製備細胞毒性淋巴細胞的方法

2023-07-11 01:21:31 2

專利名稱：製備細胞毒性淋巴細胞的方法
技術領域：
本發明涉及製備可用於醫療領域的細胞毒性淋巴細胞的方法。
背景技術：
生物體主要通過免疫應答保護其免受外來物質的侵害，其免疫系統由各種細胞及這些細胞產生的可溶性因子建立起來。在這些細胞當中，白細胞尤其是淋巴細胞起到關鍵的作用。淋巴細胞可分為兩類，分別是B淋巴細胞(以下稱為B細胞)和T淋巴細胞(以下稱為T細胞)，兩者都能特異性地識別某種抗原並作用於該抗原，以對生物體進行保護。
T細胞可細分為具有CD(集群名稱)4標記的輔助T細胞(以下稱為TH)，其主要輔助抗體的生產和誘導各種免疫應答；和具有CD8標記的細胞毒性T細胞(Tc細胞毒性T淋巴細胞，也稱為殺傷T細胞，以下簡稱CTL)，其主要具有細胞毒性活性。CTL在腫瘤細胞、病毒感染細胞等的識別、破壞和消除方面發揮著最重要的作用，但它並不象B細胞那樣產生能特異性地與抗原發生發應的抗體，而是直接識別和作用於來自靶細胞的抗原(抗原肽)，所述靶細胞與存在於靶細胞細胞膜表面上的主要組織相容性複合體[MHC，在人類中也稱為人白細胞抗原(HLA)]I類分子結合。此時，存在於CTL細胞膜表面上的T細胞受體(以下稱為TCR)特異性地識別上述抗原肽和MHCI類分子，確定所述抗原肽是衍自自身或是衍自異身。然後已被確定衍自異身的靶細胞被CTL特異性地破壞和消除。
近年來，人們對會給患者身體造成較重負擔的療法如藥物療法和放射療法進行了反思，而且人們對只給患者身體造成較輕負擔的免疫療法的興趣日益提高。尤其是，人們已注意到過繼免疫療法的效果，在過繼免疫療法當中，能特異性地與目的抗原反應的CTL可在體外從衍自具有正常免疫功能的人體的淋巴細胞誘導而來，或其不經誘導即可擴增，然後被轉移給患者。例如，已有人提出，在動物模型中過繼免疫療法對於病毒感染和腫瘤是一種有效的療法[Greenberg，P.D.著，Advances in Immunology，1992年出版；Reusser P.等著，Blood，78(5)，1373-1380(1991)]。在這種療法中，重要的是維持或增加處於CTL抗原特異性細胞毒性活性得以維持或增強的狀態的細胞的數量。
在上述過繼免疫療法當中，必須使給予的細胞毒性淋巴細胞的數量達到設定數量或更高，以獲得治療效果。換句話說，可以說主要問題在於要在短時間內在體外獲得上述數量的細胞。
為維持或增強CTL的抗原特異性細胞毒性活性，通常採用這樣的方法，即當誘導CTL對抗原的特異性應答時，可用目的抗原進行反覆刺激。然而，在這種方法中，最終獲得的CTL的數量往往會減少，以至於不能獲得足夠數量的細胞。
用以製備能有效治療疾病的T細胞的方法已知有例如使用高濃度的用IL-2誘導的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的過繼免疫療法[N.Engl.J.Med.，316，1310-1321(1996)；Rosenberg S.A.等，N.Engl.J Med.，319(25)，1676-1680(1988)；Ho M.等，Blood，81(8)，2093-2101(1993)]。
其次，對於抗原特異性CTL的製備，已報導用自身CMV感染成纖維細胞和IL-2[Riddell S.A.等，J.Immunol.，146(8)，2795-2804(1991)]或用抗CD3單克隆抗體(抗CD3 mAb)和IL-2[Riddell S.A.等，J.ImmunolMethods，128(2)，189-201(1990)]分離和擴增CMV特異性CTL克隆的方法。
此外，WO 96/06929公開了REM方法(快速擴增方法)。此REM方法是一種在短時間內擴增含有抗原特異性CTL和TH的初級T細胞群體的方法。換句話說，此方法的特徵在於，可通過增殖單獨的T細胞克隆提供大量的T細胞，且通過使用抗CD3抗體、IL-2和經輻射造成其增殖能力有缺陷的PBMC(外周血單核細胞)以及Epstein-Barr病毒(以下簡稱EBV)感染細胞，抗原特異性CTL的數量得到提高。
此外，WO 97/32970公開了改進的REM方法，該方法使用能與PBMC區別開來的能表達T細胞刺激成分的未分化哺乳動物細胞株作為飼養細胞，以減少所用的PBMC的數量。
淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)是具有細胞毒性活性的功能性細胞群體，其可通過將IL-2加入到含有淋巴細胞的外周血(外周血白細胞)、臍帶血、組織液等，並將淋巴細胞在體外培養數天而獲得。在培養過程中，可通過向LAK細胞中加入抗CD3抗體並培養細胞來進一步加速LAK細胞的增殖。這樣獲得的LAK細胞具有對各種癌細胞和其它靶標沒有特異性的細胞毒性活性。LAK細胞也可以與上述CTL相同的方式用於過繼免疫療法中。
如上所述，在獲得細胞毒性淋巴細胞如CTL、LAK細胞、TIL等的步驟中必須使用IL-2。淋巴細胞可進一步通過將IL-2結合到細胞表面的白細胞介素-2受體(IL-2R)來激活。此外，還知IL-2R是淋巴細胞的激活標記。從以上觀點出發，重要的是要改善細胞表面上的IL-2R表達。此外，在CTL的誘導中，重要的是提高CTL前體細胞經受抗原刺激誘導成為CTL的效率，即提高誘導後的一組細胞中CD8陽性細胞的比例(比率)。
纖連蛋白是分子量為25萬的巨大糖蛋白，存在於動物血液中、培養細胞的表面上或組織的胞外基質中，已知其具有多種功能。其結構域結構可分為7個部分(以下參見

圖1)，其中三種類似的序列包含於其一胺基酸序列中，重複這三種序列的每一種就構成了整個序列。這三種類似的序列分別指定為I型、II型和III型。這三種序列當中，III型由71-96個胺基酸殘基構成，其中這些胺基酸殘基的重合比率為17-40％。纖連蛋白中有14個III型序列，這當中第8個、第9個或第10個序列(以下分別稱為III-8、III-9或III-10)包含於細胞結合結構域，而第12個、第13個或第14個序列(以下分別稱為III-12、III-13或III-14)包含於肝素結合結構域。此外，VLA(極遲活化抗原)-5結合區包含於III-10中，其核心序列為RGDS。此外，稱為IIICS的區域存在於肝素結合結構域的C末端。由25個胺基酸構成且具有VLA-4結合活性的稱為CS-1的區域存在於IIICS(Deane F.Momer，FIBRONECTIN，ACADEMIC PRESS INC.，1-8(1998)；Kimizuka F.等，J.Biochem.110，284-291(1991)；Hanenberg H.等，Human Gene Therapy 8，2193-2206(1997))。

