一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法

2023-07-11 14:32:11

一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法，通過在CRM197A中加入萬能表位肽P2，並採用基因重組大腸桿菌來生產含有該萬能表位肽的白喉毒素變異體CRM197的A鏈的蛋白載體(簡稱P2CRM197A)；然後將流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵連接至P2CRM197A蛋白載體上形成流行性嗜血桿菌b型多糖-P2CRM197A結合物；採用這種方法獲得的流行性嗜血桿菌b型-P2CRM197A結合物與不含有萬能表位肽的對應蛋白載體CRM197A獲得的流行性嗜血桿菌b型多糖-CRM197A結合物相比較，其免疫原性比對照提高了3-5倍。
【專利說明】一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的 方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法。 【背景技術】
[0002] 當多糖以共價鍵連接至蛋白載體上時，能將半抗原的多糖轉變成全抗原，使得多 糖的免疫原性得到增強。以此方法合成的多糖蛋白結合疫苗已被廣泛地應用於小兒，成功 地預防了包括肺炎球菌，流行性腦膜炎球菌以及流行性嗜血桿菌b型等細菌的感染。
[0003] 用於合成多糖蛋白結合物的蛋白載體有多種，如破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉 毒素變異體CRM197,以及基因重組技術生產的流行性嗜血桿菌表面蛋白D等；但是，由於不 同蛋白的免疫特性，以不同蛋白載體合成的多糖蛋白結合物的免疫原性有差異，動物體免 疫後，對於由不同蛋白載體與同一種多糖合成形成的多糖蛋白結合物，所顯現的多糖免疫 原性也不同。由此可見，採用不同技術生產的蛋白載體，合成出來的多糖蛋白結合物的免疫 原性有差異。
[0004] 進入動物機體內後，抗原經抗原處理細胞（Antigen Process Cell, APC)處理 後產生表位肽（Epitope) [1]，在和主要組織相容性複合物（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子結合後，進而呈現在APC細胞表面，能夠被T淋巴細胞識別，這是免疫學 通過實驗已經得出的結論。現在知道，一個已知表位肽的免疫原性取決於三個因素：
[0005] 第一、適當表位肽的產生；
[0006] 第二，和表位肽結合的主要組織相容性複合物分子的呈現；
[0007] 第三，識別表位肽與主要組織相容性複合物形成的結合物的Τ細胞的呈現。
[0008] 其中，任何一個環節的缺少都將導致免疫應答缺失。
[0009] 用小鼠進行的試驗表明，缺乏適當的表位肽與主要組織相容性複合物形成的結合 物分子是最常導致動物體免疫響應缺失的原因。主要組織相容性複合物具有高度的多形態 性，已知的表位肽僅通過一個或者幾個等位基因（Alleles)就可結合至主要組織相容性復 合物，而不是全部表位肽片段。另外，有實驗結果顯示，由於抗原處理不適當，或者T細胞耐 受性空缺,也會導致免疫響應的缺失。
[0010] 有實驗表明，破傷風毒素的表位肽QYIKANSKFIGITEL (稱為P2)，可和大量不同的 主要組織相容性複合物ClassII結合，顯示其能夠被T細胞識別，具有萬能免疫原性的特 性，被稱之萬能表位肽。
[〇〇11] 萬能免疫原性表位肽具有和多個人類主要組織相容性抗原複合物Class II分子 的同型和異型體結合。這種萬能表位肽和人類主要組織相容性抗原複合物Class II分子 隨機的結合可用於開發合成疫苗，因為其能夠激活人群中的大部分個體的獲得性免疫系統 的應答。
[0012] 研究表明，P2表位肽由破傷風毒素的830 - 844胺基酸序列組成 (QYIKANSKFIGITEL)。在含有該表位肽的蛋白進入機體後，蛋白將被攝入至APC細胞內，被 消化降解。但是，這些表位肽將保存完整，在和主要組織相容性複合物結合後，被呈現在APC 細胞表面，並被T細胞識別，這表明萬能表位肽以相同的方式和多種DR分子作用。
[0013] MHC分子是加工後抗原的雜性受體，其功能是在胸腺中的免疫耐受誘導和周邊免 疫響應外來抗原的過程中，來呈現其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必須在呈現大量的表 位肽（容許更好的抗原識別，但更多的消耗T細胞儲備），和少許表位肽（大量的T細胞儲 備，但是少許有效地呈現外來抗原）中達到平衡。也就是說，如果抗原中含有在APC細胞處 理後能夠保存完整性、並具有代表性的少量表位肽，在和MHC結合後，就能夠刺激一定量的 T細胞，來建立免疫記憶效應，而這一過程不會消耗過量的T細胞，以避免消耗大量的T細 胞，造成免疫耐受。含有這種表位肽的抗原具有更強的免疫原性，這也就解釋了為什麼破傷 風類毒素具有很強的免疫原性的原因。
[0014] 現發現的大部分T細胞的刺激表位肽對於不同MHC Class II單體（haplotype) 作用有限，不同動物保存和呈現不同的抗原多肽區域（印Hopes)來刺激其T細胞。這種T 細胞刺激活性的基因限制阻礙了以合成方法來開發疫苗，而這種方法對於基因上不同的人 群的應用，應該是非常有效的方法。那些被發現具有刺激多重小鼠個體和/或與大多數人 體MHC Class II分子相關聯的T細胞刺激表位肽，提供了一個設計萬能活化T細胞的有效 途徑。在普通的蛋白抗原中加入萬能表位肽（也稱為萬能T細胞抗原簇）P2,能夠被大多數 動物的MHC Class II分子識別。這種T細胞抗原簇能夠用於直接誘導T細胞，或提供幫助 B細胞生產針對於弱免疫原的抗體，增強機體獲得性免疫應答的效應。
