培養吸水鏈黴菌生產雷帕黴素發酵液的方法
2023-07-11 12:33:11 2
專利名稱：培養吸水鏈黴菌生產雷帕黴素發酵液的方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及一種微生物發酵生產雷帕黴素的方法。
背景技術：
雷帕黴素(Rapamycin，RPM, RAPA)，又名西羅莫司(Sirolimus)，是在1耵5年由力口拿大Ayerst研究所從吸水鏈黴菌(Sti^pomyces hygroscopicus)中分離出來的三烯大環內酯類抗生素，它作為一種新型的高效免疫抑制劑引起了廣泛的關注，同時它又是一種有效的抗真菌劑並具有抗腫瘤的作用。雷帕黴素是31元環組成的三烯大環內酯化合物，含有特殊的α、β - 二酮乙哌啶酸胺分子掩蓋的半羧酮，其分子式為C51H79O13，分子量為991。雷帕黴素是一類親酯類抗生素，外觀通常為白色結晶體。易溶於甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑，幾乎不溶於乙醚、己烷、石油醚，極微溶於水。在血漿中PH呈低中性，37°C時降解特別快，在血漿中半衰期為1 5h，在甲醇中不穩定。其熔點為183 185°C，比旋光度[a ]D25 = 153° (甲醇)。Vezinia等於1975年發現它具有抗真菌作用，以後Tanaka等又發現它是一種極有前途的免疫抑制劑並具有抗腫瘤作用。同時西羅莫司具有很強的抗移植排斥反應，並能與環孢素協同延長移植物存活時間，西羅莫司還能逆轉正在進行的移植排斥反應。另外，西羅莫司還有預防和治療實驗性自身溶血性貧血的作用。雷帕黴素在防止動物器官移植排斥作用的效果大大強於現行臨床廣泛應用的環孢黴素A (cyclosporin A, CsA)，也勝於大環內酯類同類藥物Π(506 (他克莫司)，是臨床上很有潛力的免疫抑制劑。由於RPM和CsA的化學結構不同，與Π(506既相似，又有差異，RPM 與CsA、FK506等聯用均有良好的協同作用，聯用的益處在於減少了治療方案中各種免疫抑制劑的用量；減少了免疫抑制劑的副作用；增強了免疫抑制劑效果。雷帕黴素的作用機制和CsA及Π(506均不同。CsA和Π(506分別與細胞漿內環孢親和素和FKBP12(H(506結合蛋白)相結合，抑制Calcineurin(鈣調磷酸酶)，阻止細胞因子如白介素-2(IL-2)的表達和轉錄，抑制T細胞活化的早期階段。RPM與Π(506具有相似的分子結構，也能與FKBP12 結合，RAPA-FKBP12複合物與哺乳類雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)結合，但它不阻斷T細胞生長因子的生成，而是阻斷這些因子提供的增生信號，抑制多種刺激引起的T和B淋巴細胞的增生，是細胞停留在細胞周期Gl期的晚期，阻止這些細胞進入S期。綜上所述，雷帕黴素作為一種高效新型的免疫抑制劑，它在臨床器官移植及治療自身免疫疾病中具有重要的意義。1993年，美國Merck公司通過微生物轉化的方法轉化為雷帕黴素，前期種子液培養後，發酵液最終產生了 300mg/L的雷帕黴素。印度科學家從土壤中篩選了高產雷帕黴素鏈黴菌，且副產物極少，在高通氣量的糊精培養基中通過補料分批發酵產生了 300 310mg/L的雷帕黴素。2004年，印度學者Vaid等對一株鏈黴菌進行誘變，將植物油作為惟一碳源進行發酵，結果表明連續發酵144 192h，雷帕黴素的產率可達到180 330mg/L。 1999年10月20日雷帕黴素在美國上市，為口服液劑型。此後採用伊蘭(Elan)公司的納米晶體技術製備的Img片劑也已在美國上市。2000年3月雷帕黴素在英國、德國、丹麥等國上市，此外雷帕黴素還在英國以口服混懸劑的方式銷售。由於美國生產的雷帕黴素在我國未能獲得行政保護，故國內企業可以生產雷帕黴素。據了解，自2001年至今，國家食品藥品監督管理局已先後批准了 7家企業生產雷帕黴素，其中浙江新昌製藥廠、福建科瑞藥業、杭州中美華東製藥、華北製藥科研開發公司4家為雷帕黴素原料藥廠。目前，有文獻報導的發酵水平均不高，最高產量在600mg/L-700mg/L。杭州中美華東醫藥股份有限公司已經投入工業化生產(中國專利 CN200810019207. 8)，在10噸、50噸發酵罐上培養吸水鏈黴菌發酵能力在600mg/L左右。張薇等在《雷帕菌素高產菌株的推理選育與發酵新工藝研究》(2009年浙江大學碩士學位論文)一文中公開了菌種選育和培養條件優化，在20噸發酵罐中發酵能力為700mg/L。由此可知，目前雷帕黴素生物發酵生產存在的不足在於雷帕黴素生物發酵單位不高，不利於提取純化，不能充分滿足工業化生產的要求。