發明內容
本發明之一是一種製備具有高水平細胞毒性活性的細胞毒性淋巴細胞的方法，所述淋巴細胞適合用於醫療領域。
具體而言，本發明涉及[1]一種製備細胞毒性淋巴細胞的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟；[2]上述[1]的方法，其中與在纖連蛋白、其片段或其混合物不存在下通過進行至少誘導、維持和擴增之一而獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，所述細胞毒性淋巴細胞高度表達白細胞介素-2受體；[3]上述[1]的方法，其中與在纖連蛋白、其片段或其混合物不存在下通過進行至少誘導、維持和擴增之一而獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，所述細胞毒性淋巴細胞含有更高比率的CD8陽性細胞；[4]上述[1]-[3]之任一項的方法，其中與在纖連蛋白、其片段或其混合物不存在下通過進行至少誘導、維持和擴增之一而獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，所述細胞毒性淋巴細胞高度保持細胞毒性活性；[5]上述[1]-[4]之任一項的方法，其中所述纖連蛋白、其片段或其混合物固定化在固相上；[6]上述[5]的方法，其中所述固相為細胞培養設備或細胞培養載體；[7]上述[6]的方法，其中所述細胞培養設備為培養皿、培養瓶或培養袋，所述細胞培養載體為珠粒、薄膜或載玻片；[8]上述[1]-[4]之任一項的方法，其中至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一在含有纖連蛋白、其片段或其混合物的培養基中進行；[9]上述[1]-[8]之任一項的方法，其中所述纖連蛋白片段為包含由序列表的SEQ ID NO1-7代表的胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能；[10]上述[9]的方法，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性；[11]上述[9]的方法，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表的SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽；[12]上述[1]的方法，所述方法包括在包含培養基的細胞培養設備中、在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下，進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一，其中所述方法滿足以下條件之任一項(a)培養初始時細胞數量與細胞培養設備的培養面積的比率為1-5×105細胞/cm2；(b)培養初始時培養基中的細胞濃度為1-5×105細胞/ml；[13]上述[12]的方法，其中所述方法排除了稀釋步驟或調換細胞培養設備的步驟；[14]通過上述[1]-[13]之任一項的方法獲得的細胞毒性淋巴細胞；[15]包含作為有效成分的通過上述[1]-[13]之任一項的方法獲得的細胞毒性淋巴細胞的藥物；[16]用以增強細胞的白細胞介素-2受體表達的藥物，所述藥物的特徵在於所述藥物包含作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物；[17]上述[16]的藥物，其中所述纖連蛋白片段為包含由序列表的SEQID NO1-7代表的胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能；[18]上述[17]的藥物，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性；[19]上述[17]的藥物，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表的SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽；[20]用以提高淋巴細胞中CD8陽性細胞的比率的藥物，所述藥物的特徵在於所述藥物包含作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物；[21]上述[20]的藥物，其中所述纖連蛋白片段為包含由序列表的SEQID NO1-7代表的胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能；[22]上述[21]的藥物，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性；[23]上述[21]的藥物，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表的SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽；[24]用以提高或維持細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的藥物，所述藥物的特徵在於所述藥物包含作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物；[25]上述[24]的藥物，其中所述纖連蛋白片段為包含由序列表的SEQID NO1-7代表的胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能；[26]上述[25]的藥物，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性；[27]上述[25]的藥物，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表的SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽；[28]用以增強淋巴細胞的白細胞介素-2受體表達的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟；[29]用以提高淋巴細胞中CD8陽性細胞的比率的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟；[30]用以提高或維持細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟；[31]上述[1]-[13]之任一項的方法，所述方法進一步包括將外源基因轉導到細胞毒性淋巴細胞的步驟；[32]上述[31]的方法，其中外源基因用逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒或猿猴病毒轉導。
附圖簡介圖1為表示纖連蛋白結構域結構的示意圖。
本發明的最佳實施方式本發明是基於以下發現得以完成的在纖連蛋白和/或其片段存在下製備的細胞毒性淋巴細胞中，高細胞毒性活性得以維持，IL-2的表達水平顯著提高，且CD8陽性細胞的比率也得以提高。
順便說明一下，本文所用的細胞毒性淋巴細胞的製備指細胞的誘導(激活)、維持和擴增步驟中的各個步驟，或這些步驟的組合。本發明細胞毒性淋巴細胞的製備也稱為細胞毒性淋巴細胞的培養。
以下具體說明本發明。
(1)本發明所用的纖連蛋白及其片段本文提到的纖連蛋白及其片段可從天然獲得或人工合成。纖連蛋白及其片段可按Ruoslahti E.等的公開方法[J.Biol.Chem.，256(14)，7277-7281(1981)]從天然來源的物質製備成大致純形式。本文所指的術語「大致純纖連蛋白及其片段」指這些纖連蛋白及其片段基本上不含與纖連蛋白一起天然存在的其它蛋白質等。上述各纖連蛋白及其片段在本發明中可單獨使用，或多種纖連蛋白及其片段混合使用。
有關可用於本發明的纖連蛋白片段以及所述片段的製備的有用信息可從Kimiduka F.等[J.Biochem.，110，284-291(1991)]、Kornbrihtt A.R.等[EMBO J.，4(7)，1755-1759(1985)]、Sekiguchi K.等[Biochemistry，25(17)，4936-4941(1986)]等處獲得。
在本發明中，纖連蛋白片段可通過例如包括包含至少以下任一區域的胺基酸序列的多肽來示例說明區域III-8(序列表中SEQ ID NO1所示胺基酸序列)、區域III-9(序列表中SEQ ID NO2所示胺基酸序列)、區域III-10(序列表中SEQ ID NO3所示胺基酸序列)、區域III-12(序列表中SEQ ID NO4所示胺基酸序列)、區域III-13(序列表中SEQID NO5所示胺基酸序列)、區域III-14(序列表中SEQ ID NO6所示胺基酸序列)及區域CS-1(序列表中SEQ ID NO7所示胺基酸序列)(參見圖1)。
此外，就片段而言，優選使用具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性的片段。細胞黏附活性可通過用已知方法分析用於本發明的片段(其細胞結合結構域)與細胞的結合情況來評價。例如上述方法包括Williams D.A.等的方法[Nature，352，438-441(1991)]。該方法測定細胞與固定到培養板的片段的結合情況。此外，肝素結合活性可通過用已知方法分析用於本發明的片段(其肝素結合結構域)與肝素的結合情況來評價。例如，片段與肝素的結合情況可通過使用肝素(如標記肝素)取代細胞，按與上述Williams D.A.等的方法相同的方式來評價。
另外，纖連蛋白片段可通過選自以下的多肽來示例說明C-274(序列表中SEQ ID NO8所示胺基酸序列)、H-271(序列表中SEQID NO9所示胺基酸序列)、H-296(序列表中SEQ ID NO10所示胺基酸序列)、CH-271(序列表中SEQ ID NO11所示胺基酸序列)、CH-296(序列表中SEQ ID NO12所示胺基酸序列)或C-CS1(序列表中SEQ ID NO13所示胺基酸序列)。
上述片段CH-271、CH-296、C-274和C-CS1均為含有具有與VLA-5的結合活性的細胞結合結構域的多肽。而且，C-CS1、H-296或CH-296為含有具有與VLA-4的結合活性的細胞結合結構域的多肽。另外，H-271、H-296、CH-271或CH-296為含有肝素結合結構域的多肽。
在本發明中，也可使用其中上述各結構域被修飾的片段。纖連蛋白的肝素結合結構域由三個III型序列(III-12、III-13和III-14)構成。在本發明中也可使用包含缺失一個或兩個III型序列的肝素結合結構域的片段。例如，所述片段的示例為CHV-89(序列表中SEQ ID NO14所示胺基酸序列)、CHV-90(序列表中SEQ ID NO15所示胺基酸序列)或CHV-92(序列表中SEQ ID NO16所示胺基酸序列)，它們為其中纖連蛋白的細胞結合位點(VLA-5結合結構域Pro1239-Ser1515)與III型序列中的一個序列結合的片段，或CHV-179(序列表中SEQ ID NO17所示胺基酸序列)或CHV-181(序列表中SEQ ID NO18所示胺基酸序列)，它們為其中纖連蛋白的細胞結合位點與III型序列中的兩個序列結合的片段。CHV-89、CHV-90和CHV-92分別含有III-13、III-14和III-12，CHV-179含有III-13和III-14，CHV-181含有III-12和III-13。
此外，在本發明中可使用在上述各片段中添加了另外的胺基酸的片段。例如，所述片段可按照下述製備實施例中介紹的製備H-275-Cys的方法，將所需的胺基酸添加到上述各片段來製備。例如，H-275-Cys(序列表中SEQ ID NO19所示胺基酸序列)為具有纖連蛋白的肝素結合結構域且在C末端有半胱氨酸殘基的片段。
本發明所用片段可為這樣的包含多肽的片段所述多肽包含在構成至少部分含有以上例示的天然纖連蛋白的胺基酸序列的片段的多肽胺基酸序列中，有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的胺基酸序列，其中所述多肽具有與所述片段等同的功能，只要獲得本發明所需的效果。
優選胺基酸的取代等進行到這樣的程度，使得固有多肽的物理化學特性等發生改變，而多肽的功能又能得以維持。例如，胺基酸的取代等保守在這樣的範圍多肽所固有的特性(例如疏水性、親水性、電荷、pK等)基本上沒有改變。例如，胺基酸的取代為以下各組胺基酸內的取代①甘氨酸、丙氨酸；②纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；③天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、谷醯胺；④絲氨酸、蘇氨酸；⑤賴氨酸、精氨酸；⑥苯丙氨酸、酪氨酸。胺基酸的缺失、添加或插入是在具有與多肽中主題位點周圍的特性類似的特性的胺基酸中進行缺失、添加或插入，而又基本上不改變所述主題位點周圍的特性。
此外，術語「具有等同功能」指具有至少以下任一功能(i)維持細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的功能，(ii)增強IL-2R表達水平的功能，或(iii)提高CD8陽性細胞比率的功能。可按照下述實施例介紹的方法適當地確定包含具有胺基酸取代等的多肽的片段是否具有上述功能。此外，作為包含具有胺基酸取代等的多肽的片段，優選具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性的片段。細胞黏附活性和肝素結合活性可按照用以確定這些活性的上述方法進行評價。
作為包含具有胺基酸取代等的多肽的片段，例如在兩個不同的結構域之間有一個或多個胺基酸作為接頭插入的片段也可用於本發明。
順便說明一下，作為纖連蛋白本身，同樣在本發明中可使用這樣的多肽所述多肽具有在構成纖連蛋白多肽的胺基酸序列中具有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的胺基酸序列，其中所述多肽具有至少任一上述(i)-(iii)的功能。
本文所指的纖連蛋白片段也可在例如美國專利第5,198,423號介紹內容基礎上從遺傳重組子製備得到。例如，在上述專利的說明書詳細介紹了H-271(SEQ ID NO9)、H-296(SEQ ID NO10)、CH-271(SEQID NO11)和CH-296(SEQ ID NO12)各片段以及製備這些片段的方法。此外，上述C-274(SEQ ID NO8)片段可按照美國專利第5,102,988號中介紹的方法獲得。另外，C-CS1(SEQ ID NO13)片段可按照日本專利公報第3104178號中介紹的方法獲得。CHV-89(SEQ ID NO14)、CHV-90(SEQ ID NO15)或CHV-179(SEQ ID NO17)各片段可按照日本專利公報第2729712號中介紹的方法獲得。此外，CHV-181(SEQ IDNO18)片段可按照WO 97/18318中介紹的方法獲得。CHV-92(SEQ IDNO16)片段可使用在日本專利公報第2729712號和WO 97/18318中介紹的質粒的基礎上按常規方式構建的質粒，通過遺傳工程技術獲得。
這些片段或可按常規方式衍自這些片段的片段可通過使用以以下保藏號保藏於International Patent Organism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本(郵政編碼305-8566)的微生物來製備，或通過用已知方法修飾各微生物所攜帶的質粒來製備。
FERM BP-2264(攜帶編碼H-271的質粒的大腸桿菌，保藏日期1989年1月30日)；FERM BP-2800(攜帶編碼CH-296的質粒的大腸桿菌，保藏日期1989年5月12日)；FERM BP-2799(攜帶編碼H-271的質粒的大腸桿菌，保藏日期1989年5月12日)；FERM BP-7420(攜帶編碼H-296的質粒的大腸桿菌，保藏日期1989年5月12日)；FERM BP-1915(攜帶編碼C-274的質粒的大腸桿菌，保藏日期1988年6月17日)；FERM BP-5723(攜帶編碼C-CS1的質粒的大腸桿菌，保藏日期1990年3月5日)；FERM P-12182(攜帶編碼CHV-89的質粒的大腸桿菌，保藏日期1991年4月8日)；FERM P-12183(攜帶編碼CHV-179的質粒的大腸桿菌，保藏日期1991年4月8日)；由於纖連蛋白是巨大的糖蛋白，出於工業目的和藥物製備目的而製備和使用天然蛋白質未必容易。另外，纖連蛋白大量存在於生物體的血漿中。因此，當獲自血漿的纖連蛋白被用作血製品時，存在汙染纖連蛋白以外的成分的風險，所以從安全方面出發，可以想像會存在問題。此外，由於纖連蛋白是多功能蛋白，取決於其使用情況，可以想像會存在某些由與通過本發明方法顯示效果的區域不同的區域造成的缺點。由於以上原因，優選在本發明中使用纖連蛋白片段，從可獲得性、容易處理性和安全性的觀點出發，更優選使用如上所述獲得的重組纖連蛋白片段。另外，特別優選使用顯示如以下效果的纖連蛋白片段淋巴細胞擴增比率的提高、在擴增的淋巴細胞中IL-2R表達水平的提高、或在如下所述的擴增淋巴細胞群體中CD8陽性細胞比率的提高。此外，本發明中使用的纖連蛋白片段的分子量為但不具體局限於優選1-200kD，更優選5-190kD，甚至更優選10-180kD。
(1)製備本發明細胞毒性淋巴細胞的方法以下具體說明製備本發明細胞毒性淋巴細胞的方法。本發明的方法是這樣的製備細胞毒性淋巴細胞的方法，該方法包括在上述纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之任一項的步驟。
本文所用的「細胞毒性淋巴細胞」指包含細胞毒性淋巴細胞的一組細胞。狹義上，在某些情況下細胞毒性淋巴細胞可只指包含於上述細胞組中的淋巴細胞。此外，本發明中細胞毒性淋巴細胞的製備包括以下任一項將能形成本發明淋巴細胞的前體細胞誘導成具有細胞毒性活性的淋巴細胞、維持該細胞毒性淋巴細胞和用細胞毒性淋巴細胞和/或前體細胞擴增細胞毒性淋巴細胞。
本發明細胞毒性淋巴細胞包括但不具體限於例如細胞毒性T細胞(CTL)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞等，以上各細胞具有抗原特異性細胞毒性活性。
在本發明中，可形成細胞毒性淋巴細胞的前體細胞，即具有分化成所述淋巴細胞的能力的前體細胞的例子有PBMC、NK細胞、原初細胞、記憶細胞、造血幹細胞、臍帶血單核細胞等。此外，只要細胞是血細胞，所述細胞即可在本發明中用作前體細胞。可直接使用從生物體收集的以上這些細胞之任一種，或可使用凍藏細胞。順便說明一下，在製備本發明細胞毒性淋巴細胞的方法中，可使用含有上述細胞的材料，例如，血液如外周血或臍帶血；從血中除去某些成分如紅細胞和血漿獲得的材料；骨髓液等。
製備本發明細胞毒性淋巴細胞的方法的一大特徵在於所述淋巴細胞是在選自纖連蛋白、其片段或其混合物的有效成分存在下製備的。
在本發明的方法中，細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和/或擴增通常在上述本發明有效成分的存在下在含有特定組分的培養基中進行。
例如，在本發明的方法中，當打算進行細胞毒性淋巴細胞的誘導或擴增時，培養開始時用於本發明的細胞(細胞毒性淋巴細胞和/或前體細胞)數量沒有具體限制。例如，細胞數量優選在1-1×108細胞/ml。此外，對培養條件沒有具體限制，可使用一般的細胞培養條件。例如，細胞可在5％CO2存在下在37℃等條件下培養。此外，可適當定時用新鮮培養基更換所用培養基。
對在製備本發明細胞毒性淋巴細胞的方法中使用的培養基沒有具體限制，可使用通過混合細胞毒性淋巴細胞或其前體細胞的維持和生長所必需的組分製備而成的已知培養基。例如，可使用市售培養基。這些培養基除含有固有成分外，還含有合適的蛋白質、細胞因子和其它組分。優選在本發明中使用含有IL-2的培養基。培養基中IL-2的濃度為但不具體限於例如優選0.01-1×105U/ml，更優選0.1-1×104U/ml。
此外，可形成細胞毒性淋巴細胞的前體細胞可在進一步含有抗CD3抗體的培養基中共培養。培養基中抗CD3抗體的濃度為但不具體限於例如優選0.01-100μg/ml。加入抗CD3抗體的目的是激活淋巴細胞上的受體。而且，除以上之外，也可加入淋巴細胞刺激因子如卵磷脂。對培養基中各組分的濃度沒有具體限制，只要獲得所需的效果即可。