[0015] 致病性細菌通常能夠表達高分子量，包裹在細菌表面的是莢膜多糖，簡稱多糖。對 於成人來說，莢膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用於製備疫苗；但是，對於小兒，即2 歲以下的嬰幼兒，莢膜多糖被認為是非依賴於T細胞抗原。實驗顯示，當用作為抗原時，莢 膜多糖可誘導野株或者T細胞缺失小鼠生產多糖特異性IgM抗體的響應；但是，並不誘導 IgM抗體向IgG抗體的轉化。人體實驗也顯示，作為疫苗，多糖可以誘導成人生產保護性抗 體，但無法誘導嬰幼兒的免疫應答；也就是說，在小兒重複免疫莢膜多糖抗原後，無第二次 抗體增強響應，也無法誘導持續的T細胞記憶。
[0016] 現代免疫學實驗證實，多糖蛋白結合疫苗和純多糖疫苗比較的優勢在於，前者能 夠誘導免疫響應。當非依賴T細胞的莢膜多糖共價鍵地連接至蛋白載體而形成的多糖蛋白 結合物，在免疫了哺乳動物後，可誘導T細胞來幫助B細胞產生針對於結合物中的多糖部分 的IgG抗體。因此，多糖蛋白結合物誘導多糖特異性抗體IgM轉化為IgG，記憶B細胞的分 化，以及長期存在的T細胞記憶。
[0017] 流行性嗜血桿菌是一種微小的革蘭氏陰性球菌，目前共有六個在抗原性和生化 特性上不同的莢膜多糖菌株被發現，分別是a、b、c、d、e、和f ;其中b型（Haemophilus influenzae typeb，Hib)在臨床上和免疫學上最重要，是引起兒童患侵襲性細菌疾病，包括 腦膜炎、菌血症、會厭炎、肺炎、化膿性關節炎、心包炎和蜂窩炎的主要菌株中，佔全部分離 出來菌株的95%。研究表明細菌的致病性主要由菌體表面的幾個結構成分所決定，其中，最 具有致病性的是莢膜多糖。
[0018] 據免疫前的記錄，在每年5歲以下患有嚴重疾病兒童的中，已確證有300多萬例與 Hib有關，並導致全球大約40萬人死亡。在美國，Hib感染是引起兒童細菌性腦膜炎的首要 原因，資料顯示，每年至少有20, 000個侵襲性細菌疾病病例；據估計，每200個兒童中，有1 個兒童會在他的5歲以下年紀時患1次由於Hib感染導致的疾病。在流行的高峰年，發病 率可和和脊髓灰質炎發病率相同，如美國在1951年-1955年間，有10, 000到21，000個病 例被報告，其中死亡為1，〇〇〇到31，00,超過了腦膜炎球菌和肺炎球菌發病率的幾倍。
[0019] 當前臨床醫生在治療Hib感染患者時所面臨的可能難題之一就是耐藥性的出現， 氨苄青黴素一直是主要用於治療Hib感染的抗菌素，到上世紀70年代中期，第一例Hib耐 藥菌株出現後，開始廣泛地擴散，根據世界地區的不同，被分離到的耐藥菌株佔5% - 50%。 特別令人擔憂的是氯黴素抗藥株和氨苄青黴素-氯黴素抗藥株的出現，現有報導，在西班牙 臨床上分離到耐藥菌株中50%的有耐氨苄青黴素-氯黴素。由此可見，Hib對抗生素耐藥 性的增加突顯了預防的重要性，進行流行性嗜血桿菌b型疫苗的開發是對全世界兒童的健 康成長具有極大的意義。
[0020] 流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合疫苗在預防嚴重的傳染病中，發揮了巨大的作 用。不過，不同品種的Hib多糖蛋白結合疫苗的免疫原性變異性較大，其原因除了是由於採 用了不同合成方法的結果外，不同蛋白載體的使用，也是導致其免疫原性差異的主要原因。 在某些高危人群中，比如小兒、老年人或免疫功能低下人，低免疫原性的Hib多糖蛋白結合 疫苗的免疫效果不佳，保護性受到限制。因此，開發出免疫原性更強的流行性嗜血桿菌b型 多糖蛋白結合疫苗，仍然是該領域努力的方向。
[0021] 將衍生後的莢膜多糖共價鍵連接到一種蛋白載體上的技術，是上世紀80年代開 發的製備Hib蛋白結合疫苗的頂峰。在應用於2歲以下的兒童中，該疫苗能夠將在刺激機 體免疫系統應答的非依賴T -細胞莢膜多糖抗原，轉變成依賴性T -細胞多糖蛋白結合物。 這種Hib蛋白結合物的安全性和有效性已經在臨床試驗中得到了印證，甚至在和其它疫苗 聯用時也得到了證明。
[0022] 目前臨床上使用的Hib多糖蛋白結合疫苗的生產是採用純化的Hib莢膜多糖和蛋 白載體進行共價鍵的結合來製備，常用的蛋白載體部分種類包括破傷風類毒素、白喉類毒 素、白喉毒素突變體CRM197。試驗證明，採用這些蛋白載體合成的Hib莢膜多糖蛋白結合物 的主要原因是，這些蛋白是在人體上長期使用的疫苗或者類似物，安全、無毒；並且，合成後 的結合物免疫原性好。
【發明內容】

[0023] 本發明是提供了一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性 的方法。先在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 QYIKANSKFIGITEL (簡稱P2)，通過基因重組工程菌來生產含有P2的CRM197A蛋白載體（簡 稱P2CRM197A);然後將流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵形式連接至P2CRM197A蛋白載 體形成流行性嗜血桿菌b型多糖-P2CRM197A結合物。所得到的Hib -P2CRM197A結合物與 不帶萬能表位肽P2的蛋白載體合成的Hib - CRM197A結合物比較，該結合物的Hib多糖抗 體滴度提高了 3 - 5倍。
[0024] 本發明採取的技術方案如下：
[0025] -種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特徵在於：
[0026] 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 QYIKANSKFIGITEL (簡稱P2)，通過基因重組工程菌來生產含有P2的CRM197A蛋白載體（簡 稱 P2CRM197A);
