一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法
2023-07-11 17:47:56 3
一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法
【專利摘要】本發明公開了一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，所述方法為：將含有潮黴素B基因和標記基因的農桿菌預誘導培養，然後將稻曲菌孢子液與預誘導後的農桿菌菌液以體積比1：1混合製成混合菌液，將混合菌液均勻塗布於表面鋪有濾紙、PVDF膜或硝酸纖維素膜的含乙醯丁香酮的改良AIM固體培養基平板上，黑暗條件下於20～24℃共培養36～48h，然後將共培養後的膜剪成小片並鋪在改良的選擇培養基CM上26℃培養4～5d，獲得含有潮黴素B基因的稻曲菌；本發明方法轉化子時間縮短為4～5d，轉化效率高達91.3%；稻曲菌轉基因後代穩定，基因丟失率低，轉化子穩定性達95%。
【專利說明】一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種農桿菌介導的真菌遺傳轉化方法，尤其涉及一種基於根癌農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的改良方法。
(二)【背景技術】
[0002]稻曲菌(Ustilaginoidea virens (Cooke) Tak)屬子囊目、麥角科、擬黑粉屬。水稻稻曲病是由稻曲菌引起的水稻真菌病害。稻曲病在歷史上對水稻的危害損失並不嚴重，但是隨著全球氣候變化和我國高產優質雜交稻大面積推廣以及水稻水肥水平的提高，稻曲病危害逐年加重。稻曲病菌不但侵染水稻，還可以侵染玉米和田間一些雜草如馬唐屬和水社黍以及野生稻。水稻發生稻曲病後，不僅降低稻穀產量及質量，而且病粒含有毒素，這種毒素能引起人畜慢性中毒，極大的影響了我國糧食高產穩產和糧食食品安全。對稻曲菌的研究也逐漸引起世界各國的重視。
[0003]近年來，隨著分子生物學向真菌學的滲透和發展，真菌的遺傳轉化也越來越受到重視。真菌基因工程是進行真菌遺傳研究的重要途徑。真菌有堅韌的細胞壁結構，迄今所建立的真菌遺傳轉化技術均有利弊。例如電轉化雖然實驗過程簡單，但需要昂貴的儀器設備，而PEG介導的原生質轉化法雖然不需要儀器，但是需要製備原生質體，製備過程大多程序繁多，最終因原生質的破裂而轉化率極低。目前，農桿菌介導轉化技術在植物上應用較為廣泛，但在真菌中的應用還不是很多，根癌農桿菌介導的轉化法近幾年在一些真菌中出現有報導，例如利用根癌農桿菌轉化了黑麴黴(Aspergillus niger)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、鏈抱黴(Neurospora crassa)、立枯絲核菌(RhizoctoniasoIani )、稻痕菌(Magnaporthe grisea)、大 _ 輪枝菌(Verticillium dahliae)、紅麴黴(Monascus purpureus Went)等多種真菌。根癌農桿菌介導的轉化法因而成為真菌遺傳轉化和基因克隆的強有力工具。但是不同的真菌物種有不同的生理特性，目前真菌利用農桿菌介導的方法轉化率有待提高，轉化子的穩定性也需要提高。稻曲病是水稻上的重要病害之一，農桿菌介導稻曲菌轉化的相關研究國內外還很少見報導，2006年張震進行了根癌農桿菌介導遺傳轉化稻曲病菌的初步研究(中國水稻科學，2006, 20(4): 440-442)，但是轉化率偏低，而且無法確定轉化子的穩定性和拷貝數。因此，有必要建立一套農桿菌介導的高轉化率的稻曲菌的遺傳轉化技術，為稻曲病菌的致病機制研究、致病相關基因克隆以及為尋求控制該病害的有效途徑奠定基礎。本發明的技術效果能夠克服上述缺陷，提供一種根癌農桿菌介導的稻曲菌高效轉基因方法，以彌補現行真菌轉基因技術轉化率普遍偏低、外源基因不穩定的缺陷。
[0004]本發明涉及的 一種農桿菌介導的稻曲菌遺傳轉化方法，該方法適用於稻曲菌的各種產孢的菌種類型。通過這種方法，可以成功實現在短時間內稻曲菌的遺傳轉化。
(三)
【發明內容】
[0005]本發明目的是提供一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的高效方法，使得在短期內可以獲得大量的轉化子，可以成功實現在短時間內稻曲真菌的遺傳轉化，為稻曲菌的致病機制研究建立良好的技術平臺。
[0006]本發明採用的技術方案是:
[0007]本發明提供一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，所述方法按如下步驟進行:
(1)質粒轉化農桿菌:將構巢麴黴啟動子基因和標記基因重組到帶有潮黴素B基因的質粒中獲得重組質粒，然後用重組質粒轉化農桿菌，獲得含有潮黴素B基因和標記基因的農桿菌(優選pCAMBIA1300-TrpC-GFP重組質粒，該質粒含有潮黴素B基因和綠色螢光蛋白基因)；
(2)預誘導:將含有潮黴素B基因和標記基因的農桿菌(優選含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP質粒的農桿菌)接種至含有卡那黴素和利福平的LB液體培養基中，28°C、150rpm、黑暗條件下培養至OD6tltl為0.5~0.8，取培養液離心，將沉澱用改良AIM培養液洗滌後再用含有終濃度150~250 μ mol/L乙醯丁香酮的改良AM培養液稀釋至OD6tltl為0.1~0.3，在28°C、150rpm、黑暗條件下誘導培養至OD6tltl為0.3~0.5，獲得預誘導後的農桿菌菌液；所述改良AM 培養液終濃度組成為:8 ~12mg/L CaCl2.2Η20、0.8 ~1.2mg/L FeSO4,400 ~600mg/L順4顯3、體積濃度0.4~0.6%glycerol(丙三醇)、30~50mmol/L MES(2_嗎琳乙橫酸)、0.5~
0.7g/L MgSO4.7Η20、0.2 ~0.4g/L NaCl、1.8 ~2.2g/L 葡萄糖、50 ~150mg/L ZnSO4.7Η20、50 ~150mg/L CuSO4.5H20、50 ~150mg/L H3BO3, 50 ~150mg/L Na2MoO4.2H20 和 50 ~150mg/L CoCl2.6H20，溶劑為0.01M磷酸緩衝液，ρΗ4.8 ；(3)共培養:將稻曲菌接種在PSA液體培養基中，24~28°C，150rpm黑暗培養至OD6tltl為0.7~1.0，將培養液用紗布過濾，濾液離心，沉澱加入PSA液體培養基，獲得稻曲菌孢子液，然後將稻曲菌孢子液與步驟(2)獲得的預誘導後的農桿菌菌液以體積比1:1混合製成混合菌液，將混合菌液均勻塗布於表面鋪有濾紙、PVDF膜或硝酸纖維素膜的含乙醯丁香酮的改良AM固體培養基平板上，黑暗條件下於20~24°C共培養36~48h，然後將共培養後的膜剪成小片(優選2cmX2cm小片)並鋪在改良的選擇培養基CM上26°C培養4~5d，獲得含有潮黴素B基因的稻曲菌(優選獲得含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP質粒的稻曲菌)；所述含乙醯丁香酮的改良AM固體培養基終濃度組成為:8 ~12mg/L CaCl2.2Η20、0.8 ~1.2mg/L FeSO4,400 ~600mg/L NH4NO3'體積濃度 0.4 ~0.6%glycerol (丙三醇)、30 ~SOmmoI /T, MES (2~ 嗎琳乙橫酸)、0.5 ~0.7g/LMgSO4.7Η20、0.2 ~0.4g/L NaClU.8 ~2.2g/L 葡萄糖、50 ~150mg/L ZnSO4.7H20、50 ~150mg/L CuSO4.5H20、50 ~150mg/L H3BO3, 50 ~150mg/LNa2Mo04.2H20 和 50 ~150mg/LCoCl2.6Η20、150~250 μ mol/L乙醯丁香酮和13~18g/L瓊脂，溶劑為0.01M磷酸緩衝液，PH7.0 ;所述選擇性固體培養基CM終濃度組成為:馬鈴薯200g/L、蔗糖20g/L、瓊脂20g/L、100μ g/mL潮黴素Β、400μ g/mL頭孢黴素、60μ g/mL鏈黴素、100μ g/mL卡那黴素，溶劑為水，pH7.0。
[0008]進一步，步驟(1)所述轉化方法為:將農桿菌單菌落接種在含有終濃度50 μ g/ml利福平的LB固體培養基上，27~29°C培養至淺黃色菌落出現，挑取單菌落轉接到含有終濃度50 μ g/ml利福平的LB液體培養基中，在27~29°C、150rpm、黑暗條件下培養至OD6tltl為0.8~1.0，取培養液加入新鮮的含有終濃度50 μ g/ml利福平的LB液體培養基中，27~29°C、150rpm、黑暗條件下振蕩培養至OD6tltl為0.5~0.8，然後將培養液轉移到滅菌的離心管中，冰上放置10~15min後於1000Orpm條件下離心30~60s ;棄上清液，冰浴條件下，沉澱用滅菌的20mmol/L