除將上述組分溶解在培養基中使它們與培養基共存在一起外，也可將它們固定到合適的固相上，如細胞培養設備(包括任何開放體系設備或密閉體系設備)，如培養皿、培養瓶或培養袋，或固定到細胞培養載體上，如珠粒、薄膜或載玻片；對上述固相的材料沒有具體限制，只要它們可用於細胞培養即可。當將各組分固定到例如上述設備時，優選相對於待加入到所述設備的培養基的量，固定特定量的各組分，使得所得培養基與在所述培養基加入到所述設備時通過在培養基中溶解所述組分來使用所述組分的情況所需的濃度相比，具有類似的濃度比例。對固定的各組分的量沒有具體限制，只要獲得所需的效果即可。上述載體可通過在細胞培養過程中將載體浸入細胞培養設備中的培養基中來使用。當上述組分固定到上述載體時，優選相對於待加入到所述設備的培養基的量，固定特定量的各組分，使得所得培養基與在所述載體加入到所述培養基時通過在培養基中溶解所述組分來使用所述組分的情況所需的濃度相比，具有類似的濃度比例。對固定的各組分的量沒有具體限制，只要獲得所需的效果即可。
在兩種情況下，上述組分的固定化可通過已知方法來進行，例如下述的固定纖連蛋白片段的方法。
另外，可與上述組分一起使用的物質是選自WO 02/14481介紹的以下化合物酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖及其鹽，它們對具有抗原特異性細胞毒性活性的細胞毒性T細胞的誘導有效，或選自以下(A)-(D)的物質(A)具有結合CD44活性的物質；
(B)能調節由CD44配體與CD44的結合所發出的信號的物質；(C)能抑制生長因子與生長因子受體的結合的物質；(D)能調節由生長因子與生長因子受體的結合所發出的信號的物質。
具有CD44結合活性的上述物質的例子有例如CD44配體和/或抗CD44抗體。能調節由CD44配體與CD44的結合所發出的信號的物質包括例如磷酸酶的各種抑制劑。能抑制生長因子與生長因子受體的結合的物質包括例如具有與生長因子結合的活性且能與生長因子形成複合體、從而抑制生長因子與生長因子受體的結合的物質，或具有與生長因子受體結合的活性、從而抑制生長因子與生長因子受體的結合的物質。另外，能調節由生長因子與生長因子受體的結合所發出的信號的物質包括例如磷酸酶的各種抑制劑。對這些組分在培養基中的濃度沒有具體限制，只要獲得所需的效果即可。而且，除將這些組分溶解在培養基中使它們在培養基中共存在一起外，也可將它們固定到上述合適的固相上來使用。
在此，上述各種物質可單獨使用，或兩種或多種混合使用。
在本發明中，術語「在上述有效成分存在下」指這樣一個事實有效成分的存在狀態使得當進行細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增時，上述有效成分的能發揮其功能，但對有效成分的存在方式沒有具體限制。例如，當有效成分溶解於備用的培養基時，對在進行共培養的培養基中的本發明有效成分的含量沒有具體限制，只要獲得所需的效果即可。有效成分的含量為例如優選0.01-1000μg/ml，更優選0.1-1000μg/ml，甚至更優選1-100μg/ml。除如上將有效成分溶解在培養基中使其與培養基共存在一起外，也可將它們固定到合適的固相上來使用，如細胞培養設備(包括任何開放體系設備或密閉體系設備)，如培養皿、培養瓶或培養袋，或固定到細胞培養載體上，如珠粒、薄膜或載玻片。從將培養的細胞毒性淋巴細胞給予生物體的觀點出發，希望將上述有效成分固定化，但對此沒有具體限制。
一旦上述各種組分或本發明有效成分固定到固相上，通過本發明方法獲得細胞毒性淋巴細胞後，只須將所述淋巴細胞從固相上分離，即可容易地將所述淋巴細胞從有效成分等中分離出來，這樣可以防止有效成分對所述淋巴細胞的汙染。
當本發明有效成分固定到例如上述設備上，優選相對於待加入到所述設備的培養基的量，固定特定量的各有效成分，使得所得培養基與在所述培養基加入到所述設備時通過在培養基中溶解所述有效成分來使用所述有效成分的情況所需的濃度相比，具有類似的濃度比例。對固定的各有效成分的量沒有具體限制，只要獲得所需的效果即可。當上述有效成分固定到上述載體時，優選相對於待加入到所述設備的培養基的量，固定特定量的各有效成分，使得所得培養基與在所述載體加入到所述培養基時通過在培養基中溶解所述有效成分來使用所述有效成分的情況所需的濃度相比，具有類似的濃度比例。對固定的各有效成分的量沒有具體限制，只要獲得所需的效果即可。
例如，纖連蛋白片段的固定化可按照WO 97/18318和WO00/09168中介紹的方法來進行。
當測定通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞的IL-2R表達水平時，認為與通過在纖連蛋白、其片段或其混合物不存在下進行至少誘導、維持和擴增之任一項獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，IL-2R的表達水平顯著提高。在此，IL-2R的表達水平可通過已知方法測定，如用抗IL-2R抗體測定。
如上所述，通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞的IL-2R表達水平提高。IL-2R是一種在活化T細胞表面上表達的活化標記，隨著此分子的表達，細胞因子生產、細胞毒性活性、增殖活化等都被激活。因此，通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞是一組具有高度功能的細胞。
此外，由於通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞的IL-2R表達水平提高，所述細胞毒性淋巴細胞對加入到培養基中的IL-2、或細胞毒性淋巴細胞的前體細胞、淋巴細胞本身或其它共存的細胞產生的IL-2的刺激的敏感性提高。由於這個原因，即使在IL-2的量更少的環境中(例如在生物體中等)，細胞毒性淋巴細胞也可自我激活。
另外，與通過在纖連蛋白、其片段或其混合物不存在下進行至少誘導、維持和擴增之任一項獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，在通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞中，具有CD8標記的(CD8陽性)細胞的存在比率要高。這個事實帶來一些優點，例如，①CD8陽性細胞產生細胞因子如幹擾素-γ，從而促動免疫活化，以改變輔助T細胞的平衡成為Th1優勢體系，②CD8陽性細胞是能有效排除外來物質如病毒或腫瘤細胞的細胞免疫細胞，③當獲得了CD8陽性細胞時，只要CD8陽性細胞已用磁珠或流式細胞儀進行常規純化，CD8陽性細胞就可通過按照本發明方法培養細胞來富集，④在CTL的誘導過程中，細胞毒性淋巴細胞可合適地用作前體細胞，因為CD8陽性細胞的比率高，⑤甚至可培養CD8陽性細胞比率較低的細胞群體，以提高CD8陽性細胞的比率等等。因此，本發明方法非常適用於製備細胞毒性淋巴細胞。
在此，通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞中的CD8陽性細胞的比率可通過例如但不具體限於使用抗CD8抗體來測定。
此外，按照本發明方法製備的細胞毒性淋巴細胞尤其是CTL具有以下優越特性細胞毒性活性不象以前觀察到的那樣劇烈下降，甚至當細胞培養後進行長時間維持時或細胞增殖時也是如此。換句話說，與通過在纖連蛋白、其片段或其混合物不存在下進行至少誘導、維持和擴增之任一項獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，所述細胞毒性淋巴細胞維持高細胞毒性活性。因此，通過克隆培養的細胞毒性淋巴細胞，可以維持具有穩定細胞毒性活性的淋巴細胞。此外，誘導的CTL可通過用抗原、各種細胞因子或抗CD3抗體刺激CTL來增殖和擴增。可用已知方法維持或擴增細胞毒性淋巴細胞，但所述方法不受具體限制。
上述細胞毒性淋巴細胞的維持指通過保持其細胞毒性活性來維持細胞毒性淋巴細胞。對維持過程中的培養條件沒有具體限制，可採用一般的細胞培養所用的條件。例如，細胞可在5％CO2存在下在37℃等條件下培養。此外，可適當定時用新鮮培養基更換所用培養基。所用培養基及與其同時使用的其它組分等與上述的相同。
用本發明方法維持和擴增本發明細胞毒性淋巴細胞的一大特徵在於，所述方法包括在本發明有效成分即纖連蛋白、其片段或其混合物存在下，在培養基中分別連續培養和擴增細胞毒性淋巴細胞。隨著擴增，細胞毒性淋巴細胞的數量可增加，使得細胞毒性淋巴細胞所具有的細胞毒性活性得以維持。換句話說，本發明方法的一個實施方案是提供擴增細胞毒性淋巴細胞的方法。
在擴增本發明細胞毒性淋巴細胞的方法中，對培養條件沒有具體限制，可採用一般的細胞培養所用的條件。例如，細胞可在5％CO2存在下在37℃等條件下培養。此外，可適當定時用新鮮培養基更換所用培養基。所用培養基及與其同時使用的其它組分等與上述的相同。
根據本發明的擴增方法，例如在CTL擴增的情況中，擴增14天後獲得的CTL的細胞數量可增加100-1000倍。此外，作為LAK細胞擴增情況的一個實例，LAK細胞培養7天後獲得的細胞數量可增加約200倍，培養9天後可增加約1000倍。另外，這樣獲得的細胞毒性淋巴細胞尤其是CTL，與通過常規的細胞毒性淋巴細胞擴增方法(例如REM方法和改進的REM方法)獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，具有更高的細胞毒性活性。以上所述的本發明效果可通過按照下述實施例介紹的方法，測定用本發明方法擴增的CTL等所具有的細胞毒性活性來確認。
另外，本發明製備細胞毒性淋巴細胞的方法具有這樣的特色，即細胞的培養可在較低的細胞數量下開始。為進行過繼免疫療法，需要大量的淋巴細胞，但難以從患者體內獲得大量的淋巴細胞。此外，在一般的細胞毒性淋巴細胞擴增中，需要視待用的細胞數量而定選擇具有合適培養面積的細胞培養設備，需要在合適量的培養基中培養。換句話說，通常培養是在高密度條件下開始的，此條件下細胞數量(數目)與細胞培養設備的培養面積之比[即與培養基接觸的設備表面的面積(cm2)]為1×106細胞/cm2或更高，細胞濃度為1×106細胞/ml或更高。當在低於此細胞水平的條件下進行培養時，擴增率[擴增後的細胞數量與擴增前的細胞數量之比(擴增後的細胞數量/擴增前的細胞數量)]變得非常低，因而需要較長的培養時間才能獲得大量的細胞毒性淋巴細胞。因此，一般來說，目前通過例如以下方法製備大量的淋巴細胞用小的細胞培養設備開始培養，然後採用逐級擴大的大規模細胞培養設備；或採用增加細胞培養設備的數量和重複稀釋步驟的方法。如上所述，在普通的細胞毒性淋巴細胞擴增中，需要多個培養系統。
根據本發明方法，即使在用少量細胞開始培養時，不論細胞培養設備的尺寸如何，細胞也可以較高的擴增率進行培養。因此，諸如以上所述的更換細胞培養設備和稀釋步驟之類的複雜程序不再有必要。換句話說，根據本發明方法，細胞毒性淋巴細胞的擴增可滿意地通過使用一個細胞培養設備即一個培養系統的培養程序來進行。因此，本發明方法是排除了稀釋步驟或細胞培養設備的更換步驟的細胞毒性淋巴細胞製備方法。尤其當根據本發明方法擴增LAK細胞時，可如下擴增LAK細胞將能形成LAK細胞的細胞和培養基加入到大容量細胞培養設備中，以及在隨後各步驟中向細胞培養設備中只加入IL-2。在大量的LAK細胞可通過簡單程序獲得這方面，本發明非常有用。在此，從獲得更高的擴增率的觀點出發，纖連蛋白片段可優選用作待用的本發明有效成分。如上所述，根據本發明方法，可在更短的時間內獲得必需數量的細胞毒性淋巴細胞。
例如，當在本發明有效成分存在下，在含有培養基的細胞培養設備中以較低的細胞數量開始至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之任一項時，所述誘導、維持和擴增可通過在培養開始時使用滿足選自以下(a)和(b)的條件的細胞數量來進行(a)細胞數量與待用的細胞培養設備中的培養面積之比優選在1-5×105細胞/cm2，更優選10-1×105細胞/cm2，特別優選1×102-5×104細胞/cm2；(b)培養基中的細胞濃度優選在1-5×105細胞/ml，更優選10-1×105細胞/ml，特別優選1×102-5×104細胞/ml。
本文所用的細胞數量指細胞毒性淋巴細胞和/或前體細胞的數量。
此外，在本發明方法中，可舉出這樣的方法，所述方法包括在一個培養系統中進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之任一項，該方法排除了細胞培養設備的更換步驟或稀釋程序的步驟。
本發明方法用CTL的製備作為實例進行說明。
CTL的誘導可通過在上述有效成分的存在下在例如任何培養基中將能分化成CTL的前體細胞與合適的抗原呈遞細胞一起孵化(培養)來進行，以賦予CTL識別所需抗原的能力。對前體細胞沒有具體限制，只要所述前體細胞是處於變成CTL之前的階段且註定會分化成CTL的細胞，包括例如外周血單核細胞(PBMC)、原初細胞、記憶細胞、臍帶血單核細胞、造血幹細胞等。對抗原呈遞細胞沒有具體限制，只要該細胞具有呈遞待識別抗原到T細胞的能力。例如，據認為可呈遞所需的抗原的單核細胞、B細胞、T細胞、巨噬細胞、樹突細胞、成纖維細胞等可用於本發明中。
在本發明中，在CTL的製備過程中前體細胞等的培養條件可例如按照一般公知的條件進行設定[參見例如Carter J.等，Immunology 57(1)，123-129(1986)]。
此外，所述細胞可與合適的飼養細胞一起共培養。當CTL與飼養細胞共培養時，要求培養基適合CTL和飼養細胞的維持和生長。可用市售培養基作為培養基。
對用於本發明方法的飼養細胞沒有具體限制，只要所述飼養細胞與抗CD3抗體協同刺激CTL以激活T細胞受體。在本發明中，使用例如PBMC或用Epstein-Barr病毒轉化的B細胞(EBV-B細胞)。通常，飼養細胞在其增殖能力通過輻射等方式除去後使用。順便說明一下，培養基中飼養細胞的含量可按照已知條件進行確定。例如，所述含量優選為1×105-7細胞/ml。
在本發明特別優選的實施方案中，將非病毒感染的細胞如除EBV-B細胞以外的細胞用作飼養細胞。通過使用非病毒感染的細胞，可消除EBV-B細胞與擴增的CTL混合的可能性，從而有可能提高應用CTL的醫學治療如過繼免疫療法的安全性。
抗原呈遞細胞可通過將抗原肽加入到具有抗原呈遞能力的細胞來製備，從而使所述細胞能呈遞其表面上的抗原肽[參看例如BendnarekM.A.等，J.Immunol.147(12)，4047-4053(1991)]。此外，在具有抗原呈遞能力的細胞具有加工抗原的能力的情況中，將抗原加入到所述細胞，使得抗原被摻入細胞中並被加工，然後成片段的抗原肽在細胞表面上被呈遞。順便說明一下，當將抗原肽加入到具有抗原呈遞能力的細胞時，使用與所用的抗原呈遞細胞和待誘導的CTL的MHC限制相匹配的抗原肽。
順便說明一下，對用於本發明的抗原沒有具體限制，所述抗原包括例如外源抗原如細菌和病毒，內源抗原如腫瘤相關抗原(癌抗原)等。
在本發明中，優選使抗原呈遞細胞不能增殖。為使抗原呈遞細胞不能增殖，所述細胞可例如用X射線等輻射，或用藥物如絲裂黴素處理。
在本發明中，用以將能分化成CTL的前體細胞與抗原呈遞細胞在選自纖連蛋白、其片段或其混合物的有效成分存在下一起孵化(共培養)以誘導CTL的一般條件可以是已知條件[參見例如Bendnarek M.A.等，J.Immunol.，147(12)，4047-4053(1991)]。對共培養條件沒有具體限制，可以使用細胞培養通常所用的條件。例如，細胞可在5％CO2存在下在37℃等條件下培養。共培養通常進行約2-約15天，期間所述抗原呈遞細胞可用新鮮製備的抗原呈遞細胞更換，以進行再刺激。此外，所述培養基可適當定時用新鮮培養基更換。
通過本發明方法這樣獲得的CTL具有特異性地識別所需抗原的能力，例如通過其細胞毒性活性特異性地破壞攜有所述抗原的細胞。CTL的這種細胞毒性活性可通過已知方法進行評價。例如，CTL針對用放射性物質、螢光物質等標記的靶細胞的細胞毒性活性可通過測定歸屬CTL所破壞的靶細胞的放射性或螢光強度來評價。此外，可通過測定抗原特異性地從CTL或靶細胞釋放的細胞因子如GM-CSF或IFN-γ的量來進行檢測。除以上方法外，細胞毒性活性可通過使用其中的肽用螢光色素等標記的抗原肽-MHC複合體直接進行確認。在這種情況下，例如CTL與偶聯了CTL特異性抗原的第一種螢光標記接觸，然後與其中的肽偶聯了第二種螢光標記的抗原肽-MHC複合體接觸，通過FACS(螢光激活細胞分選)分析法檢測雙重標記細胞的存在，從而可以評價CTL的細胞毒性活性。
順便說明一下，對本發明擴增CTL的方法沒有具體限制，只要上述有效成分存在於所述方法中所用的培養系統中。本發明也包括這樣的實施方案，其中所述方法要在培養系統中存在上述有效成分，按與以上所述不同的CTL擴增常規方法來進行，即前體細胞等的培養在本發明有效成分存在下(例如將上述有效成分加入到待用於培養的培養基中)進行。
下面詳細說明培養LAK細胞的方法。
LAK細胞的培養是通過在上述有效成分存在下將能形成LAK細胞的細胞與IL-2一起孵化進行的。能形成LAK細胞的細胞包括但不具體限於例如外周血單核細胞(PBMC)、NK細胞、臍帶血單核細胞、造血幹細胞、含有這些細胞的血液組分等。
此外，培養LAK細胞的一般條件可按已知條件進行設定[例如參看Saibo Kogaku(Cell Technology)，14(2)，223-227(1995)；Saibo Baiyo(Cell Culture)17(6)，192-195(1991)；THE LANCET，356，802-807(2000)；Current Protocols in Immunology，supplement 17，UNIT 7.7]。對共培養條件沒有具體限制，可採用用於一般細胞培養的條件。例如，細胞可在5％CO2存在下在37℃等條件下培養。此共培養通常進行約2-約15天。此外，可適當定時用新鮮培養基更換所用培養基。
對於TIL，可按與上述CTL或LAK細胞的誘導、維持或擴增相同的方式，通過在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下培養細胞來製備具有高細胞毒性活性的一組細胞。在本發明中，對激活這些細胞的程序沒有具體限制，只要纖連蛋白、其片段或其混合物與所述細胞共存，且所述程序可用適合培養或激活上述細胞的培養基來進行。對於所用的纖連蛋白、其片段或其混合物的量，及加入組分等的方法，可按照上述方法進行合適的選擇。
根據上述的本發明製備細胞毒性淋巴細胞的方法，獲得這樣的細胞毒性淋巴細胞，其中細胞毒性活性維持在高水平，IL-2R的表達顯著提高以及CD8陽性細胞的比率提高，所述細胞毒性淋巴細胞適用於醫學中。因此，本發明方法的一個實施方案是進一步提供增強細胞毒性淋巴細胞的白細胞介素-2受體表達的方法，所述方法包括在本發明有效成分存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之任一項的步驟；提高細胞毒性淋巴細胞中CD8陽性細胞的比率的方法，所述方法包括在本發明有效成分存在下進行細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之任一項的步驟；以及提高或維持細胞毒性淋巴細胞中細胞毒性活性的方法，所述方法包括在本發明有效成分存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之任一項的步驟；本發明的另一實施方案是提供增強細胞表面上的IL-2R表達的藥物，所述藥物包括作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物。所述增強藥物包括有效成分本身以及進一步任選的其它成分，例如適合待激活細胞的培養基、蛋白質和細胞因子(優選IL-2)，及其它需要的組分。同時，包含上述增強藥物的培養基可用作用以增強細胞毒性淋巴細胞的IL-2R表達的培養基。上述培養基任選含有用於細胞培養的基本組分。在此，增強藥物和上述用以增強IL-2R表達的培養基可按照已知方法用本發明有效成分進行製備。對增強藥物或上述用以增強IL-2R表達的培養基中的本發明有效成分等的含量沒有具體限制，只要獲得本發明所需的效果即可。例如，所述含量可按照用於本發明方法的上述培養基中的有效成分等的含量按需進行適當的確定。此外，上述增強藥物可直接給予生物體，從而增強生物體內細胞上的IL-2R表達。