[0027] 步驟二：流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵形式連接至P2CRM197A蛋白載體形 成流行性嗜血桿菌b型多糖-P2CRM197A結合物。
[0028] 進一步，在所述含有P2CRM197A的蛋白載體中含有X個P2，l彡X彡3。
[0029] 進一步，在P2CRM197A蛋白載體中，P2連結在CRM197A蛋白的N -末端或C -末端， 或者同時連接在N -末端和C -末端。
[0030] 進一步，在P2CRM197A的蛋白載體中，P2與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基 酸序列進行連接的。
[0031] 進一步，所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
[0032] 進一步，所述流行性嗜血桿菌b型多糖是通過培養流行性嗜血桿菌b型菌獲得的 莢膜多糖。 【具體實施方式】
[0033] 下面舉例說明本發明的具體實施方法，但不局限於以下實例。
[〇〇34] 本發明的實施方法是用基因重組的方法，在大腸桿菌工程菌表達系統中，對 CRM197A蛋白載體和帶有萬能表位肽P2的CRM197A蛋白載體進行表達並純化；然後，將流 行性嗜血桿菌b型莢膜多糖（簡稱Hib)共價鍵地連接至P2CRM197A，製備出Hib -P2CRM197A 結合物；配製成疫苗後，免疫小白鼠，採血獲得免疫血清；用ELISA方法檢測小白鼠血清中 的多糖特異性抗體滴度，以評估多糖蛋白結合物的免疫原性。
[0035] 步驟一：蛋白載體和流行性嗜血桿菌b型莢膜多糖的製備
[0036] 為說明本發明的有效性，製備了兩種載體蛋白，即含有P2的蛋白載體P2CRM197A 和不含P2的蛋白載體CRM197A。其中，CRM197A蛋白載體是用於合成對照用流行性嗜血杆 菌b型多糖-CRM197A結合物樣品。
[0037] -、CRM197A蛋白載體和P2CRM197A蛋白載體胺基酸序列的設計
[0038] 1、CRM197A蛋白載體胺基酸序列的設計
[0039] 白喉毒素是由帶有白喉毒素基因的β噬菌體在白喉桿菌內表達，在細菌胞漿中 存在形式為多肽，由560個胺基酸組成，分子量為62, 000道爾頓。其胺基酸序列如下：
[0040] MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQG NYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTE EFIKRF⑶GASRWLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSS LSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAG ANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVD IGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPI AGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISS DSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0041] 當分泌至細菌體外前，多肽N -末端的25個引導胺基酸序列被切除掉，變成了由 535個胺基酸組成、分子量為58kD的單鏈多肽而分泌至細菌體外，其胺基酸序列如下 ：
[0042] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDffDVIRDKTKTKIESLKEH GPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKT TAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNR PAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNG RKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFF EIKS
[0043] 分泌至細菌體外的白喉毒素被酶切為A鏈和B鏈，其間由一個二硫鍵連接而形成 一個蛋白分子，這兩個多肽鏈具有不同的功能。A鏈為白喉毒素蛋白分子的N-末端片段， 分子量為21kD，由193個胺基酸組成，是白喉毒素的毒性功能部分。它是通過在真核生物細 胞漿內，將二磷酸三腺苷核糖（ADP-Ribosyl)的異檸檬酸脫氫酶（NAD+)部分轉移至延伸因 子2(ElongationFactor -2，EF -2)上，從而抑制細胞中的蛋白質合成，進而抑制細胞生長， 造成細胞傷亡。B鏈為白喉毒素蛋白分子的C -末端片段，分子量大約為37kD，由342個氨 基酸組成。B鏈的功能是識別敏感細胞表面的特異性受體，將白喉毒素吸附在敏感細胞上， 幫助A鏈進入細胞內。
[0044] 白喉毒素的A鏈具有良好的水溶性，其胺基酸序列如下：
[0045] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0046] 研究發現[3]，由於β噬菌體上的毒素基因 tox的突變，對於噬菌體的複製沒有影 響，但是，合成出來的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突變體（Cross Reactin gMaterial，CRM)，但是白喉毒素突變體的血清學免疫原性仍然和毒素相關聯。比 如，白喉毒素突變體CRM197,無白喉毒素的毒性，從胺基酸序列分析來看是由於A鏈中的第 52位胺基酸，由甘氨酸（Gly)突變成穀氨酸（Glu)，其胺基酸序列如下：
