基於移動反應界面電泳的高通量蛋白質滴定方法
2023-07-22 09:00:01
專利名稱：基於移動反應界面電泳的高通量蛋白質滴定方法
技術領域：
本發明涉及的是一種電化學方法分析材料的方法，具體是一種用於生物樣品中蛋白質含量檢測的基於移動反應界面(moving reaction boundary, MRB)電泳的高通量蛋白質滴定方法。
背景技術：
蛋白質是食品(如牛奶)中的主要營養成分之一。檢測食品中蛋白總含量對于衡量食品營養價值、判定商品價格、評定食材質量等方面有很大的意義(Moore，J.C.，DeVries, J.W.，Lippj Μ.，Griffiths, J.C.，Abernethyj D.R.，2010，Comper.Rev.FoodSc1.Food Saf.，9，330-357.)。並且蛋白質含量分析在臨床醫學診斷中具有重要應用(康熙熊，臨床電泳，人民衛生出版社，2006年)。凱氏定氮法已成為各種生物樣品蛋白含量標準方法之一(Kjeldahl, J.Z.，1883，Anal.Chem.，22，366-382.)，其他方法還有 Dumas 法(Thudichum, J.L.ff.，Wanklyn, J.A.，1869，J.Chem.Soc.，22，277-292.)、染料結合法(CoIenbrander, V.F., Martin, T.G..1971, J.DairySc1., 54, 531-533) > 光譜法(Kennedy, J.F., White, C.A., Browne, A., 1985, J.FoodChem., 18, 95-112.)等。其中凱氏定氮法和Dumas法都容易受非蛋白氮(non protein nitrogen, NPN)的影響。許多不法分子在食品中添加NPN (如三聚氰胺、尿素)，如若用凱氏定氮法或Dumas法檢測已添加NPN的食品的蛋白質含量，會導致測得結果比實際值高(Moore，J.C.，DeVries, J.ff., Lipp, Μ., Griffiths, J.C., Abernethy, D.R., 2010, Comper.Rev.Food Sc1.FoodSaf.，9，330-357.)。而三聚氰胺的過多攝入會引起腎結石、血尿，最後導致急性腎功能衰竭(Lam, C.ff., Lan, L., Che, X., Tam, S., Wong, S.S.Y., Chen, Y., Jin, J., Tao, S.H., Tang, X.M.，Yuen, K.Y.，2009，Clin.Chim.Acta, 402，150-155.)。尿素的添加會降低食品營養價值，甚至影響人類身體健康(Trivedi, U., Lakshminarayana, D., Kothari, 1., Patel, N., Kapse,H., Makhi j a, Κ., Patel, P., Panchal, C., 2009, Sensor Actuator.B-Chem., 140, 260-266.)。因此，有必要提出一種既可以準確測定蛋白含量，又不受NPN影響的測定食品等樣品中蛋白含量的可靠方法。目前已經有一些分析方法可以減少NPN的影響，測定複雜樣品中的某種特定的蛋白質，如親和色譜法(Goshe, M.B., Conrads, T.P., Panisko, E.A., Angel I, N.H.，Veenstra, T.D.，Smith, R.D.，2001，Anal.Chem.，73，2578-2586.)、親和毛細管電泳法(Armenta, J.M., Gu, B., Humble, P.H., Thulin, C.D., Lee, Μ.L., 2005, J.Chromatogr.A, 1097，171-178.)、生物傳感器(Setford, S.J.，White, S.F.，Bolbot, J.A.，2002，Biosens.Bioelectron.，17，79-86.)等。