方法對溫室內培養的2年生馬尾松針葉總蛋白質及鼎湖山地區多年生成年馬尾松針葉都進行提取和雙向電泳分離，具體結果如圖1和圖2所示，該圖表明無論幼年苗木還是成年植株，其總蛋白質樣品分離效果均很好，圖譜清晰，蛋白點多，無橫向、縱向條紋，經I3DQuest軟體點檢測和分析，蛋白點多於1000個。[0015]以上實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人了解本
【發明內容】
並加以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍，凡根據本發明精神實質所做的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍內。
【權利要求】
1.適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法，首先將馬尾松針葉蛋白質提取出來，然後採用雙向電泳方法將蛋白質各成分和次生代謝物成分進行分離，最後採用考馬斯亮藍染色法進行定性分析和/或採用質譜儀對分離的蛋白質進行定性和定量分析；其特徵在於包括以下具體步驟: (1)採集馬尾松針葉，用超純水洗淨，並用濾紙吸去葉面水分，迅速放入液氮中速凍，並移至-80°C冰箱保存備用； (2)稱取2g上述步驟保存的馬尾松葉片迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細粉，研磨過程中按1:2質量體積比加入提取緩衝液、0.2g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成勻漿液； (3)研磨後的勻漿液裝入50ml_20°C預冷離心管中，加入同體積的pH7.5Tris_HCl飽和酹(酹提取蛋白)，放入振蕩器入振蕩15-30 min後,-4°C低溫離心機15000rpm離心15min，取酚相； (4)步驟(3)酚相中加入3倍體積的醋酸銨(溶劑為甲醇)，放入_20°C冰箱沉澱過夜； (5)步驟(4)過夜物-4°C低溫離心機15000rpm離心15min,取沉澱； (6)洗滌步驟(5)沉澱三次，前一次用醋酸銨洗滌，後兩次用冷丙酮(均在_20°C冰箱預冷使用，含有質量體積比為0.07%的二硫蘇糖醇(DTT))，每次洗完後，_4°C低溫離心機15000rpm離心15min，獲得沉澱，將蛋白沉澱用真空離心濃縮乾燥儀真空冷凍乾燥，得到馬尾松針葉全蛋白粉末，備用； (7)步驟(6)蛋白乾粉在4°C按每mg蛋白400μ L裂解液的質量體積比加入裂解液裂解樣品，裂解液溶解的樣品放於冰浴上超聲助溶後10分鐘，-4°C下15000 rpm離心30 min去除沉澱，得到蛋白質提取液，取上清測量樣品蛋白濃度；採用考馬斯亮蘭法(Bradford)測定其蛋白濃度，對蛋白質進行定量； (8)取步驟(7)得到的蛋白質提取液進行第一向等電聚焦電泳:按上樣量500yg，上樣體積450μ1，用水化液對已定量好的蛋白樣品進行稀釋；將蛋白樣品加入水化盤內後，再將線性 IPG 膠條(選 pH 4-7,17cm, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個膠條用IOml礦物油覆蓋膠條，進行水化；水化結束後進行等電聚焦； (9)膠條平衡處理:將步驟(8)等電聚焦完成後的IPG膠條進行平衡2次，第一次膠條平衡緩衝液為:每1ml膠條平衡緩衝液母液加入IOmg 二硫蘇糖醇(DTT);第二次膠條平衡緩衝液為:每1ml膠條平衡緩衝液母液加入25mg碘乙醯胺；每次平衡時間為15min ； (10)第二向聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳:將平衡好的膠條轉移到第二向垂直板膠(15%分離膠，4%濃縮膠)的上端；用0.5%的低熔點瓊脂糖密封，加入電極緩衝液(含.0.001%溴酚藍顯色劑)進行SDS - PAGE凝膠電泳，恆定電流20mA/gel，待溴酚藍至膠底端關閉電源； (11)電泳結束後對膠條採用考馬斯亮藍(CBBR-250)染色法進行染色分析或對蛋白質進行質譜檢測:電泳完成後，取下凝膠，置於固定液中進行固定，時間為30 min ;固定好的凝膠置於CBB R-250染色液中，室溫下染色3小時以上；倒出染色液,加入脫色液進行脫色；15分鐘後更換脫色液，繼續脫色3小時左右，其間更換數次脫色液，至凝膠背景合適，蛋白點鮮明為止；固定、染色以及脫色過程均在脫色搖床上晃動進行。
2.根據權利要求1所述的適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法，其特徵在於:步驟(2)所述的提樣緩衝溶液由下列物質組成:20 mM (m mol/L) Tris-HCl (pH 7.5),.250 mM蔗糖，10 mM EDTA，I mM苯甲基磺醯氟(PMSF，使用前加入)，0.07% 二硫叔糖醇DTT(使用前加入)，I % v/v Triton X-100質量體積比10%的三氯乙酸，其餘溶劑為水。
3.根據權利要求1所述的適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法，其特徵在於:步驟(4)中沉澱清洗由預冷甲醇和丙酮共同完成，且體系中均含有質量體積比為0.07%的二硫叔糖醇(DTT)。
4.根據權利要求1所述的適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法，其特徵在於:步驟(8)所述的等電聚焦的參數設置如下:30伏水化，10小時；200伏(升壓模式為step-n-hold), I小時；500伏(升壓模式為step-n-hold), I小時；1000伏(升壓模式為step-n-hold)，l小時；8000伏(升壓模式為gradiet)，4小時；8000伏(升壓模式為step-n-hold), 60000Vh ；500 伏(升壓模式為 step-n-hold,保持)。
5.根據權利要求1所述的適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法，其特徵在於:步驟(10)中電極緩衝液配製方法如下:按質量體積比0.1%的十二烷基硫酸鈉，.0.025mol/L的三羥甲基氨基甲烷，0.192mol/L的甘氨酸和0.001%溴酚藍顯色劑進行配製，溶劑為水，並調製pH值為8.3。
6.根據權利要求1所述的適合雙向電泳的馬尾松針葉蛋白質提取方法，其特徵在於:步驟(8)中所述的考馬斯亮藍染色分析方法程序如下: 步驟a:電泳結束後凝膠條放入盛有超純水的染色盤中，加入固定液進行固定，時間為.30 min;固定液配方:40% v/v 乙醇，10% v/v冰乙酸,溶劑為水； 步驟b:固定好的凝膠置於CBB R-250染色液中，室溫下染色3小時以上，倒出染色液；染色液考馬斯亮藍CBB R-250配方:0.116% w/v考馬斯亮藍(CBB)R_250，25% v/v乙醇，8%v/v冰乙酸，溶劑為水； 步驟c:加入脫色液進行脫色，15分鐘後更換脫色液，繼續脫色3小時左右，其間更換數次脫色液，至凝膠背景合適，蛋白點鮮明為止；脫色液配方:25% v/v乙醇，8% v/v冰乙酸，溶劑為水；固定、染色以及脫色過程均在脫色搖床上晃動進行。
【文檔編號】G01N1/30GK103900881SQ201410127802
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月1日 優先權日:2014年4月1日
【發明者】劉廷武, 徐建明, 羅玉明, 楊立明, 楊文杰 申請人:淮陰師範學院