CaCl2水溶液懸浮後加入1/10倍體積的0.8~1.0 μ g/ml含有潮黴素B基因和標記基因的重組質粒(優選含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP重組質粒)，混勻，置於液氮中冷凍3~5min後於37°C水浴中解凍，再加入5~8倍體積的LB液體培養基，於28°C、150rpm、黑暗條件下振蕩培養至OD6tltl為0.3~0.5 ;離心，去除四分之三體積的上清液，剩餘上清液與沉澱懸浮混勻製成懸浮液，取懸浮液均勻塗布在含終濃度100μ g/mL卡那黴素和終濃度50 μ g/mL利福平的LB固體培養基上，待菌液被完全吸收後倒置，28°C培養2~4d，獲得含有潮黴素B基因和標記基因的農桿菌菌株；所述含有潮黴素B基因和標記基因的重組質粒是將構巢麴黴啟動子和標記基因重組到帶有潮黴素B基因的質粒中而獲得的，所述LB固體培養基終濃度組成為:胰蛋白腖10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂1.5g/L，溶劑為水，pH7.0 ;所述LB液體培養基終濃度組成為:胰蛋白腖10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、溶劑為水，pH7.0。
[0009]進一步，步驟(1)所述農桿菌為農桿菌AGL-1。
[0010]進一步，步驟(2)所述LB液體培養基中卡那黴素終濃度100μ g/mL，利福平終濃度為 50 μ g/mL0
[0011]進一步，步驟(2)所述改良的農桿菌誘導培養液中CoCl2.6Η20終濃度為100mg/L。
[0012]進一步，步驟(2)所述乙醯丁香酮的終濃度為200 μ mol/L。
[0013]進一步，步驟(2)所述沉澱用改良AM培養液洗滌2次。
[0014]進一步，步驟(3)所述稻曲菌孢子液的濃度為IO5~IO7個/mL (優選IO6個/mL)。
[0015]進一步，步驟(3 )所述改良AM固體培養基平板上鋪有PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)。
[0016]進一步，所述PVDF膜孔徑為0.45 μ m。
[0017]進一步，步驟(3)所述稻曲菌為稻曲菌SX02-01 (即陝西稻曲菌SX02-01 )、稻曲菌ZJ02-02 (即浙江稻曲菌ZJ02-02)或稻曲菌SY04 (即瀋陽稻曲菌SY04)。本發明所述稻曲菌菌系見公開文獻:王永強等，中國不同地理來源稻曲病菌rDNA-1TS的分析，植物保護學報，2009，36 (5) =475-476 ;所述3種稻曲菌菌株(即稻曲菌SX02-01、稻曲菌ZJ02-02或稻曲菌SY04)可以從浙江大學生物技術研究所獲得，地址為:浙江杭州市餘杭塘路866號浙江大學紫金港校區，聯繫電話:0571-86835772，86971667。
[0018]本發明為了驗證潮黴素B基因和標記基因是否轉化到稻曲菌中，採用選擇培養、復篩及PCR檢測等手段來確定，所述選擇培養、復篩及PCR檢測方法為:
[0019](I)選擇培養
[0020]將步驟(3)共培養後的濾紙、硝酸纖維素膜或PVDF膜(孔徑0.45 μ m)剪成2X2cm的小片，在改良的選擇培養基CM上26°C培養4~5d，觀察菌落生長。選擇性固體培養基CM終濃度組成為:馬鈴薯200g/L、蔗糖20g/L、瓊脂20g/L、100 μ g/mL潮黴素Β、400 μ g/mL頭孢黴素、60 μ g/mL鏈黴素、100 μ g/mL卡那黴素，溶劑為水，pH7.0。
[0021](2)復篩
[0022]將步驟(1)選擇培養過程中膜周圍長出的菌落挑取轉移到含有潮黴素B (終濃度為100 μ g/mL)和頭孢黴素(終濃度為400 μ g/mL)的PSA固體培養基平板上，22~26°C培養48~60h進行復篩，獲得單菌落。隨機挑選經過復篩得到的單菌落接種到不含潮黴素B的PSA固體培養基上，22~26°C培養7d,挑取單菌落接種至不含潮黴素B的PSA固體培養基上，22~26°C培養7d，連續轉接8次後，挑取單菌落再轉接到含終濃度100μ g/mL潮黴素B的PSA固體培養基上，同時接種出發菌株稻曲菌SX0201作為對照，22~26°C培養7d，觀察菌落生長。與對照相比，能多次在含有潮黴素B的培養基上生長的稻曲菌為復篩轉化子。PSA固體培養基終濃度組成為:馬鈴薯200g/L、蔗糖20g/L、瓊脂20g/L，溶劑為水，pH為 7.0。