本發明的又一實施方案是提供用以提高培養的淋巴細胞群體中CD8陽性細胞的比率的藥物，其特徵是所述藥物包括作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物。所述比率提高藥物包括有效成分本身以及進一步任選的其它成分，例如適合待激活細胞的培養基、蛋白質和細胞因子(優選IL-2)，及其它需要的組分。同時，包含上述比率提高藥物的培養基可用作用以提高細胞毒性淋巴細胞中的CD8陽性細胞比率的培養基。上述培養基任選含有用於細胞培養的基本組分。上述培養基任選含有用於細胞培養的基本組分。在此，比率提高藥物和上述用以提高比率的培養基可按照已知方法用本發明有效成分進行製備。比率提高藥物或上述用以提高CD8陽性細胞比率的培養基中的本發明有效成分等的含量可按照與用於IL-2R表達等的上述藥物的情況同樣的方式按需進行適當的確定。此外，上述比率提高藥物可直接給予生物體，從而提高生物體內細胞毒性淋巴細胞的比率。
本發明的另一實施方案是提供提高或維持細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的藥物，其特徵是所述藥物包括作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物。所述提高或維持藥物包括有效成分本身以及進一步任選的其它成分，例如適合待激活細胞的培養基、蛋白質和細胞因子(優選IL-2)，及其它需要的組分。同時，包含上述提高或維持藥物的培養基可用作用以提高或維持細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的培養基。上述培養基任選含有用於細胞培養的基本組分。在此，提高或維持藥物和上述用以提高或維持的培養基可按照已知方法用本發明有效成分進行製備。對提高或維持藥物或上述用以提高或增強的培養基中的本發明有效成分等的含量沒有具體限制，只要獲得本發明所需的效果即可。例如，所述含量可按照用於本發明方法的上述培養基中的有效成分等的含量按需進行適當的確定。此外，上述提高或維持藥物可直接給予生物體，從而提高或增強生物體內細胞毒性淋巴細胞的活性。
另外，上述表達增強藥物、比率提高藥物和提高或維持細胞毒性活性的藥物可以為這樣形式，所述形式中各組分固定到合適的固相上，例如細胞培養設備如培養皿、培養瓶或培養袋(包括開放體系設備和密閉體系設備)，及細胞培養載體如珠粒、薄膜或載玻片。
通常，在通過使用上述製備細胞毒性淋巴細胞的方法獲得的含淋巴細胞培養物中，除細胞毒性淋巴細胞之外的細胞如輔助T細胞也混合在其中。但是，由於在通過本發明方法獲得的含淋巴細胞培養物中含有大量的具有細胞毒性活性的淋巴細胞，可通過離心等方式從培養物中收穫培養細胞，直接用作通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞。此外，如果上述有效成分等固定到細胞培養設備等中，就不存在組分等物質混入在所得細胞毒性淋巴細胞中的這樣的風險了。
此外，富含細胞毒性淋巴細胞的細胞群體(或培養物)可通過已知方法進一步從培養物中分離，直接用作本發明細胞毒性淋巴細胞。換句話說，製備通過本發明方法獲得的細胞毒性淋巴細胞的方法可包括從通過所述方法獲得的培養物中選擇富含細胞毒性淋巴細胞的細胞群體的步驟。
對選擇富含細胞毒性淋巴細胞的細胞群體的方法沒有具體限制。所述方法可由例如以下方法例示，該方法包括使用細胞培養設備或載體從培養物中選擇性地只收集需要的細胞，其中細胞培養設備或載體上結合有抗表達於需要的細胞表面上的細胞表面抗原的抗體(例如抗CD8抗體)，或使用流式細胞儀的方法例示。上述載體的實例有磁珠或柱子。此外，富含需要的細胞的細胞群體可通過從培養物中吸附除去需要的細胞之外的細胞來獲得。例如，可使用抗表達於輔助T細胞表面上的細胞表面抗原的抗體(如抗CD4抗體)將輔助T細胞從淋巴細胞培養物中除去。在此步驟中，也可使用流式細胞儀。這樣獲得的富含細胞毒性淋巴細胞的細胞群體與從培養物中非選擇性地收集的細胞群體相比，具有更強的細胞毒性活性，使得所述細胞群體可特別優選用於醫療領域中。
另外，本發明提供通過上述本發明製備細胞毒性淋巴細胞的方法獲得的細胞毒性淋巴細胞。所述淋巴細胞尤其是CTL具有高細胞毒性活性，其特點是即使當所述淋巴細胞長時間進行連續培養或擴增時，細胞毒性活性也幾乎不會降低。此外，本發明提供包含淋巴細胞作為有效成分的藥物(治療藥物)。尤其是，包含淋巴細胞的上述治療藥物適合用於過繼免疫療法。在過繼免疫療法中，適合於治療患者的具有細胞毒性活性的淋巴細胞可通過例如靜脈給藥方式給予患者。治療藥物可通過例如以下方法製備按照藥學領域公知的方法，將通過本發明方法製備的作為有效成分的淋巴細胞與例如適合非口服給藥的已知有機或無機載體、賦形劑、穩定劑等混合。順便說明一下，治療藥物的不同條件，如治療藥物中本發明的淋巴細胞的含量和治療藥物的劑量，可按照已知的過繼免疫療法進行適當的確定。
本發明製備細胞毒性淋巴細胞的方法可進一步包括將外源基因轉導到淋巴細胞的步驟。換句話說，本發明的一個實施方案提供製備細胞毒性淋巴細胞的方法，所述方法進一步包括將外源基因轉導到淋巴細胞的步驟。在此，術語「外源」指對於待轉導入基因的淋巴細胞而言，所述基因是外源的。
通過進行本發明製備細胞毒性淋巴細胞的方法，尤其是進行擴增細胞毒性淋巴細胞的方法，培養的淋巴細胞的DNA複製能力得到提高。因此，通過將轉導基因的步驟包括在本發明製備細胞毒性淋巴細胞的方法中，可預計在基因轉導方法中獲得DNA複製能力的提高。
對轉導外源基因的方法沒有具體限制，可從已知的轉導基因的方法中選擇合適的方法。轉導基因的步驟可在製備細胞毒性淋巴細胞過程中的任何給定點進行。例如，從工作效率的觀點出發，優選將該步驟與上述淋巴細胞的誘導、維持和/或擴增的任何步驟同時進行，或在這些步驟之後進行。
本發明可採用使用病毒載體的任何方法和不使用載體的方法作為上述轉導基因的方法。這些方法的詳細內容已在許多文獻中公開。
對上述病毒載體沒有具體限制，可使用在轉導基因的方法中一般應用的已知病毒載體，例如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、猿猴病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺病毒載體等。特別優選使用逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒或猿猴病毒作為病毒載體。優選使用那些缺乏複製能力而不能進行自我複製的病毒載體作為上述病毒載體。
出於基因治療等的目的使用逆轉錄病毒，是因為在待轉導入載體的細胞的染色體DNA中可穩定地摻入已插入到載體中的外源基因。因為所述載體在有絲分裂和增殖過程中對細胞的感染效率高，基因轉導優選在製備細胞毒性淋巴細胞的方法中進行，例如在擴增步驟中進行。
作為不使用病毒載體的轉導基因的方法，可採用但不具體限於例如使用載體如脂質體或配體-聚賴氨酸的方法、磷酸鈣方法、電穿孔方法、基因槍方法等。在這種情況下，外源基因被轉導摻入質粒DNA或線性DNA中。
對待轉導到本發明細胞毒性淋巴細胞中的外源基因沒有具體限制，可選擇需要轉導到上述細胞中的任意基因。作為上述基因，除編碼蛋白質(例如酶、細胞因子、受體等)的基因外，可使用例如編碼反義核酸或核酶的基因。此外，可同時轉導合適的能選擇轉導有基因的細胞的標記基因。
上述外源基因可例如插入到載體、質粒等，使得所述外源基因可在合適的啟動子控制下表達，以此加以使用。此外，為實現基因的有效轉錄，在載體中可存在與啟動子或轉錄起始位點協同作用的其它調節元件，例如增強子序列或終止子序列。此外，出於將外源基因插入到淋巴細胞(在其中外源基因通過同源重組轉導)的染色體的目的，例如外源基因可排列於側翼序列之間，所述側翼序列包括分別與位於染色體中需要的基因目標插入位點兩邊的核苷酸序列同源的核苷酸序列。待轉導的外源基因可以是天然基因或人工生產的基因，或者可以是在其中具有各不相同的來源的DNA分子通過已知方法如連接反應結合的外源基因。此外，所述外源基因可以是具有這樣一段序列的基因，根據該基因的目的，在所述序列中有變異被引入到天然序列中。
根據本發明方法，例如將編碼與用於治療癌症等患者的藥物的抗藥性有關的酶的基因轉導到細胞毒性淋巴細胞中，從而賦予所述淋巴細胞藥物抗性。如果使用上述細胞毒性淋巴細胞，可合併過繼免疫療法和藥物療法，從而可獲得更高的治療效果。藥物抗性基因的實例為例如廣譜抗藥基因。
另一方面，與上述實施方案相反，可將用以賦予對特定藥物的敏感性的基因轉導到細胞毒性淋巴細胞中，從而賦予對藥物的敏感性。在這種情況下，所述淋巴細胞被移植到生物體後，可通過給予藥物來除去。用以賦予對藥物的敏感性的基因的實例為例如胸苷激酶基因。
實施例以下通過實施例對本發明進行更具體的介紹，但這些實施例無論如何都不是對本發明範圍的限制。
製備實施例1纖連蛋白片段的製備(1)纖連蛋白片段的製備按照美國專利第5,198,423號介紹的方法，從大腸桿菌(Escherichia coli)HB101/pHD101(FERM BP-2264)製備衍自人纖連蛋白的片段H-271。
此外，按照上述專利公報介紹的方法，從通過培養大腸桿菌HB101/pHD102(FERM BP-7420)、大腸桿菌HB101/pCH101(FERMBP-2799)或大腸桿菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)獲得的培養物分別製備衍自人纖連蛋白的片段H-296、CH-271和CH-296。
按照美國專利第5,102,988號介紹的方法，從通過培養大腸桿菌JM109/pTF7221(FERM BP-1915)獲得的培養物製備衍自人纖連蛋白的片段C-274。
按照日本專利公報第3104178號介紹的方法，從通過培養大腸桿菌HB101/pCS25(FERM BP-5723)獲得的培養物製備衍自人纖連蛋白的片段C-CS1。
按照日本專利公報第2729712號介紹的方法，從通過培養大腸桿菌HB101/pCHV89(FERM P-12182)或大腸桿菌HB101/pCHV179(FERM P-12183)獲得的培養物製備衍自人纖連蛋白的片段CHV-89和CHV-179。
此外，按照日本專利公報第2729712號介紹的方法，製備衍自人纖連蛋白的片段CHV-90。具體而言，按照上述公報介紹的程序構建質粒pCHV90，然後培養攜有該質粒的轉化子，再從培養物中製備CHV-90。
可如下製備衍自人纖連蛋白的片段CHV-181按照WO 97/18318介紹的方法構建包含DNA編碼CHV-181的質粒(pCHV181)，然後培養已引入所述質粒的大腸桿菌HB101/pCHV181，再按與上述CHV-179相同的方式從培養物中製備片段。
(2)CHV-92的製備根據表達上述多肽CHV-181的質粒pCHV181，構建在編碼CHV-181的區域中缺失了編碼III-13區域的區域的質粒CHV92。缺失程序可按照日本專利公報第2729712號介紹的從質粒pCHV179中缺失III-14編碼區域的程序進行。
培養轉化有上述質粒pCHV92的大腸桿菌HB101(大腸桿菌HB101/pCHV92)，按照日本專利公報第2729712號介紹的純化CHV-89多肽的方法進行純化程序，從所得培養物中獲得純化的CHV-92製品。
(3)H-275-Cys的製備按照以下程序構建表達多肽H-275-Cys的質粒。具體而言，從大腸桿菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)製備質粒pCH102。以上述質粒為模板，用具有序列表的SEQ ID NO20所示的核苷酸序列的引物12S和具有序列表的SEQ ID NO21所示的核苷酸序列的引物14A進行PCR，得到長約0.8kb、編碼纖連蛋白的肝素結合多肽的DNA片段。所得DNA片段用NcoI和BamHI(均由Takara Bio Inc.生產)消化，然後用已用NcoI和BamHI消化的pTV118N(Takara Bio Inc.生產)連接，構建質粒pRH1。
用BamHI和HincII(Takara Bio Inc.生產)消化質粒載體pINIII-ompA1[Ghrayeb J.等，EMBO J.，3(10)，2437-2442(1984)]，以收集長約0.9kb、含有脂蛋白終止子區域的DNA片段。將此片段與上述已用BamHI和HincII消化的質粒pRH1混合及連接，得到按順序含有lac啟動子、編碼肝素結合多肽的DNA片段和脂蛋白終止子的質粒pRH1-T。
以此質粒pRH1-T為模板，用具有序列表的SEQ ID NO22所示的核苷酸序列的引物Cys-A和具有序列表的SEQ ID NO23所示的核苷酸序列的引物Cys-S進行PCR反應。然後，將收集到的擴增DNA片段用NotI(Takara Bio Inc.生產)消化，所述DNA片段進一步進行自身連接。將這樣獲得的環DNA用SpeI和ScaI(Takara Bio Inc.生產)消化，得到長約2.3kb的DNA片段，將所得片段與通過用SpeI和ScaI(TakaraBio Inc.生產)消化質粒pRH1-T獲得的2.5kb的DNA片段混合及連接，得到質粒pRH-Cys。此質粒編碼多肽H-275-Cys，其中四個胺基酸Met-Ala-Ala-Ser加到上述H-271的N末端，且還有Cys加到H-271的C末端。
多肽H-275-Cys通過以下方法製備。將轉化有上述質粒pRH-Cys的大腸桿菌HB101(大腸桿菌HB101/pRH-Cys)在120ml的LB培養基中在37℃下培養過夜。將從培養基中收集的細胞懸浮於40ml破裂緩衝液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl、1mM DTT、1mMPMSF，pH 7.5)，超聲處理所述懸浮液以使細胞破裂。將離心獲得的上清液加到已用純化緩衝液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)平衡的HiTrap-肝素柱(Pharmacia生產)。將柱中的非吸收部分用同一緩衝液洗滌，然後用具有0-1M NaCl濃度梯度的純化緩衝液進行洗脫。洗脫液用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，收集對應於H-275-Cys分子量的部分，得到純化的H-275-Cys製品。
實施例1 CTL中CD8陽性細胞的比率(1)PBMC的分離和儲存經知情同意，從具有HLA-A2.1的人類正常個體供血者收集血液組分。將收集到的血液組分用PBS(-)稀釋兩倍，加載到Ficoll-paque(Pharmacia生產)，在500×g離心20分鐘。用吸液管收集中間層的外周血單核細胞(PBMC)並洗滌。將收集的PBMC懸浮於90％FBS(Bio Whittaker生產)/10％ DMSO(SIGMA生產)的貯存液中並在液氮中保藏。在CTL誘導過程中，這些儲藏PBMC在37℃水浴中快速融化，並用含有10μg/ml DNA酶(Calbiochem生產)的RPMI 1640培養基(Bio Whittaker生產)洗滌。然後，用臺盼藍染色法計算活細胞數量，將所述細胞用於各個實驗中。
(2)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導通過部分改進Bednarek等的方法[J.Immunology，147(12)，4047-4053(1991)]來進行。具體而言，將實施例的(1)項中製備的PBMC懸浮於含有5％人AB型血清、0.1mM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、2mM L-穀氨醯胺(以上均由Bio Whittaker生產)、10mM HEPES(nakalai tesque生產)、1％鏈黴素-青黴素(Gibco BRL生產)的RPMI 1640培養基(Bio Whittaker生產)(以下簡稱「5HRPMI」)中，以使細胞濃度為1-4×106細胞/ml。然後，將懸浮液以1ml/孔的體積加入到24孔細胞培養板(Falcon生產)上，在37℃的5％CO2溼型培養箱中孵化細胞1.5小時，以分離塑料粘附性單核細胞。然後，用RPMI1640培養基收集非粘附細胞，保藏於冰上作為反應細胞。向分離的單核細胞各加入0.5ml的5HRPMI，其中含有5μg/ml作為抗原肽的衍自流感病毒蛋白的表位肽(衍自序列表的SEQ ID NO24的基質蛋白的A2.1-結合肽)和1μg/ml β2微珠蛋白(Scrips生產)。將所得混合物在室溫下孵化2小時，然後用X射線輻射(5500R)處理細胞，得到抗原呈遞細胞。從各孔中吸去肽溶液，用RPMI 1640培養基洗滌各孔。然後，將原先儲藏在冰上的反應細胞吸入到5HRPMI，使細胞濃度為0.5-2×106細胞/ml。將所得懸浮液以每孔1ml的量加入到抗原呈遞細胞。此時，加入製備實施例1中介紹的各纖連蛋白片段(以下稱「FNfr」)，使其終濃度為10μg/ml。將不加FNfr的組留作對照組。將培養板在5％CO2存在下和37℃下培養。從培養開始起的第二天，向各孔中加入1ml含60U/ml IL-2(Shionogi Co.，Ltd生產)和10μg/ml FNfr的5HRPMI(對照組只含IL-2)。而在第五天，除去一半的培養上清液，各加入1ml與上述相同的含IL-2和FNfr的培養基(對照組只含IL-2)。在第七天，按與上述相同的方式製備抗原呈遞細胞，然後將已培養一周的反應細胞懸浮於5HRPMI，使細胞濃度為0.5-2×106細胞/ml。將所得懸浮液以1ml/孔的量分別加入到製備的抗原呈遞細胞中，以再次刺激細胞。此時，加入FNfr使其終濃度為10μg/ml(對照組不加入)。自再次刺激起第二天，向各孔中加入1ml含60U/ml IL-2和10μg/ml FNfr的5HRPMI(對照組只含IL-2)。而在第五天，除去一半的培養上清液，各加入1ml與除去上清前的培養基含量相同的培養基。再繼續培養2天，以誘導CTL。
(3)CTL的細胞毒性活性的測定實施例1的(2)項製備的CTL在誘導開始後第十四天的細胞毒性活性可通過使用鈣螢光素-AM的細胞毒性活性測定方法[R.Lichtenfels等，J.Immunological Methods，172(2)，227-239(1994)]進行評價。將與表位肽一起或在表位肽不存在下培養過夜的具有HLA-A2.1、EBV轉化的B細胞(細胞名稱221A2.1)懸浮於含5％FBS(BioWhittaker生產)的RPMI 1640培養基，使細胞濃度為1×106細胞/ml。然後將鈣螢光素-AM(Dotite生產)加入到所得懸浮液中，使其終濃度為25μM，再將細胞在37℃下培養1小時。所述細胞用不含鈣螢光素-AM的培養基洗滌，然後與20倍量的K562細胞(ATCC CCL-243)混合，得到鈣螢光素標記的靶細胞。K562細胞用來排除混合在反應細胞中的NK細胞的非特異性細胞毒性活性。
用5HRPMI逐步稀釋實施例1的(2)項製備的記憶CTL，使細胞濃度為1×105-9×106細胞/ml，用作效應細胞。然後，將各稀釋液以100μl/孔的量傾入96孔細胞培養板的各孔中。以100μl/孔的量向各孔加入製備得到的濃度為1×105細胞/ml的鈣螢光素標記靶細胞。將含有上述細胞懸浮液的培養板在400×g離心1分鐘，然後在溼型CO2培養箱中37℃孵化4小時。4小時後，從各孔收集100μl培養上清液，用螢光板讀數器(485nm/538nm)測定釋放到培養上清液的鈣螢光素的量(螢光強度)。CTL的細胞毒性活性可用以下公式1計算公式1細胞毒性活性(％)＝[(各孔測定值-最小釋放量)/(最大釋放量-最小釋放量)]×100在以上公式中，最小釋放量為在只含有靶細胞和K562細胞的孔中釋放的鈣螢光素的量，表示從靶細胞自然釋放的鈣螢光素的量。此外，最大釋放量指當通過向靶細胞加入0.1％表面活性劑Triton X-100(nakalai tesque生產)來完全破壞細胞時所釋放的鈣螢光素的量。結果，在誘導後立即有細胞毒性活性被誘導，但在誘導過程中添加或不添加FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(4)CTL細胞群體中CD8陽性細胞的含量比率的測定實施例1的(2)項製備的量為2×105個細胞的CTL用含1％低聚甲醛(nakalai tesque生產)的PBS(Nissui生產)固定，然後用PBS洗滌。將固定細胞懸浮於100μl含1％BSA(SIGMA生產)的PBS，加入FITC標記的鼠IgGl或FITC標記的鼠抗人CD8抗體(兩者均由DAKO生產)，然後將所得混合物在冰上孵化30分鐘。孵化後，用PBS洗滌細胞，然後再懸浮於含1％低聚甲醛的PBS。用FACSVantage(Becton Dickinson生產)對細胞進行流式細胞術計數，測定CD8陽性細胞的含量比率。結果在表1顯示。
表1