發明內容
本發明的目的在於克服現有雷帕黴素生產技術的不足，從而提供一種能夠更好地進行工業化生產的發酵方法，具體包括一套培養基配方和培養條件的控制方法。為達到上述目的，本發明對吸水鏈黴菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)ACCC No. 40417進行了平板培養、搖瓶種子培養、種子罐種子培養和發酵罐發酵培養。具體實施過程如下a.平板培養將吸水鏈黴菌菌種接種於含有固體培養基的培養皿，接種後恆溫培養5-7天；b.搖瓶種子培養在三角瓶中裝入種子培養基，滅菌後接入平板培養所得的吸水鏈黴菌菌種，放置在立式搖床上，220-230rpm條件下培養50_70h，得搖瓶種子培養液；c.種子罐種子培養將搖瓶種子培養液按照種子罐培養基體積的11% -15%接種量接種於種子罐培養基，200-210rpm條件下培養35_46h，得種子罐種子液；d.發酵罐發酵培養將種子罐種子液按照發酵罐培養基體積的11% -15%接種量接種於發酵罐培養基，初始攪拌轉速為180-220rpm，培養72_96h，菌體溼重0. 22-0. 23g/ml 時，調節轉速為255-300rpm，培養105_150h ；發酵罐培養總時間170_230h。優選的上述培養吸水鏈黴菌(Str印omyces hygroscopicus ACCC No. 40417)發酵生產雷帕黴素發酵液的方法，具體包括以下步驟a.平板培養將吸水鏈黴菌菌種接種於含有固體培養基的培養皿後，接種後於 28°C恆溫培養5-7天，取出放於4°C冰箱保存；b.搖瓶種子培養在250mL三角瓶中裝入50mL種子培養基，滅菌後接入4°C冰箱保存的吸水鏈黴菌菌種，放置在立式搖床上29°C，220-230rpm條件下培養50_70h，得搖瓶種子培養液；c.種子罐種子培養將搖瓶種子培養液按照種子罐培養基體積的11% -15%接種量接種於種子罐培養基，於29°C，200-2IOrpm條件下培養35_46h，得種子罐種子液；d.發酵罐發酵培養將種子罐種子液按照發酵罐培養基體積的11% -15%接種量接種於發酵罐培養基，於29°C，初始攪拌轉速為180-220rpm，培養72_96h，待菌體溼重為0. 22-0. 23g/ml時，調節轉速至255_300rpm，培養105_150h ；發酵罐培養總時間170_230h， 其中，在培養24h和48h時，分別一次性補加兩種物質濃度為1. 的丙氨酸和濃度為 0.5%的賴氨酸。上述步驟所用培養基分別含有以下組份(1)固體培養基含有燕麥片、葡萄糖、酵母抽提物、碳酸鈣和瓊脂。(2)種子培養基含有可溶性澱粉、蛋白腖、酵母抽提物、花生粕和甘油。(3)發酵培養基含有玉米澱粉、黃豆餅粉、蛋白腖、葡萄糖、K2HPO4, KH2PO4和NaCL。上述步驟所用培養基的組份含量為(1)固體培養基含有燕麥片30_48g、葡萄糖15_25g、酵母抽提物5_18g、碳酸鈣 l-4g 和瓊脂 10-20g, pH 為 6. 8-7. 4。(2)種子培養基含有可溶性澱粉30_48g、蛋白腖2_8g、酵母抽提物5_16g、花生粕 4-15g、甘油 4-15g 和碳酸鈣 l_4g，pH 為 6. 7-7. 3。(3)發酵培養基含有玉米澱粉9_18g、黃豆餅粉4_15g、蛋白腖3_10g、葡萄糖 28-42g、K2HP040-8g、KH2PO4I-IOg 和 NaCLl_4g、碳酸鈣 l_5g 和泡敵 l_6g，pH 為 6. 5-7. 3。上述步驟所用培養基的最優配方為(1)固體培養基的pH為7. 2，並且每升固體培養基含有燕麥片40g、葡萄糖20g、酵母抽提物log、碳酸鈣2g和瓊脂16g。(2)種子培養基的pH為7.0，並且每升種子培養基含有可溶性澱粉40g、蛋白腖 5g、酵母抽提物10g、花生粕10g、甘油IOg和碳酸鈣2g。(3)發酵培養基的pH為6. 9，並且每升發酵培養基含有玉米澱粉13g、黃豆餅粉 10g、蛋白腖 6g、葡萄糖 35g、K2HP043g、KH2P043g 和 NaCLlg、碳酸鈣 3g 和泡敵 3g。搖瓶種子培養基與種子罐種子培養基配方相同，本文統一命名為種子培養基。通過培養基的選擇及培養條件的控制，尤其轉速的控制，本發明能夠在培養吸水鏈黴菌過程中產生含有較高濃度雷帕黴素的發酵液，在100L發酵罐的發酵實驗中得到的發酵液的雷帕黴素平均濃度達到了 908. 69mg/L，在1000L發酵罐的發酵實驗中得到的發酵液的雷帕黴素平均濃度達到了 895. 28mg/L，更有利於雷帕黴素的提取工作，能夠滿足工業化生產的需要。
