一種製備尿激酶的方法

2023-07-11 01:10:51

專利名稱：一種製備尿激酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備尿激酶的方法，尤其涉及一種親和膜色譜技術和親和層析技
術製備尿激酶的方法。
背景技術：
尿激酶，簡稱區，是人體腎細胞產生的一種鹼性絲氨酸蛋白酶，絲氨酸和組氨酸是 酶活性中心的必需胺基酸。其主要存在於人及哺乳動物的尿中，人尿源尿激酶主要有天然 高分子量尿激酶(54000Dal)和低分子量尿激酶(33000Dal)兩種，高分子量尿激酶溶解血 栓的臨床效果比低分子量的尿激酶約高3倍，國際上把尿激酶的相對分子量作為質量標準 的重要指標之一。臨床上主要用於治療急性心肌梗塞、急性腦血栓形成、腦血管栓塞、血栓 性閉塞性疾病、肺栓塞以及視網膜中央靜脈血栓形成。 尿激酶製備方法目前主要有離子交換層析法，凝膠分子篩法、免疫親和層析和對 氨基苯甲脒-S印harose親和層析等。如陳祥勝等報導了採用苯甲脒瓊脂糖凝膠親和層析 從尿激酶粗品中精製尿激酶，比活27938IU/mg 'pr，活性回收率62. 96%，純化倍數4. 03倍； 祝一鋒等報導了採用S印hadexG-50凝膠過濾、CM-S印hadex C-50、硫酸銨沉澱以及Bio-Gel P-30凝膠過濾等製備尿激酶精品，比活34080IU/mg pr，活性回收率60%左右，純化倍數 50倍。沈金玉等報導了採用免疫親和層析從尿激酶粗品精製尿激酶。離子交換和凝膠過濾 純化效率低下，難以獲得高純度的尿激酶精品；免疫親和層析純化尿激酶可獲得較高純度 的尿激酶精品，但由於免疫親和層析需使用生物配基，價格昂貴，很難獲得工業化生產使用 的配基；對氨基苯甲脒-S印harose作為一種較好的尿激酶精品精製方法，但也必須同其他 方法一起使用，而且必須在提取過程中多次使用才能獲得高質量的尿激酶，多次使用造成 生產成本極高、收率低，生產周期長。

發明內容
本發明的目的是提供一種以尿激酶粗品為原料製備尿激酶的方法，該方法生產工 藝時間短，易於工業化生產，產品質量高，生產成本低。 本發明是這樣來實現的，首先尿激酶粗品經溶解、離心或過濾，體積較大時超濾濃 縮等步驟獲得的澄清溶液，調電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率 一致，再上裝有D160陽離子樹脂層析柱吸附，再洗滌、洗脫，得到的洗脫液上親和膜純化 柱，經洗滌、洗脫得到的洗脫液上親和層析柱，經洗滌、洗脫、過濾得到的濾液進行冷凍幹 燥，最後得到尿激酶。其具體製備方法如下 (1)取一定量的尿激酶粗品(生物效價30000 50000IU/g，比活300 600IU/ g *pr)，用8 10倍尿激酶粗品量(體積與重量比)的p朋.0， 0. lmol/L磷酸緩衝液分2 3次加入溶解，每次攪拌溶解0. 5 1. 0小時，然後離心或過濾，合併上清或濾液，體積較大 時進行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用； (2)將步驟(1)得到的澄清溶液調節電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率一致，再上用含0. 15 0. 30mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液
平衡的D160陽離子樹脂層析柱，然後用含0. 15 0. 30mol/L氯化鈉的p朋.0，0. lmol/L磷
酸緩衝液洗滌；最後用PH10， 1 3%氨水進行洗脫，收集洗脫活性峰； (3)將步驟(2)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然後上親和膜純化柱，用
含0. 45 0. 60mol/L氯化鈉的pH7. 2， 0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 25 0. 35mo1/
L氯化鈉的pH3. 5 4. 5，0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集洗脫活性峰； (4)將步驟(3)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然後上親和層析柱，用含
1. 0 2. 0mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 35 0. 45mol/L氯
化鈉的pH3. 5 4. 5，0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，最後進行冷凍幹
燥，得到尿激酶。 本發明利用D160陽離子樹脂吸附法，親和膜色譜法與親和層析法等結合使用，以 尿激酶粗品為原料製備尿激酶，所得到的尿激酶質量優於現有國內水平，尿激酶比活可達 到150， 000IU/mg pr以上，高分子尿激酶相對含量可達到96%以上，尿激酶生物活性回收 率可達到65% 。本方法解決了現有尿激酶製備方法普遍存在的操作繁瑣、產品質量差，收率 低和生產成本高等問題。
具體實施方式