[0023](3)轉化子的PCR檢測(目的是檢驗pCAMBIA1300-TrpC-GFP質粒上攜帶的潮黴素B基因(hpt)和綠色螢光蛋白基因(gfp)是否轉入稻曲菌)
[0024]a、潮黴素磷酸轉移酶基因(hpt)的PCR檢測
[0025]隨機挑取步驟(2)獲得的復篩轉化子，用改進的CTAB方法(參見專利ZL201110365304.4)提取野生型稻曲菌SX02-01菌株和轉化子菌株(即含pCAMBIA1300-TrpC-GFP質粒的稻曲菌SX02-01)基因組DNA，以重組質粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP上的潮黴素磷酸轉移酶基因(hpt)為模板分別設計特異引物hpt_F和hpt-R (引物由上海生工生物技術有限公司合成，序列見表1)進行PCR檢測。潮黴素磷酸轉移酶基因(hpt)的PCR擴增實驗步驟為:取0.2ml的離心管，分別加入下列試劑，IOXPCRBuffer 5 μ L, dNTPs Mixture (100mmol/L) 4 μ L, hpt~F Primer (20 μ mol/L) I μ L,hpt-R Primer (20 μ mol/L) I μ I, DNA模板(所提取的稻曲菌基因組DNA分別用雙蒸水稀釋200倍後作為PCR反應的模板)I μ L，Taq DNA聚合酶I μ L，補加滅菌的雙蒸水到50 μ L。
[0026]PCR擴增反應條件為:94°C預熱變性5min，然後進入循環階段，94°C熱變性40s，56°C復性30s，72°C延伸lmin，進行30個循環，最後72°C延伸lOmin。反應結束後，取5μ L擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以驗證潮黴素磷酸轉移酶基因(hpt)是否轉入稻曲菌基因組中。
[0027]表1擴增hpt基因的引物序列
[0028]
【權利要求】
1.一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於所述方法按如下步驟進行:(1)質粒轉化農桿菌:將構巢麴黴啟動子和標記基因重組到帶有潮黴素B基因的質粒中獲得重組質粒，然後用重組質粒轉化農桿菌，獲得含有潮黴素B基因和標記基因的農桿菌；(2)預誘導:將含有潮黴素B基因和標記基因的農桿菌接種至含有卡那黴素和利福平的LB液體培養基中，281:、150印111、黑暗條件下培養至OD6tltl為0.5~0.8，取培養液離心，將沉澱用改良AM培養液洗滌後再用含有終濃度150~250 μ mol/L乙醯丁香酮的改良AM培養液稀釋至OD600為0.1~0.3，在28°C、150rpm、黑暗條件下誘導培養至OD600為0.3~0.5，獲得預誘導後的農桿菌菌液；所述改良AIM培養液終濃度組成為:8~12mg/L CaCl2.2Η20、.0.8 ~1.2mg/L FeS04、400 ~600mg/L ΝΗ4Ν03、體積濃度0.4 ~0.6%glycerol、30 ~50mmol/LMES、0.5 ~0.7g/L MgSO4.7Η20、0.2 ~0.4g/L NaClU.8 ~2.2g/L 葡萄糖、50 ~150mg/LZnSO4.7Η20、50 ~150mg/LCuS04.5Η20、50 ~150m g/L H3BO3, 50 ~150m g/L Na2MoO4.2Η20和50~150mg/L CoCl2.6Η20，溶劑為0.01M磷酸緩衝液，ρΗ4.8 ; (3)共培養:將稻曲菌接種在PSA液體培養基中，24~28°C培養至0D_為0.7~1.0，將培養液用紗布過濾，濾液離心，沉澱加入PSA液體培養基，獲得稻曲菌孢子液，然後將稻曲菌孢子液與步驟(2)獲得的預誘導後的農桿菌菌液以體積比1:1混合製成混合菌液，將混合菌液均勻塗布於表面鋪有濾紙、PVDF膜或硝酸纖維素膜的含乙醯丁香酮的改良AM固體培養基平板上，黑暗條件下於20~24°C共培養36~48h，再將共培養後的濾紙、PVDF膜或硝酸纖維素膜剪成小片並鋪在改良的選擇培養基CM上26°C培養4~5d，獲得含有潮黴素B基因的稻曲菌；所述含乙醯丁香酮的改良AM固體培養基終濃度組成為:8~12mg/LCaCl2.2Η20、0.8~1.2mg/L FeSO4,400 ~600mg/L 順4顯3、體積濃度 0.4 ~0.6%glycerol>30 ~SOmmoI/T, MES>0.5 ~0.7g/LMgSO4.7Η20、0.2 ~0.4g/L NaClU.8 ~2.2g/L 葡萄糖、50 ~150mg/L ZnSO4.7H20、50 ~150mg/L CuSO4.5H20、50 ~150mg/L H3BO3, 50 ~150mg/L Na2MoO4.2H20 和 50 ~150mg/LCoCl2.6Η20、150~250 μ mol/L乙醯丁香酮和13~18g/L瓊脂，溶劑為0.01M磷酸緩衝液，PH7.0 ;所述選擇性固體培養基CM終濃度組成為:馬鈴薯200g/L、蔗糖20g/L、瓊脂20g/L、100μ g/mL潮黴素Β、400μ g/mL頭孢黴素、60μ g/mL鏈黴素、100μ g/mL卡那黴素，溶劑為水，pH7.0。