具體實施例方式為了更好的說明本發明，下面通過實施例予以進一步說明，但本發明絕不僅限於以下實施例。實施例1100L發酵罐的發酵培養(一 )培養基的配製固體培養基配方為每升固體培養基含有燕麥片40g、葡萄糖20g、酵母抽提物 10g、碳酸鈣2g和瓊脂16g，pH為7. 2。配製0. 6L。種子培養基配方為每升種子培養基含有可溶性澱粉40g、蛋白腖5g、酵母抽提物 10g、花生粕log、甘油IOg和碳酸鈣2g，pH為7. 0。配製7L。發酵培養基配方為每升發酵培養基含有玉米澱粉13g、黃豆餅粉10g、蛋白腖6g、 葡萄糖 35g、K2HP043g、KH2P043g 和 NaCLlg、碳酸鈣 3g 和泡敵 3g，pH 為 6. 9。配製 60L。
( 二 )吸水鏈黴菌的平板培養固體培養基配置好後裝入三角瓶內(lx750mL)，121°C滅菌21分鐘，同時將乾淨的培養皿包好121°C滅菌21分鐘。然後待所滅菌的固體培養基稍冷卻後，每個滅菌後的培養皿倒入固體培養基約50mL，備用。將吸水鏈黴菌菌種接種於含有固體培養基的培養皿，將接種後的培養皿放置在 28°C恆溫培養箱內或生化培養箱內培養5-7天後，取出放於4°C冰箱保存備用。(三)250mL搖瓶種子培養在250mL三角瓶中裝入50mL的種子培養基，滅菌後接入4°C冰箱保存的吸水鏈黴菌菌種，放置在立式搖床上29°C、230rpm培養58h，得搖瓶種子培養液，備用。(四)IOL種子罐的種子培養在IOL種子罐中裝入種子培養基7L，滅菌後接入搖瓶種子培養液800mL，在溫度 290C，通氣量1 0. 5，罐壓0. 05MPa,攪拌轉速210rpm的條件下培養46h，得到IOL種子罐
種子培養液。(五)100L發酵罐的發酵培養在100L的發酵罐中裝入發酵培養基70L，實罐滅菌後移入8L由IOL種子罐製備的種子培養液，在通氣量1 0.5，罐壓0.05MPa，溫度29°C，初始攪拌轉速為200rpm條件下， 發酵培養72h，菌體溼重0. 22-0. 23g/ml時，調節轉速為260rpm，培養108h。發酵罐培養總時間180h。在發酵過程中，菌絲生長階段，選擇發酵培養24h和48h時分別一次性補加兩種物質濃度為1. 的丙氨酸和濃度為0. 5%的賴氨酸。按上述方法分別生產五批產品，發酵培養結束後，收集五批發酵液，分別各取發酵液2ml，離心後，用3ml80%丙酮萃取，萃取液用高效液相色譜分析，得到五批發酵液中每批發酵液的雷帕黴素的濃度，平均濃度為908. 69mg/L。數據見表1。 表1、100L發酵罐發酵結果
權利要求
1.培養吸水鏈黴菌(Str印omyceshygroscopicus ACCC No. 40417)發酵生產雷帕黴素發酵液的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟a.平板培養將吸水鏈黴菌菌種接種於含有固體培養基的培養皿，接種後恆溫培養 5-7 天;b.搖瓶種子培養在三角瓶中裝入種子培養基，滅菌後接入平板培養所得的吸水鏈黴菌菌種，放置在立式搖床上，220-230rpm條件下培養50_70h，得搖瓶種子培養液；c.種子罐種子培養將搖瓶種子培養液按照種子罐培養基體積的11%-15%接種量接種於種子罐培養基，200-210rpm條件下培養35_46h，得種子罐種子液；d.發酵罐發酵培養將種子罐種子液按照發酵罐培養基體積的11%-15%接種量接種於發酵罐培養基，初始攪拌轉速為180-220rpm，培養72_96h，菌體溼重0. 22-0. 23g/ml時， 調節轉速為255-300rpm，培養105_150h ；發酵罐培養總時間170_230h。