如表1所示，在CTL誘導過程中添加各種纖連蛋白片段的組與不添加這些纖連蛋白片段的對照組相比，CTL誘導開始後第十四天的CD8陽性細胞的比率高。換句話說，現清楚CTL在纖連蛋白片段的共存下可被誘導並顯著增殖CD8陽性細胞。
實施例2 白細胞介素-2受體表達的誘導(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)CTL中白細胞介素-2受體表達比率的測定實施例2的(1)項製備的CTL在誘導開始後第十四天的白細胞介素-2受體(IL-2R)表達比率按照實施例1的(4)項介紹的方法進行測定。在此，在本程序中，FITC標記的小鼠抗人CD8抗體改變為FITC標記的小鼠抗人IL-2R(CD25)抗體(DAKO生產)。結果在表2顯示。
表2

如表2所示，在所有添加各種纖連蛋白片段誘導的CTL中，觀察到細胞群體中IL-2R表達的比率提高。換句話說，現清楚在纖連蛋白片段的共存下進行誘導時，CTL可被誘導並提高IL-2R的表達水平。
實施例3 CTL的擴增(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)CTL的擴增用5HRPMI洗滌實施例3的(1)項製備的CTL，然後製成細胞濃度為3×104細胞/ml的懸浮液。另一方面，對按與實施例1的(1)項相同的方式收集的不含有HLA-A2.1的同種異體PBMC進行X射線輻射(3300R)，用培養基洗滌細胞，然後製成細胞濃度為2-5×106細胞/ml的懸浮液。將這些CTL(3×104細胞)和同種異體PBMC(4-10×106細胞)懸浮於10ml的5HRPMI或含以下成分的RPMI 1640培養基(BioWhittaker生產)10％Hyclone FBS、0.1mM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、2mM L穀氨醯胺(均由Bio Whittaker生產)、10mM HEPES(nakalai tesque生產)和1％鏈黴素-青黴素(Gibco BRL生產)(以下簡稱10HycloneRPMI)，再加入抗CD3抗體(Janssen-Kyowa生產)，使終濃度為50ng/ml。將所得混合物裝入12.5cm2培養瓶(Falcon生產)，在溼型CO2培養箱中37℃培養細胞14天。培養過程中，添加FNfr，使終濃度為10μg/ml，與CTL誘導過程中的添加FNfr所得濃度相同。同時，對不添加FNfr進行誘導的對照組，則不添加FNfr。在此培養過程中，完全不進行肽刺激。在擴增開始後第一天，添加IL-2，使終濃度為120U/ml。另外，在培養開始後第四天及以後每隔1-2天，進行以下程序除去一半的培養上清液，然後向各培養瓶中加入5ml含60U/ml IL-2的5HRPMI或10HycloneRPMI。在培養過程中，將FNfr以相同的濃度添加到需添加FNfr的組的培養基中。在擴增開始後第十四天，按實施例1的(3)項相同的方式測定CTL的細胞毒性活性。維持擴增前的細胞毒性活性的程度以「細胞毒性活性維持率(％)」進行計算。
「細胞毒性活性維持率(％)」按以下方程式2進行計算方程式2「細胞毒性活性維持率(％)」＝[擴增後細胞毒性活性(％)/擴增前細胞毒性活性(％)]×100
測定結果在表3顯示。在表中，E/T比率指效應細胞(E)數量與靶細胞(T)數量的比率。
表3