2.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(1)所述轉化方法為:將農桿菌單菌落接種在含有終濃度50μ g/ml利福平的LB固體培養基上，27~29°C培養至淺黃色菌落出現，挑取單菌落轉接到含有終濃度50μ g/ml利福平的LB液體培養基中，在27~29°C、150rpm、黑暗條件下培養至OD6tltl為0.8~1.0，取培養液加入新鮮的含有終濃度50 μ g/ml利福平的LB液體培養基中，27~29°C、150rpm、黑暗條件下振蕩培養至OD6tltl為0.5~0.8,然後冰浴10~15min後於1000Orpm條件下離心30~60s ;棄上清液，冰浴條件下，將沉澱用滅菌的20mmol/L CaCl2水溶液懸浮後加入1/10倍體積的0.8~.1.0 μ g/ml含有潮黴素B基因和標記基因的重組質粒,混勻，置於液氮中冷凍3~5min後於37°C水浴中解凍，再加入5~8倍體積的LB液體培養基，於28°C、150rpm、黑暗條件下振蕩培養至OD6tltl為0.3~0.5 ;離心，去除四分之三體積的上清液，剩餘上清液與沉澱懸浮混勻成懸浮液，取懸浮 液均勻塗布在含終濃度100 μ g/mL卡那黴素和終濃度50 μ g/mL利福平的LB固體培養基上，待菌液被完全吸收後倒置，28°C培養2~4d，獲得含有潮黴素B基因和標記基因的農桿菌菌株；所述含有潮黴素B基因和標記基因的重組質粒是將構巢麴黴啟動子和標記基因重組到帶有潮黴素B基因的質粒中而獲得的，所述LB固體培養基終濃度組成為:胰蛋白腖10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂1.5g/L，溶劑為水，pH7.0 ;所述LB液體培養基終濃度組成為:胰蛋白腖10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、溶劑為水，ρΗ7.0。
3.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(1)所述農桿菌為農桿菌AGL-1。
4.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(2)所述LB液體培養基中卡那黴素終濃度為100μ g/mL，利福平終濃度為50μ g/mL。
5.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(2)所述改良AIM培養液中CoCl2.6H20終濃度為100mg/L。
6.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(2)所述乙醯丁香酮的終濃度為200 μ mol/L。
7.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(3)所述稻曲菌孢子液的濃度為1O5~1O7個/mL。
8.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(3)所述改良AM固體培養基平板上鋪有PVDF膜。
9.如權利要求8所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於所述PVDF膜孔徑為 0.45 μ m。
10.如權利要求1所述農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法，其特徵在於步驟(3)所述稻曲菌為稻曲菌SX02-01、稻曲菌ZJ02-02或稻曲菌SY04。
【文檔編號】C12N1/15GK103834681SQ201310614030
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年11月26日 優先權日:2013年11月26日
【發明者】鄒克琴, 汪德凱, 胡東維, 李素芳, 朱誠 申請人:中國計量學院