2.如權利要求1所述的培養吸水鏈黴菌(Str印omyceshygroscopicus ACCC No. 40417)發酵生產雷帕黴素發酵液的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟a.平板培養將吸水鏈黴菌菌種接種於含有固體培養基的培養皿，接種後於28°C恆溫培養5-7天後，取出放於4°C冰箱保存；b.搖瓶種子培養在250mL三角瓶中裝入50mL種子培養基，滅菌後接入4°C冰箱保存的吸水鏈黴菌菌種，放置在立式搖床上，於29 °C，220-230rpm條件下培養50_70h，得搖瓶種子培養液；c.種子罐種子培養將搖瓶種子培養液按照種子罐培養基體積的11%-15%接種量接種於種子罐培養基，於29°C，200-2IOrpm條件下培養35_46h，得種子罐種子液；d.發酵罐發酵培養將種子罐種子液按照發酵罐培養基體積的11%-15%接種量接種於發酵罐培養基，於29 °C，初始攪拌轉速為180-220rpm，培養72_96h，菌體溼重 0. 22-0. 23g/ml時，調節轉速為255_300rpm，培養105_150h ；發酵罐培養總時間170_230h， 其中，在培養24h和48h時分別一次性補加濃度為1. 的丙氨酸和濃度為0. 5%的賴氨酸。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述固體培養基含有燕麥片、葡萄糖、酵母抽提物、碳酸鈣和瓊脂。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述固體培養基含有燕麥片30-48g、葡萄糖 15-25g、酵母抽提物 5-18g、碳酸鈣 l-4g 和瓊脂 10_20g，pH6. 8-7. 4。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述固體培養基的PH為7.2，並且每升固體培養基含有燕麥片40g、葡萄糖20g、酵母抽提物10g、碳酸鈣2g和瓊脂16g。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所採用的種子培養基含有可溶性澱粉、蛋白腖、酵母抽提物、花生粕和甘油。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於所採用的種子培養基含有可溶性澱粉 30_48g、蛋白腖2-8g、酵母抽提物5-16g、花生粕4_15g、甘油4_15g和碳酸鈣l_4g，pH為 6. 7-7. 3。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於所採用的種子培養基的pH為7.0，並且每升種子培養基含有可溶性澱粉40g、蛋白腖5g、酵母抽提物10g、花生粕10g、甘油IOg和碳酸鈣2g。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基含有玉米澱粉、黃豆餅粉、蛋白腖、葡萄糖、K2HPO4、KH2PO4 和 NaCL。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基含有玉米澱粉9-18g、黃豆餅粉 4-15g、蛋白腖 3-10g、葡萄糖 28-42g、K2HP040_8g、KH2PO4I-IOg 和 NaCLl_4g、碳酸鈣 l-5g 和泡敵 l_6g，pH 為 6. 5-7. 3。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基的pH為6.9，並且每升發酵培養基含有玉米澱粉13g、黃豆餅粉10g、蛋白腖6g、葡萄糖35g、K2HP043g、KH2P043g和 NaCLlg、碳酸鈣3g和泡敵3g。
全文摘要
本發明公開了一種新的培養吸水鏈黴菌生產雷帕素髮酵液的方法。本發明通過發酵培養微生物菌株吸水鏈黴菌(Strepomyces hygroscopicus ACCC No.40417)，得到含有雷帕黴素的發酵液。通過本發明所述方法製得的雷帕黴素發酵液效價高，因而更有利於提取，可以更好地進行工業化生產。
文檔編號C12R1/55GK102453737SQ20101054011
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月22日 優先權日2010年10月22日
發明者趙麗麗, 趙志全 申請人:山東新時代藥業有限公司