實施例l: (1)取100g尿激酶粗品，用p朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液400ml溶解，攪拌50分 鍾，離心，沉澱再用P朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液400ml溶解，攪拌30分鐘，離心，合併兩次 上清，得到820ml澄清溶液，取樣檢測，總生物效價0. 042億單位； (2)將步驟(1)得到的820ml澄清溶液調節電導率，使其與D160陽離子樹脂層析 柱使用的平衡液電導率一致，再上用含O. 15mol/L氯化鈉的pH6. O，O. lmol/L磷酸緩衝液平 衡的D160陽離子樹脂層析柱，然後用含0. 15mol/L氯化鈉的pH6. O，O. lmol/L磷酸緩衝液 洗滌；最後用PHIO， 1 %氨水進行洗脫，收集得到190ml洗脫活性峰，總生物效價0. 039億單 位； (3)將步驟(2)收集得到的190ml洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然後上親和膜純化 柱，用含0. 45mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 25mol/L氯化鈉 的pH3. 5，0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集得到90ml洗脫活性峰，總生物效價0. 035億單 位； (4)將步驟(3)收集得到的90ml洗脫活性峰用醋酸調pH7.2，然後上親和層析柱， 用含1. Omol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 35mol/L氯化鈉的 pH3. 5， 0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，得到85ml濾液，進行冷凍乾燥， 得到34. lmg尿激酶，總生物效價O. 028億單位，比活167000IU/mg. pr，高分子尿激酶相對含 量97. 0 % ，活性總回收率66. 7 % 。
實施例2: (1)取200g尿激酶粗品，用p朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液1000ml溶解，攪拌60分 鍾，離心，沉澱再用P朋.0， 0. lmol/L磷酸緩衝液1000ml溶解，攪拌30分鐘，過濾，合併兩次 上清，超濾濃縮，得到320ml濃縮液，取樣檢測，總生物效價0. 080億單位；
(2)將步驟(1)得到的320ml濃縮液調節電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱 使用的平衡液電導率一致，再上用含0. 20mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液平 衡的D160陽離子樹脂層析柱，然後用含0. 20mol/L氯化鈉的p朋.0，0. lmol/L磷酸緩衝液 洗滌；最後用PH10， 2 %氨水進行洗脫，收集得到260ml洗脫活性峰，總生物效價0. 074億單 位； (3)將步驟(2)收集得到的260ml洗脫活性峰用醋酸調pH7.2，然後上親和膜純化 柱，用含0. 50mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 30mol/L氯化鈉 的pH4. 0，0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集得到100ml洗脫活性峰，總生物效價0. 068億單 位； (4)將步驟(3)收集得到的100ml洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然後上親和層析 柱，用含0. 50mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 40mol/L氯化鈉 的pH4. 0，0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，得到105ml濾液，進行冷凍幹 燥，得到62. 8mg尿激酶，總生物效價0. 054億單位，比活176000IU/mg *pr，高分子尿激酶相 對含量97.2%，活性總回收率67. 5 % 。
實施例3 (1)取500g尿激酶粗品，用p朋.0， 0. lmol/L磷酸緩衝液2000ml溶解，攪拌60分 鍾，離心；沉澱用P朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液2000ml溶解，攪拌50分鐘，離心；第二次沉 澱用P朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液1500ml溶解，攪拌30分鐘，離心；合併三次上清，超濾濃 縮，得到400ml濃縮液，取樣檢測，總生物效價0. 22億單位； (2)將步驟(1)得到的400ml濃縮液調節電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱 使用的平衡液電導率一致，再上用含O. 30mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液平衡 的D160陽離子樹脂層析柱，然後用含0. 30mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩衝液洗 滌；最後用pH10， 3%氨水進行洗脫，收集得到450ml洗脫活性峰，總生物效價0. 20億單位；
(3)將步驟(2)收集得到的450ml洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然後上親和膜純化 柱，用含O. 6mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 35mol/L氯化鈉的 pH4. 5，0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集得到120ml洗脫活性峰，總生物效價0. 18億單位；
(4)將步驟(3)收集得到的120ml洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然後上親和層析 柱，用含2. Omol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0. 45mol/L氯化鈉的 pH4. 5，0. lmol/L醋酸緩衝液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，得到110ml濾液，進行冷凍乾燥， 得到162. 9mg尿激酶，總生物效價0. 145億單位，比活182000IU/mg 'pr，高分子尿激酶相對 含量98. 0 % ，活性總回收率65.9%。
權利要求
一種製備尿激酶的方法，其特徵在於該方法依次包括如下步驟(1)取一定量的尿激酶粗品，用8～10倍尿激酶粗品量的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩衝液分2～3次加入溶解，每次攪拌溶解0.5～1.0小時，然後離心或過濾，合併上清或濾液，體積較大時進行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用；(2)將步驟(1)得到的澄清溶液調電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率一致，再上用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩衝液平衡的D160陽離子樹脂層析柱，然後用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩衝液洗滌；最後用pH10，1～3％氨水進行洗脫，收集洗脫活性峰；(3)將步驟(2)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調pH7.2，然後上親和膜純化柱，用含0.45～0.60mol/L氯化鈉的pH7.2，0.1mol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0.25～0.35mol/L氯化鈉的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸緩衝液洗脫，收集洗脫活性峰；(4)將步驟(3)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調pH7.2，然後上親和層析柱，用含1.0～2.0mol/L氯化鈉的pH7.2，0.1mol/L磷酸緩衝液洗滌，再用含0.35～0.45mol/L氯化鈉的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸緩衝液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，最後進行冷凍乾燥，得到尿激酶。
2. 根據權利要求l所述的製備尿激酶的方法，其特徵在於步驟(3)使用的親和膜純化 介質是以聚碸為載體，對氨基苯甲脒為親和配基，採用幹噴_溼法紡絲製膜技術製備成的 中空纖維親和膜；步驟(4)使用的親和層析介質是以瓊脂糖為載體，對氨基苯甲脒親和配 基偶聯製備的。
全文摘要
一種製備尿激酶的方法，其特徵在於採用了D160陽離子樹脂交換法、親和膜色譜法及親和層析法相結合，以尿激酶粗品為原料製備尿激酶。所得到的尿激酶質量優於現有國內水平，尿激酶比活可達到150,000IU/mg.pr以上，高分子尿激酶相對含量可達到96％以上，尿激酶生物活性回收率可達到65％。本方法解決了現有尿激酶製備方法普遍存在的操作繁瑣、產品質量差，收率低和生產成本高等問題。
文檔編號C12N9/72GK101701215SQ200910186618
公開日2010年5月5日 申請日期2009年12月7日 優先權日2009年12月7日
發明者劉蘭花, 張志武, 曾英, 朱月華, 楊益輝 申請人:南昌市萬華生化藥業有限公司