[0047] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF ⑶ GASRWLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0048] 試驗研究表明，與其它現在市場上用於肺炎球菌結合疫苗合成的蛋白載體比較， 白喉毒素變異體CRM197蛋白A鏈多肽具備以下一些優勢，如其免疫原性和白喉毒素及白喉 內毒素相關聯，分子量小，水溶性高，易於生產和進行大分子合成反應。長期的白喉類毒素 疫苗的臨床使用，已經證明其安全性和有效性。
[0049] 2、含有P2萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體胺基酸序列的設計
[0050] 將萬能表位肽P2連接至CRM197A蛋白載體上，構建出一種新的用於合成多糖蛋白 質結合物的蛋白載體。所用的萬能表位肽P2可連接至CRM197A蛋白載體的N -末端或C -末端；也可將兩個不同的萬能表位肽分別連接至CRM197A蛋白載體的N -末端或C -末端； 另一種方式是將兩個萬能表位肽自身連接，然後再連接至CRM197A蛋白載體N -末端或者 C -末端；還有一種方式是將一個萬能表位肽連接至C -末端或者N -末端，兩個自身連接的 萬能表位肽連接至另一端。
[0051] 2 - 1、含有萬能表位肽P2的P2CRM197A蛋白載體胺基酸序列的設計
[0052] 2 - 1 - 1、P2 - N -末端CRM197A蛋白載體（稱為P2 - CRM197A)胺基酸序列的設計
[0053] 通過將P2胺基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白載體的N -末端，形 成一個新的蛋白，其胺基酸序列如下：
[0054] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD W
[0055] KEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVG T
[0056] EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGN RVRR
[0057] 在P2胺基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為P2 - CRM197A蛋白載體。
[0058] 2 - 1 - 2、CRM197AC -末端-P2蛋白載體（稱為CRM197A - P2)胺基酸序列的設計
[0059] 通過將P2胺基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形 成另一種新的蛋白，其胺基酸序列如下：
[0060] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVD NENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF ⑶ GASRWLSLPFAEGSS SVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0061] 在P2胺基酸序列和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - P2蛋白載體。
[0062] 2 - 1 - 3、P2 - N -末端 CRM197AC -末端-P2 蛋白載體（稱為 P2 - CRM197A - P2) 胺基酸序列的設計
[0063] 通過將兩個P2胺基酸序列QYIKANSKFIGITEL分別加入至CRM197A蛋白載體的N -末端和C -末端，形成一種新的蛋白，其胺基酸序列如下：
[0064] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD WKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKR FGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITEL
[0065] 在P2胺基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端和C -末端之間插入了 GSGSG片 段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P2 - CRM197A - P2蛋白載體。
[0066] 2 - 1 - 4、P2P2 - N -末端 CRM197A 蛋白載體（稱為 P2 - P2 - CRM197A)胺基酸序列 的設計
[0067] 本發明通過將兩個P2胺基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身連接，然後再加入至 CRM197A蛋白載體的N -末端，形成一種新的蛋白，其胺基酸序列如下：
[0068] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVD SIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEL GLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMA QACAGNRVRR
[〇〇69] 在兩個自身連接的P2胺基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的N -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P2 - P2 - CRM197A蛋白載體。