如表3所示，在誘導和擴增過程中添加各種纖連蛋白片段的組與與不添加纖連蛋白片段的對照組相比，其CTL即使在擴增14天後也能維持特異性的高細胞毒性活性。換句話說，現清楚通過在纖連蛋白片段共存下進行誘導和擴增，CTL可在高細胞毒性活性得以長時間維持的狀態下進行擴增。
實施例4 CTL擴增後細胞群體中IL-2R的表達(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)擴增的CTL中白細胞介素-2受體表達比率的測定按與實施例3的(2)項相同的方式擴增實施例4的(1)項中製備的CTL。按與實施例2的(2)項相同的方式測定擴增後獲得的CTL中IL-2R表達陽性細胞的比率。結果在表4顯示。
表4

如表4所示，在CTL誘導和擴增過程中添加各種纖連蛋白片段的所有組中，觀察到細胞群體中IL-2R表達細胞的比率提高。
換句話說，現清楚通過在纖連蛋白片段存在下進行誘導和擴增，CTL可被擴增並提高IL-2R的表達水平。
實施例5 在纖連蛋白存在下CTL的誘導和擴增(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按照實施例1的(1)項介紹的方法分離和儲藏的PBMC，按照實施例1的(2)項介紹的方法進行。在誘導過程中，添加纖連蛋白(Calbiochem生產)而不是FNfr，使終濃度為10μg/ml(對照組不添加)。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行測定。結果，在誘導過程中添加或不添加纖連蛋白得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)CTL中白細胞介素-2受體表達比率的測定按與實施例2的(2)項相同的方式測定實施例5的(1)項製備的CTL中IL-2R表達陽性細胞的比率。結果在表5顯示。
表5

如表5所示，在纖連蛋白存在下誘導的CTL中，觀察到細胞群體中IL-2R表達細胞的比率提高。
換句話說，現清楚通過在纖連蛋白存在下進行CTL的誘導，CTL可被誘導並提高IL-2R的表達水平。
(3)CTL的擴增實施例5的(1)項製備的CTL按與實施例3的(2)項相同的方式進行擴增。在擴增過程中，向需在誘導過程中添加纖連蛋白的組添加纖連蛋白(Calbiochem生產)，使終濃度為10μg/ml(對照組不添加)。所獲得的CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行測定，維持擴增前的細胞毒性活性的程度以「細胞毒性活性維持率(％)」進行計算。
測定結果在表6顯示。
表6

如表6所示，CTL的誘導和擴增在纖連蛋白存在下進行的組維持著高細胞毒性活性。相反，在CTL的誘導和擴增過程中不添加纖連蛋白的對照組的細胞毒性活性明顯降低。換句話說，現清楚通過在CTL的誘導和擴增過程中添加纖連蛋白，CTL可在特異性細胞毒性活性得以長時間維持的狀態下進行擴增。
實施例6 CTL在固定化纖連蛋白(FN)片段存在下的擴增(1)FN片段的固定化將纖連蛋白片段固定到用於以下實驗的培養設備(容器)。具體而言，含有各種纖連蛋白片段(終濃度10μg/ml)的PBS以1-2ml的量分別加入到24孔細胞培養板和12.5cm2培養瓶中。將所述細胞培養板和培養瓶在室溫下孵化5小時，然後在4℃下保存備用。此外，所述細胞培養板和培養瓶在使用前用PBS洗滌兩次。
(2)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按照實施例1的(1)項介紹的方法分離和儲藏的PBMC，按照實施例1的(2)項介紹的方法進行。在誘導過程中，將固定有FNfr的培養板用作培養設備(對照組用不經固定化處理的培養板)。誘導後CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，不管在誘導過程中所用培養板是否固定有FNfr，細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(3)CTL的擴增實施例6的(2)項製備的CTL按與實施例3的(2)項相同的方式進行擴增。在擴增過程中，固定有各種FNfr的培養瓶用作培養設備(對照組用不經固定化處理的培養瓶)。此外，用10HycloneRPMI作為培養基。
這樣擴增的CTL與擴增前相比維持其細胞毒性活性的程度以「細胞毒性活性維持率(％)」進行評價。
測定結果在表7顯示。
表7

如表7所示，在CTL的誘導和擴增過程中使用固定有纖連蛋白片段的培養設備(培養板、培養瓶)的組中，CTL即使在擴增後也維持著特異性的高細胞毒性活性。相反，在CTL的誘導和擴增過程中使用不固定有纖連蛋白片段的培養設備的對照組，其細胞毒性活性明顯降低。換句話說，現清楚通過使用固定化纖連蛋白片段，CTL可在高細胞毒性活性得以長時間維持的狀態下進行擴增，結果與使用溶於培養基中的片段的結果相近。
實施例7 CTL擴增後細胞群體中CD8陽性細胞的含量比率(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)擴增的CTL中CD8陽性細胞含量比率的測定按與實施例3的(2)項相同的方式擴增實施例7的(1)項中製備的CTL。按與實施例1的(4)項相同的方式測定擴增後獲得的CTL中CD8陽性細胞的含量比率。結果在表8顯示。
表8

如表8所示，在CTL誘導和擴增過程中添加各種纖連蛋白片段的所有組中，觀察到擴增後的細胞群體中CD8陽性細胞的含量比率提高。
換句話說，現清楚通過在纖連蛋白片段存在下進行CTL誘導和擴增，CTL可被擴增並顯著增殖CD8陽性細胞。
實施例8 在固定化纖連蛋白片段存在下誘導的CTL中白細胞介素-2 受體表達的誘導(1)FN片段的固定化按與實施例6的(1)項相同的方式將纖連蛋白片段固定到培養設備(容器)。
(2)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按照實施例1的(1)項介紹的方法分離和儲藏的PBMC，按照實施例1的(2)項介紹的方法進行。在誘導過程中，將實施例8的(1)項製備的固定有FNfr的培養板用作培養設備(對照組用未經固定化處理的培養板)。誘導後CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，不管在誘導過程中所用培養板是否固定有FNfr，細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(3)CTL的擴增實施例8的(2)項製備的CTL按與實施例3的(2)項相同的方式進行擴增。在擴增過程中，實施例8的(1)項製備的固定有FNfr的培養瓶用作培養設備(對照組用不經固定化處理的培養瓶)。此外，用10HycloneRPMI作為培養基。
擴增前的CTL中和擴增後獲得的CTL中IL-2R表達陽性細胞的比率按與實施例2的(2)項相同的方式進行測定。
測定結果在表9顯示。
表9

如表9所示，在CTL的誘導和擴增過程中使用固定有纖連蛋白片段的培養設備(培養板、培養瓶)的組與對照組相比，在擴增前和擴增後都觀察到CTL中IL-2R表達比率提高。換句話說，現清楚通過使用固定化纖連蛋白片段，CTL可被擴增並維持高IL-2R表達水平，結果與使用溶於培養基中的片段的結果相近。
實施例9 CD8細胞表面上白細胞介素受體表達的誘導(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)CTL中白細胞介素-2受體表達比率的測定實施例9的(1)項製備的CTL(尤其是CD8細胞表面上)在誘導開始起第十四天的白細胞介素-2受體(IL-2R)表達比率按照實施例1的(4)項介紹的方法進行測定。在此，在本程序中，FITC標記的小鼠抗人CD8抗體用作第一抗體，PE標記的小鼠抗人IL-2R(CD25)抗體(DAKO生產)用作第二抗體。結果在表10顯示。
表10

如表10所示，在添加各種纖連蛋白片段誘導的CTL中，觀察到CD8陽性細胞群體中IL-2R表達比率提高。換句話說，現清楚通過在纖連蛋白片段共存下進行誘導，CTL可被誘導且提高CD8細胞表面上的IL-2R表達水平。
實施例10 CTL擴增前後細胞群體中CD8陽性細胞的含量比率(纖連蛋白與纖連蛋白片段的比較)(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加纖連蛋白和FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)擴增的CTL中CD8陽性細胞含量比率的測定按與實施例3的(2)項相同的方式擴增實施例10的(1)項中製備的CTL。按與實施例1的(4)項相同的方式測定擴增前的CTL中和擴增後獲得的CTL中CD8陽性細胞的含量比率。結果在表11顯示。
表11

如表11所示，在CTL誘導和擴增過程中添加各種纖連蛋白片段的所有組與對照組相比，觀察到擴增前和擴增後的細胞群體中CD8陽性細胞的含量比率提高。
換句話說，現清楚與只存在纖連蛋白本身的結果相比，通過在纖連蛋白片段存在下進行CTL誘導和擴增，CTL可有利地得以擴增，且擴增前和擴增後CD8陽性細胞都顯著增殖。
實施例11 CTL擴增前後細胞群體中IL-2R表達的誘導(纖連蛋白與纖連蛋白片段的比較)(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加纖連蛋白和FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)擴增的CTL中IL-2R表達陽性細胞含量比率的測定按與實施例3的(2)項相同的方式擴增實施例11的(1)項中製備的CTL。按與實施例2的(2)項相同的方式測定擴增前的CTL中和擴增後獲得的CTL中IL-2R表達陽性細胞的含量比率。結果在表12顯示。
表12

如表12所示，在CTL誘導和擴增過程中添加纖連蛋白片段的所有組與對照組相比，觀察到擴增前和擴增後的細胞群體中IL-2R表達陽性細胞的含量比率提高。與添加纖連蛋白的組相比，此提高率顯著地高。
換句話說，現清楚與只存在纖連蛋白本身的結果相比，通過在纖連蛋白片段存在下進行CTL誘導和擴增，CTL可有利地得以擴增，且擴增前和擴增後IL-2R表達陽性細胞都顯著增殖。
實施例12 CTL的擴增(纖連蛋白與纖連蛋白片段的比較)(1)抗流感病毒記憶CTL的誘導抗流感病毒記憶CTL的誘導用按與實施例1的(1)項相同的方式分離和儲藏的PBMC，按與實施例1的(2)項相同的方式進行。誘導開始後第十四天CTL的細胞毒性活性按與實施例1的(3)項相同的方式進行評價。結果，在誘導過程中添加或不添加纖連蛋白和FNfr得到的細胞毒性活性幾乎沒有任何差別。
(2)CTL的擴增實施例12的(2)項製備的CTL按與實施例3的(2)項相同的方式進行擴增。此外，用10HycloneRPMI作為培養基。
這樣擴增的CTL與擴增前相比維持其細胞毒性活性的程度以「細胞毒性活性維持率(％)」進行評價。
測定結果在表13顯示。
表13