儘管這些方法可以排除NPN的影響,但它們的專一'丨生導致只能測定樣品中的一種或幾種蛋白質，但對總蛋白含量的準確度不是很高。除此之外，這些方法往往需要昂貴的儀器設備，操作複雜，測定時間較長。在移動反應界面(moving reaction boundary, MRB)體系中，陽極端的H+和陰極端的OF在電場的作用下分別向陰極和陽極移動，當兩離子相遇時會形成MRB0 MRB移動方向與這兩種離子的流通量有關，當H+流通量大於OH_流通量時，界面移向陰極；反之，會向陽極移動；當兩者流通量相等時，界面靜止不動(Cao，C.X.，Zhou, S.L.，He, Y.Z.，Zheng, X.Y., Chen, ff.K., Qian, Y.T., 2000, J.Chromatogr.A, 891, 337-347; Cao, C.X., Fan, L.Y., Zhang, ff., 2008, Analyst, 133，1139-1157)。基於MRB理論，楊清等提出了一種用於準確測定酸喊濃度的電泳滴定技術(moving reaction boundary titration, MRBT) (Yang, Q., Fan, L.Y.，Huang, S.S.，Zhang, ff.，Cao, C.X.，2011，Electrophoresis, 32，1015-1024)。但仍然未見MRB/MRBT概念、技術和裝置轉化成生物技術與設備，並應用於生物樣品(如牛奶、大豆、尿液和血清等)蛋白質含量的分析。經過對現有技術的檢索發現，中國專利文獻號CN 102680556，
公開日2012-09-19，記載了一種用於測定蛋白質總濃度的可視化生物傳感器裝置，包括:電泳管，水平放置於一操作平臺上；兩個四通玻璃管，位於所述電泳管的兩側，且兩個所述四通玻璃管的第一埠和所述電泳管的兩端相連；兩個恆流泵，其一端分別和兩個所述四通玻璃管的第二埠相連；陽極電解液槽和陰極電解液槽，分別和兩個所述恆流泵的另一端相連；陽極廢液槽和陰極廢液槽，分別和兩個所述四通玻璃管的第三埠相連；電壓供給裝置，和兩個所述四通玻璃管的第四埠相連；數據記錄裝置，位於所述電泳管的一側。但該現有技術未對MRB移動速度與蛋白濃度存在的函數關係進行詳細的闡述，同時未給出施加電壓範圍和背景電解質溶液的離子強度範圍，此外涉及的滴定裝置只能進行單管檢測，通量較低，操作較為複雜，測定所需時間較長。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基於移動反應界面電泳的高通量蛋白質滴定方法，詳細闡述了 MRBT滴定蛋白原理，推導了 MRB移動速度與蛋白濃度存在的函數關係，該方法能夠快速的檢測蛋白質總量且抗幹擾能力強。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過首先向容納生物樣品的電泳管中注入凝膠，使得待檢測的蛋白質分子通過凝膠均勻地固定在電泳管中；然後進行鹼滴定，即:向陰極電解液槽中注入鹼溶液，施加電壓，使得鹼溶液中的陰離子OF與蛋白質游離酸性殘基相遇並發生中和反應進而形成MRB，MRB移向陽極；滴定時，向電泳管中加入用於指示不同時間下MRB所處位置的指示劑，以進行可視化觀測；之後，利用MRB移動速度與蛋白濃度存在的函數關係建立MRB移動速度與蛋白濃度的標準曲線，以得到的MRB移動速度，計算得到確定的蛋白濃度。所述的鹼滴定替換為酸滴定，即:向陽極電解液槽中注入的酸溶液，施加電壓，使得酸溶液中的陽離子H+與蛋白質游離鹼性殘基相遇並發生中和反應進而形成MRB，MRB移向陰極，從而得到MRB移動速度。所述的施加的電壓範圍為100-300V，此時，界面移動距離D與電泳時間t線性關係較好，相關係數R>0.998。施加電壓100V以下時，界面移動速度較慢，界面移動距離D與電泳時間t線性關係較差；施加電壓300V以上時，界面移動速度太快，產生的焦耳熱較多，界面移動距離D與電泳時間t線性關係較差。所述的MRB移動速度與蛋白濃度存在的函數關係為=其中:ν.