[0070] 2 - 1 - 5、CRM197AC -末端-P2P2 蛋白載體（稱為 CRM197A - P2 - P2)胺基酸序列 的設計
[0071] 通過將兩個P2胺基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身連接，然後再加入至CRM197A蛋 白載體的C -末端，形成一種新的蛋白，其胺基酸序列如下：
[0072] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKA NSKFIGITEL
[0073] 在兩個自身連接的P2胺基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - P2 - P2蛋白載體。
[0074] 2 -1 -6、P2P2 -N -末端 CRM197AC -末端-P2 蛋白載體（稱為 P2 -P2 -CRM197A -P2) 胺基酸序列的設計
[0075] 通過將兩個P2胺基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身連接，然後再加入至CRM197A蛋 白載體的N -末端；另外，將一個P2加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形成另一種新的 蛋白，其胺基酸序列如下：
[0076] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVD SIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEL GLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMA QACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0077] 在兩個自身連接的P2胺基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P2 - P2 - CRM197A - P2蛋白載體。
[0078] 2 -1 -7、P2 -N -末端 CRM197AC -末端-P2P2 蛋白載體（稱為 P2 -CRM197A -P2 -P2) 胺基酸序列的設計
[0079] 通過將一個P2胺基酸序列QYIKANSKFIGITEL連接至CRM197A蛋白載體的N -末 端；另外，將兩個P2進行自身連接，然後再加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形成另一 種新的蛋白，其胺基酸序列如下：
[0080] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD WKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKR FGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0081] 在兩個自身連接的P2胺基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P2 - CRM197A - P2 - P2蛋白載體。
[0082] 二、CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0083] 1、CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0084] 從GenBank獲取CRM197蛋白完整胺基酸序列PRF:224021，確定CRM197蛋白的A 鏈片段，CRM197的胺基酸1 - 193為CRM197的A鏈片段。以此為依據，對該片段的胺基酸 的核酸序列進行優化，以便在大腸桿菌表達系統中高效表達。採用自製的表達質粒，用Ndel 酶識別質粒位點CATATG，Bam HI酶識別位點GGATCC。經過CRM197A的基因序列進行分析， 在序列內，無制61及8&111!11酶切位點。0^1974蛋白基因合成序列如下 ：
[0085] CATATG
[0086] GGTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT
[0087] CATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA
[0088] GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT
[0089] GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG
[0090] GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA
[0091] ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG
[0092] GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT
[0093] GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA
[0094] GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA
[0095] TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AA
[0096] GGATCC