如表13所示，在誘導和擴增過程中添加纖連蛋白片段的組與不添加纖連蛋白片段的對照組相比，其CTL即使在擴增14天後也維持著特異性的高細胞毒性活性。同時，與添加纖連蛋白的組相比，其活性顯著地高。
換句話說，現清楚與只共存纖連蛋白本身的結果相比，通過在纖連蛋白片段共存下進行誘導和擴增，CTL可在高細胞毒性活性得以長時間維持的狀態下進行有利的擴增。
實施例13 LAK細胞(淋巴因子激活的殺傷細胞)培養系統中擴增倍數的測定(1)抗人CD3抗體和FN或FN片段的固定化將抗人CD3抗體和纖連蛋白或FN片段固定到用於以下實驗的培養設備(容器)。具體而言，向24孔細胞培養板或12.5cm2細胞培養培養瓶(Falcon生產)中各加入1ml(24孔板的情況下)或2ml(12.5cm2培養瓶的情況下)含抗人CD3抗體(Jassen-Kyowa生產)(終濃度為5μg/ml)的PBS。在加入過程中，將纖連蛋白或製備實施例1中所列的各纖連蛋白片段(FNfr)加入到需添加纖連蛋白或FN片段的組中，使終濃度為10μg/ml(24孔板的情況下)或25μg/ml(12.5cm2培養瓶的情況下)。還留出不添加纖連蛋白和FNfr的組作為對照組。
這些培養設備在室溫下孵化5小時後，將其在4℃下保存備用。使用前，從這些培養設備中吸去含抗體和FNfr的PBS。然後各孔用PBS洗滌兩次，再用含5％人AB型血清(Bio Whittaker生產)和1％鏈黴素-青黴素(GIBCO BRL生產)的XVIVO20培養基(Bio Whittaker生產)(以下簡稱5HXVIVO20)洗滌一次。所述培養設備用於各個實驗。
(2)LAK細胞的誘導和培養將在實施例1的(1)項中製備的PBMC懸浮於5HXVIVO20，使細胞濃度為0.5-1×106細胞/ml，然後將所得懸浮液以1ml/孔的量加入到實施例13的(1)項製備的固定有抗人CD3抗體的培養板或固定有抗人CD3抗體和纖連蛋白或FNfr的培養板，再加入IL-2(Shionogi Co.，Ltd生產)，使終濃度為1000U/ml。將這些培養板在5％CO2和37℃下培養(培養的第零天)。在培養開始起第二和第三天，以1ml/孔的量加入含1000U/ml IL-2的5HXVIVO20。在培養開始起第四天，將用5HXVIVO20適當稀釋的培養基轉移到不固定任何東西的新培養瓶中，加入IL-2，使終濃度為500U/ml。繼續進行培養，按與培養開始起第五天相同的方式每隔1-2天用5HXVIVO20適當稀釋培養基，加入IL-2，使終濃度為300-500U/ml。在培養開始起第七至第十五天，用臺盼藍染色法計算活細胞數量，通過將所得數量與培養開始時的細胞數量相比計算為擴增倍數。結果在表14表示。
表14

如表14所示，在LAK細胞誘導的早期使用固定有各纖連蛋白片段的培養設備的組與對照組相比，其LAK細胞的擴增倍數高。此外，在培養開始起第十五天，固定有各纖連蛋白片段的組與使用固定有纖連蛋白的培養設備的組相比，其擴增倍數更高。因此，現清楚在進行長時間擴增的情況下，與使用纖連蛋白本身相比，通過在LAK細胞誘導的早期共存纖連蛋白片段，可適當地以更高的擴增倍數進行LAK細胞的誘導和擴增。
實施例14 LAK細胞培養系統中增殖比率的測定(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例13的(2)項相同的方式進行。計算此階段自培養開始起第四天至第七天的細胞增殖比率。結果在表15顯示。
表15

如表15所示，在LAK細胞誘導的早期使用固定有各纖連蛋白片段的培養設備的組與對照組相比，其自培養開始起第四天至第七天的LAK細胞增殖比率高。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導的早期共存纖連蛋白片段，可以更快的擴增速率誘導和培養LAK細胞。
實施例15 LAK細胞培養系統中擴增倍數的測定(從低細胞數量誘導和培養LAK細胞)(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例13的(2)項相同的方式進行。在此階段中，調整培養開始時的細胞濃度至2×105-1×106細胞/ml(1×105-5×105細胞/cm2)。在自培養開始起的第十五天，用臺盼藍染色法計算活細胞數量，通過與培養開始時的細胞數量比較計算擴增倍數。結果在表16顯示。
表16

如表16所示，在LAK細胞誘導過程中使用固定有各纖連蛋白片段的培養設備的組，不管其培養開始時細胞數量如何，在自培養開始起的第十五天獲得了高擴增倍數。相反，在對照組中，當培養開始時的細胞數量低時，自培養開始起的第十五天的擴增倍數也低。換句話說，現清楚不管培養開始時的細胞數量如何，通過在LAK細胞誘導過程中共存纖連蛋白片段，可以高的擴增倍數從低細胞數量出發誘導和培養LAK細胞。
實施例16 LAK細胞培養系統中擴增倍數的測定(從低細胞數量誘導和培養LAK細胞/不用稀釋程序的培養)(1)LAK細胞的誘導和培養將實施例1的(1)項製備的PBMC懸浮於5HXVIVO20，使細胞濃度為1×104細胞/ml，然後以1ml/孔的量將所得懸浮液加入到按與實施例13的(1)項相同的方式製備的固定有抗人CD3抗體的培養板或固定有抗人CD3抗體和纖連蛋白或FNfr的6孔培養板中。加入4毫升5HXVIVO20(1×103細胞/cm2)，再加入IL-2(Shionogi Co.，Ltd.生產)，使終濃度為500U/ml。將這些培養板在5％CO2和37℃下培養(培養的第零天)。在培養開始起第二、第三和第四天，加入IL-2，使終濃度為500U/ml。繼續進行培養，自培養開始起第七天及以後，每隔1-2天加入IL-2，使終濃度為500U/ml。在加入過程中，完全不進行培養基的稀釋程序。
自培養開始起第十五天，用臺盼藍染色法計算活細胞數量，通過與培養開始時的細胞數量比較計算擴增倍數。結果在表17顯示。
表17

如表17所示，在從低細胞數量出發進行的LAK細胞誘導過程中使用固定有各纖連蛋白片段的培養設備的組，在誘導的整個過程中不需要進行細胞的稀釋程序，在自培養開始起的第十五天也獲得高擴增倍數。而且，即使與使用固定有纖連蛋白的培養設備的組相比，此擴增倍數也高。相反，在對照組中，就算在自培養開始起的第十五天，細胞也幾乎不擴增。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導過程中共存纖連蛋白或纖連蛋白片段(優選纖連蛋白片段)，完全不需要進行稀釋程序，也可以高的擴增倍數從低細胞數量出發誘導和培養LAK細胞。
實施例17 LAK細胞中IL-2R表達的誘導(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例13的(2)項相同的方式進行。
(2)LAK細胞中IL-2R表達比率的測定在實施例17的(1)項中進行誘導和培養的LAK細胞中IL-2R表達的比率按實施例2的(2)項中介紹的方法進行測定。結果在表18顯示。在該表中，IL-2R表達陽性細胞的含量比率(％)表示為IL-2R表達比率(％)。
表18

如表18所示，在LAK細胞誘導的早期使用固定有各纖連蛋白片段的培養設備的組中，培養過程中在LAK細胞表面獲得高IL-2R表達比率。而且，即使與使用固定有纖連蛋白的培養設備的組相比，此IL-2R表達比率也高。換句話說，現清楚與只共存纖連蛋白本身的結果相比，通過在LAK細胞誘導過程中共存纖連蛋白片段，LAK細胞可被誘導和培養，且IL-2R表達比率有利地更高。
實施例18 LAK細胞中IL-2R表達的誘導(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例13的(2)項相同的方式進行。
(2)LAK細胞中IL-2R表達比率的測定在實施例18的(1)項中誘導和培養的LAK細胞中的CD4細胞和CD8細胞，在第七天其表面上的IL-2R表達比率按實施例9的(2)項介紹的方法進行測定。在此，在本程序中，FITC標記的小鼠抗人CD4抗體或FITC標記的小鼠抗人CD8抗體用作第一抗體，PE標記的小鼠抗人IL-2R(CD25)抗體用作第二抗體。結果在表19顯示。
表19

如表19所示，在LAK細胞誘導的早期使用固定有各纖連蛋白片段的培養設備的組中，培養過程中在LAK細胞(CD4陽性和CD8陽性細胞)表面可誘導高IL-2R表達比率。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導過程中共存纖連蛋白片段，LAK細胞可被誘導和培養，且CD4陽性和CD8陽性細胞的表面上IL-2R表達比率高。
實施例19 LAK細胞群體中CD8陽性細胞的含量比率(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例13的(2)項相同的方式進行。
(2)LAK細胞中CD8陽性細胞群體含量比率的測定在實施例19的(1)項誘導和培養的LAK細胞中，第十五天CD8陽性細胞的含量比率按實施例1的(4)項介紹的方法進行測定。結果在表20顯示。
表20

如表20所示，在LAK細胞誘導的早期使用固定有各纖連蛋白片段的培養設備的組中，培養過程中在LAK細胞當中可誘導高含量比率的CD8陽性細胞。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導過程中共存纖連蛋白片段，LAK細胞可被誘導和培養，且LAK細胞當中CD8陽性細胞的含量比率高。
實施例21 LAK細胞培養系統中擴增倍數的測定(1)LAK細胞的誘導和培養將實施例1的(1)項製備的PBMC懸浮於5HXVIVO20，使細胞濃度為0.5-1×106細胞/ml，然後以1ml/孔的量將所得懸浮液加入到實施例13的(1)項製備的固定有抗人CD3抗體的培養板或固定有抗人CD3抗體和FNfr的培養板中。加入IL-2(Shionogi Co.，Ltd.生產)，使終濃度為1000U/ml。將這些培養板在5％CO2和37℃下培養(培養的第零天)。在培養開始起第二和第三天，以1ml/孔的量加入含1000U/mlIL-2的5HXVIVO20。在培養開始起第四天，將用5HXVIVO20適當稀釋的培養基轉移到不固定任何東西的新培養瓶中，加入IL-2，使終濃度為500U/ml。在培養開始起第八或第九天，將用5HXVIVO20適當稀釋的培養基轉移到按與實施例13的(1)項相同的方式製備的固定有抗人CD3抗體的培養瓶中，或固定有抗人CD3抗體和FNfr的培養瓶中(條件是固定化所用的抗人CD3抗體的濃度為0.5μg/ml)，加入IL-2，使其終濃度為500U/ml。在培養開始起第十一或第十二天，將用5HXVIVO20適當稀釋的培養基轉移到不固定任何東西的新培養瓶中，加入IL-2，使終濃度為500U/ml。在培養開始起第十五天，用臺盼藍染色法計算活細胞數量，通過與培養開始時的細胞數量比較計算擴增倍數。結果在表21和22顯示。表中「供體」指PBMC供體。
表21

表22

如表21和22所示，在LAK細胞誘導的早期和中期使用反覆固定各纖連蛋白片段和抗CD3抗體的培養設備的組，其與對照組相比LAK細胞的擴增倍數高。這些擴增比率遠高於在LAK細胞誘導的早期和中期使用只反覆固定抗CD3抗體的培養設備的組的擴增倍數。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導的早期和中期用纖連蛋白片段和抗CD3抗體進行刺激，LAK細胞可以更高的擴增倍數進行誘導和培養。
實施例21 LAK細胞培養系統中擴增比率的測定(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例20的(1)項相同的方式進行。計算此程序中自培養開始起第四天至第八天的細胞擴增比率和自培養開始起第十一天至第十五天的細胞增殖比率。結果在表23和24顯示。
表23

表24

如表23和24所示，在LAK細胞誘導的早期和中期使用反覆固定各纖連蛋白片段和抗CD3抗體的培養設備的組，其與對照組相比在誘導的稍後階段LAK細胞的擴增比率高。這些擴增比率遠高於在LAK細胞誘導的早期和中期使用只反覆固定抗CD3抗體的培養設備的組在誘導的稍後階段LAK細胞的擴增比率。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導的早期和中期用纖連蛋白片段和抗CD3抗體進行刺激，LAK細胞可以更高的擴增比率進行誘導和培養。
實施例22 LAK細胞中IL-2R表達的誘導(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例20的(1)項相同的方式進行。
(2)LAK細胞中IL-2R表達比率的測定在實施例22的(1)項進行誘導和培養的LAK細胞，其第十五天的IL-2R表達比率按實施例2的(2)項介紹的方法進行測定。結果在表25和26顯示。表中IL-2R表達陽性細胞的含量比率(％)表示為IL-2R表達比率(％)。
表25