權利要求
1.一種基於移動反應界面電泳的高通量蛋白質滴定方法，其特徵在於，首先向容納生物樣品的電泳管中注入凝膠，使得待檢測的蛋白質分子通過凝膠均勻地固定在電泳管中；然後進行鹼滴定，最後利用MRB移動速度與蛋白濃度存在的函數關係建立MRB移動速度與蛋白濃度的標準曲線，以得到的MRB移動速度，計算得到確定的蛋白濃度； 所述的滴定是指:向陰極電解液槽中注入鹼溶液，施加電壓，使得鹼溶液中的陰離子Off與蛋白質游離酸性殘基相遇並發生中和反應進而形成MRB，MRB移向陽極；滴定時向電泳管中加入用於指示不同時間下MRB所處位置的指示劑，以進行可視化觀測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是，所述的鹼滴定替換為酸滴定，即:向陽極電解液槽中注入的酸溶液，施加電壓，使得酸溶液中的陽離子H+與蛋白質游離鹼性殘基相遇並發生中和反應進而形成MRB，MRB移向陰極，從而得到MRB移動速度。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵是，施加的電壓範圍為100-300V。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵是，所述的MRB移動速度與蛋白濃度存在的函數
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵是，所述的凝膠的濃度為10.0%以上，交聯度為3.0%以上。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵是，所述的凝膠為聚丙烯醯胺凝膠，濃度範圍為12.0%-18.0%，交聯度範圍為3.0%-5.0%，其組份為:丙烯醯胺、N-N』 -甲叉雙丙烯醯胺、過硫酸銨和四乙基乙二胺。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是，所述的指示劑為酸鹼指示劑或螢光指示劑。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是，所述的電泳管、陰極電解液槽和陽極電解液槽中均注入有背景電解質溶液，其中:鹼滴定時，陽極電解液槽中的背景電解質溶液的成分和離子強度與電泳管的背景電解質溶液的成分和離子強度相同，陰極電解液槽中的背景電解質溶液的成分與電泳管中背景電解質溶液的成分相同，鹼溶液和背景電解質溶液各成分離子強度之和與電泳管中背景電解質溶液的離子強度相同； 酸滴定時，陰極電解液槽中背景電解質溶液的成分和離子強度與電泳管的背景電解質溶液的成分和離子強度相同，陽極電解液槽中的背景電解質溶液的成分與電泳管中背景電解質溶液的成分相同，酸溶液和背景電解質溶液各成分離子強度之和與電泳管中背景電解質溶液的離子強度相同。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵是，所述的鹼滴定時，陽極電解液槽中包含的背景電解質溶液的離子強度範圍為50-250mmol/L，陰極電解液槽中包含的鹼溶液和背景電解質溶液的，總離子強度範圍為50-250mmol/L ;酸滴定時，陰極電解液槽中包含的背景電解質溶液的離子強度範圍為50-250mmol/L，陽極電解液槽中包含的酸溶液和背景電解質溶液，總離子強度範圍為50-250mmol/L。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特徵是，所述的背景電解質溶液為鉀離子、鈉離子或者鋰離子的電解質 溶液。
全文摘要
一種電化學方法分析材料的基於移動反應界面電泳的高通量蛋白質滴定方法，通過向容納生物樣品的電泳管中注入凝膠，使得待檢測的蛋白質分子通過凝膠均勻地固定在電泳管中；然後進行鹼滴定；最後利用MRB移動速度與蛋白濃度存在的函數關係建立MRB移動速度與蛋白濃度的標準曲線，以得到的MRB移動速度，計算得到確定的蛋白濃度。本發明能夠快速的檢測蛋白質總量且抗幹擾能力強。
文檔編號G01N27/44GK103175885SQ20131008908
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月20日 優先權日2013年3月20日
發明者曹成喜, 王后禹, 郭成葉, 顏健, 唐芸芸, 尹曉陽, 樊柳蔭 申請人:上海交通大學