表26

如表25和26所示，在LAK細胞誘導的早期和中期使用反覆固定各纖連蛋白片段和抗CD3抗體的培養設備的組，其與對照組相比，在培養開始後第十五天LAK細胞表面上的IL-2表達比率高。這些IL-2R表達比率遠高於在LAK細胞誘導的早期和中期使用只反覆固定抗CD3抗體的培養設備的組的IL-2R表達比率。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導的早期和中期用纖連蛋白片段進行刺激，LAK細胞可以更高的IL-2R表達比率進行誘導和培養。
實施例23 LAK細胞中CD8陽性細胞比率的測定(1)LAK細胞的誘導和培養LAK細胞的誘導和培養按與實施例20的(1)項相同的方式進行。
(2)LAK細胞群體中CD8陽性細胞含量比率的測定在實施例23的(1)項進行誘導和培養的LAK細胞群體，其第十五天的CD8陽性細胞含量比率按實施例1的(4)項介紹的方法進行測定。結果在表27顯示。
表27

如表27所示，在LAK細胞誘導的早期和中期使用反覆固定各纖連蛋白片段和抗CD3抗體的培養設備的組，其與對照組相比，在培養開始起第十五天LAK細胞群體中CD8陽性細胞的含量比率高。這些CD8陽性細胞的含量比率遠高於在LAK細胞誘導的早期和中期使用只反覆固定抗CD3抗體的培養設備的組的CD8陽性細胞的含量比率。換句話說，現清楚通過在LAK細胞誘導的早期和中期用纖連蛋白片段進行刺激，LAK細胞可以更高的CD8陽性細胞的含量比率進行誘導和培養。
序列表獨立文本SEQ ID NO1；命名為III-8的纖連蛋白部分區域SEQ ID NO2；命名為III-9的纖連蛋白部分區域SEQ ID NO3；命名為III-10的纖連蛋白部分區域SEQ ID NO4；命名為III-12的纖連蛋白部分區域SEQ ID NO5；命名為III-13的纖連蛋白部分區域SEQ ID NO6；命名為III-14的纖連蛋白部分區域SEQ ID NO7；命名為CS-1的纖連蛋白部分區域SEQ ID NO8；命名為C-274的纖連蛋白片段SEQ ID NO9；命名為H-271的纖連蛋白片段SEQ ID NO10；命名為H-296的纖連蛋白片段SEQ ID NO11；命名為CH-271的纖連蛋白片段SEQ ID NO12；命名為CH-296的纖連蛋白片段SEQ ID NO13；命名為C-CS1的纖連蛋白部分片段SEQ ID NO14；命名為CHV-89的纖連蛋白片段SEQ ID NO15；命名為CHV-90的纖連蛋白片段SEQ ID NO16；命名為CHV-92的纖連蛋白片段SEQ ID NO17；命名為CHV-179的纖連蛋白片段SEQ ID NO18；命名為CHV-181的纖連蛋白片段SEQ ID NO19；命名為H-275-Cys的纖連蛋白片段SEQ ID NO20；引物12SSEQ ID NO21；引物14ASEQ ID NO22；引物Cys-ASEQ ID NO23；引物Cys-SSEQ ID NO24；基於衍自流感病毒的基質蛋白而設計的肽工業適用性根據本發明製備細胞毒性淋巴細胞的方法，獲得其中高細胞毒性活性得以保持、IL-2R表達水平顯著提高、CD陽性細胞的比率提高的細胞毒性淋巴細胞。所述淋巴細胞可合適地應用於例如過繼免疫療法中。因此，預計本發明方法將對醫療領域作出巨大的貢獻。
序列表110TAKARA BIO INC.
120製備細胞毒性活性淋巴細胞的方法13003-021-PCT150JP 2002-844141512002-03-2516024210121187212PRT213人工序列220
223稱為III-8的纖連蛋白部分區域4001Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr80 85210221190212PRT213人工序列220
223稱為III-9的纖連蛋白部分區域4002Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala1 5 10 15Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr
20 25 30Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro35 40 45Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr50 55 60Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu65 70 75Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr80 85 90210321194212PRT213人工序列220
223稱為III-10的纖連蛋白部分區域4003Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro1 5 10 15Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg20 25 30Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val35 40 45Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser50 55 60Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val65 70 75Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile80 85 90Asn Tyr Arg Thr210421192212PRT213人工序列220
223稱為III-12的纖連蛋白部分區域4004Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro1 5 10 15Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr20 25 30Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met35 40 45Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50 55 60Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu65 70 75Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr80 85 90Leu Glu210521199212PRT213人工序列220
223稱為III-13的纖連蛋白部分區域4005Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu1 5 10 15Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr30 35 40Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile45 50 55Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly60 65 70Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn75 80 85Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr90 95210621190212PRT213人工序列220
223稱為III-14的纖連蛋白部分區域4006Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro1 5 10 15Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr20 25 30Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu35 40 45Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr50 55 60Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu65 70 75
Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr80 85 90210721125212PRT213人工序列220
223稱為CS-1的纖連蛋白部分區域4007Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His1 5 10 15Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr20 252108211274212PRT213人220
223稱為C-274的纖連蛋白片段4008Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Ash Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp2109211271212PRT213人220
223稱為H-271的纖連蛋白片段4009Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro1 5 10 15Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr20 25 30Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met35 40 45Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser50 55 60Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu65 70 75Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr80 85 90Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala95 100 105Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr110 115 120Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr125 130 135Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile140 145 150Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr155 160 165Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser
170 175 180Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr185 190 195Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile200 205 210Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg215 220 225Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile230 235 240Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala245 250 255Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys260 265 270Thr21010211296212PRT213人工序列220
223稱為H-296的纖連蛋白片段40010Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro1 5 10 15Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr20 25 30Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met35 40 45Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser50 55 60Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu65 70 75Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr80 85 90Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala95 100 105Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr110 115 120Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr125 130 135Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile140 145 150Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr155 160 165Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser170 175 180
Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr185 190 195Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile200 205 210Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg215 220 225Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile230 235 240Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala245 250 255Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys260 265 270Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu275 280 285His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr290 29521011211549212PRT213人工序列220
223稱為CH-271的纖連蛋白片段40011Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Argll0 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp275 280 285Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp290 295 300Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr305 310 315Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro320 325 330Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys335 340 345Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg350 355 360Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro365 370 375Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile380 385 390Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp395 400 405Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys410 415 420Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr425 430 435Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser440 445 450Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser455 460 465Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser470 475 480Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr485 490 495Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg500 505 510Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr515 520 525Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser
530 535 540Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr54521012211574212PRT213人工序列220
223稱為CH-296的纖連蛋白片段40012Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp275 280 285Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp290 295 300Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr305 310 315Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro320 325 330Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys335 340 345Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg350 355 360Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro365 370 375Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile380 385 390Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp395 400 405Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys410 415 420Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr425 430 435Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser440 445 450Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser455 460 465Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser470 475 480Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr485 490 495Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg500 505 510Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr515 520 525Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser530 535 540Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu545 550 555Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp560 565 570Val Pro Ser Thr21013211302212PRT213人工序列
220
223稱為C-CS1的纖連蛋白片段40013Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Ash Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr275 280 285Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro290 295 300Ser Thr21014211367
212PRT213人工序列220
223稱為CHV-89的纖連蛋白片段40014Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg275 280 285Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp290 295 300Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val305 310 315
Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp320 325 330Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr335 340 345Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro350 355 360Val Val Ile Asp Ala Ser Thr36521015211368212PRT213人工序列220
223稱為CHV-90的纖連蛋白片段40015Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn275 280 285Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp290 295 300Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu305 310 315Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro320 325 330Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu335 340 345Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu350 355 360Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr36521016211370212PRT213人工序列220
223稱為CHV-92的纖連蛋白片段40016Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135
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223稱為CHV-179的纖連蛋白片段40017Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Ash Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg275 280 285Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp290 295 300Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val305 310 315Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp320 325 330Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr335 340 345Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro350 355 360Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu365 370 375Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln380 385 390Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys395 400 405Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
410 415 420Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr425 430 435Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro440 445 450Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr45521018211459212PRT213人工序列220
223稱為CHV-181的纖連蛋白片段40018Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp275 280 285Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp290 295 300Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr305 310 315Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro320 325 330Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys335 340 345Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg350 355 360Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro365 370 375Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile380 385 390Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp395 400 405Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys410 415 420Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr425 430 435Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser440 445 450Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr45521019211276212PRT213人工序列220
223稱為H-275-Cys的纖連蛋白片段40019Met Ala Ala Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr1 5 10 15Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn20 25 30Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys35 40 45Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser
50 55 60Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser65 70 75Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly80 85 90Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg95 100 105Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr110 115 120Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala125 130 135Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg140 145 150Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile155 160 165Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val170 175 180Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe185 190 195Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro200 205 210Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly215 220 225Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr230 235 240Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile245 250 255Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile260 265 270Gly Arg Lys Lys Thr Cys2752102021138212DNA213人工序列220
223引物12S40020aaaccatggc agctagcgct attcctgcac caactgac 382102121136212DNA213人工序列
220
223引物14A40021aaaggatccc taactagtct ttttccttcc aatcag丂362102221140212DNA213人工序列220
223引物Cys-A40022aaaagcggcc gctagcgcaa gccatggtct gtttcctgtg402102321141212DNA213人工序列220
223引物Cys-S40023aaaagcggcc gcactagtgc atagggatcc ggctgagcaa c 41210242119212PRT213人工序列220
223根據來自流感病毒的基質蛋白設計的肽40024Gly lle Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu1 權利要求
1.一種製備細胞毒性淋巴細胞的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟。
2.權利要求1的方法，其中與在不存在纖連蛋白、其片段或其混合物下通過進行至少誘導、維持和擴增之一而獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，所述細胞毒性淋巴細胞高度表達白細胞介素-2受體。
3.權利要求1的方法，其中與在不存在纖連蛋白、其片段或其混合物下通過進行至少誘導、維持和擴增之一而獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，所述細胞毒性淋巴細胞含有更高比率的CD8陽性細胞。
4.權利要求1-3之任一項的方法，其中與在不存在纖連蛋白、其片段或其混合物下通過進行至少誘導、維持和擴增之一而獲得的細胞毒性淋巴細胞相比，所述細胞毒性淋巴細胞高度保持細胞毒性活性。
5.權利要求1-4之任一項的方法，其中纖連蛋白、其片段或其混合物固定在固相上。
6.權利要求5的方法，其中所述固相為細胞培養設備或細胞培養載體。
7.權利要求6的方法，其中所述細胞培養設備為培養皿、培養瓶或培養袋，所述細胞培養載體為珠粒、薄膜或載玻片。
8.權利要求1-4之任一項的方法，其中至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一在含有纖連蛋白、其片段或其混合物的培養基中進行。
9.權利要求1-8之任一項的方法，其中所述纖連蛋白片段為包含序列表SEQ ID NO1-7胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能。
10.權利要求9的方法，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性。
11.權利要求9的方法，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽。
12.權利要求1的方法，所述方法包括在包含培養基的細胞培養設備中，在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下，進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一，其中所述方法滿足以下條件之任一項(a)培養初始時細胞數量與細胞培養設備的培養面積的比率為1-5×105細胞/cm2；(b)培養初始時培養基中的細胞濃度為1-5×105細胞/ml。
13.權利要求12的方法，其中所述方法沒有稀釋步驟或調換細胞培養設備的步驟。
14.通過權利要求1-13之任一項的方法獲得的細胞毒性淋巴細胞。
15.一種藥物，其包含作為有效成分的通過權利要求1-13之任一項的方法獲得的細胞毒性淋巴細胞。
16.一種增強細胞的白細胞介素-2受體表達的藥物，所述藥物的特徵在於所述藥物包含作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物。
17.權利要求16的藥物，其中所述纖連蛋白片段為包含序列表SEQ ID NO1-7代表的胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能。
18.權利要求17的藥物，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性。
19.權利要求17的藥物，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽。
20.一種提高淋巴細胞中CD8陽性細胞的比率的藥物，所述藥物的特徵在於所述藥物包含作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物。
21.權利要求20的藥物，其中所述纖連蛋白片段為包含序列表SEQ ID NO1-7代表的胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能。
22.權利要求21的藥物，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性。
23.權利要求21的藥物，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽。
24.一種提高或維持細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的藥物，所述藥物的特徵在於所述藥物包含作為有效成分的纖連蛋白、其片段或其混合物。
25.權利要求24的藥物，其中所述纖連蛋白片段為包含序列表SEQ ID NO1-7代表的胺基酸序列中至少一個序列的多肽，或為在上述多肽的胺基酸序列中存在一個或多個胺基酸取代、缺失、插入或添加的多肽，其中所述多肽具有與上述多肽等同的功能。
26.權利要求25的藥物，其中所述纖連蛋白片段具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性。
27.權利要求25的藥物，其中所述纖連蛋白片段為選自包含序列表SEQ ID NO8-19所示的胺基酸序列中任一序列的多肽的多肽。
28.一種增強細胞毒性淋巴細胞的白細胞介素-2受體表達的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟。
29.一種提高細胞毒性淋巴細胞中CD8陽性細胞的比率的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟。
30.一種提高或維持細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的方法，所述方法的特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一的步驟。
31.權利要求1-13之任一項的方法，所述方法進一步包括將外源基因轉導入細胞毒性淋巴細胞的步驟。
32.權利要求31的方法，其中外源基因用逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒或猿猴病毒轉導。
全文摘要
本發明涉及製備細胞毒性淋巴細胞的方法，其特徵在於所述方法包括在纖連蛋白、其片段或其混合物存在下進行至少細胞毒性淋巴細胞的誘導、維持和擴增之一項的步驟。
文檔編號A61P37/00GK1656215SQ0381146
公開日2005年8月17日 申請日期2003年3月25日 優先權日2002年3月25日
發明者佐川裕章, 出野美津子, 加藤鬱之進 申請人:寶生物工程株式會社