[0097] 向空白質粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR產物中，分別加入Nde I酶和Bam HI酶進行雙酶切反應；純化後，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成後純化表達質 粒，並用PCR鑑定體系及酶切圖譜進行鑑定。用BL21(DE3)感受態細胞，將表達質粒轉化 至細胞內，篩選克隆。獲得陽性表達工程菌後，建立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存 於-20°C以下冰箱中。
[0098] 2、含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0099] 2 - 1、P2 - CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[〇1〇〇] 採用自製的空白表達質粒，用Ndel酶識別質粒位點CATATG，Bam HI酶識別位點 GGATCC。經過P2CRM197A蛋白載體基因序列進行分析，在序列內，無 Nde I及BamHI酶切位 點。P2 - CRM197A基因合成全序列如下：
[0101] CATATG
[0102] CAATACATCA AGGCGAACAG CAAATTCATC GGCATCACGG AACTGGGCTC GGGCTCTGGC
[0103] GTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT
[0104] ATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA
[0105] GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT
[0106] GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG
[0107] GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA
[0108] ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG
[0109] GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT
[0110] GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA
[0111] GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA
[0112] TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AA
[0113] GGATCC
[0114] 向空白質粒和合成的P2CRM197A蛋白基因的PCR產物中，分別加入Nde I酶和Bam HI酶進行雙酶切反應；純化後，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成後純化表達質 粒，並用PCR鑑定體系及酶切圖譜進行鑑定。用BL21(DE3)感受態細胞，將表達質粒轉化至 細胞內，篩選克隆，並用PCR鑑定體系及酶切圖譜進行鑑定。獲得陽性表達工程菌後，建立 種子庫，包括主種子和工作種子。儲存於-20°C以下冰箱中。
[0115] 2 - 2、P2 - CRM197A - P2蛋白載體表達質粒的構建
[0116] 採用自製的表達質粒，用Nde I酶識別質粒位點CATATG，Bam HI酶識別位點 GGATCC。經過P2 - CRM197A - P2蛋白基因序列進行分析，在序列內，無 Nde I及Bam HI酶 切位點。P2CRM197AP2基因合成全序列如下：
[0117] CATATG
[0118] CAATACATCA AGGCGAACAG CAAATTCATC GGCATCACGG AACTGGGCTC GGGCTCTGGC
[0119] GTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT
[0120] ATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA
[0121] GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT
[0122] GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG
[0123] GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA
[0124] ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG
[0125] GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT
[0126] GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA
[0127] GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA
[0128] TATATGGCTC AGGCGTGTGCGGGCAATCGC GTCCGTCGCT AAGGCTCGGG CTCTGGCCAA
[0129] TACATCAAGG CGAACAGCAA ATTCATCGGC ATCACGGAAC TG
[0130] GGATCC
[0131] 將空白質粒和合成的P2-CRM197A-P2基因的PCR產物中，分別加入Nde I酶和 Bam HI酶進行雙酶切反應；純化後，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成後純化表 達質粒，並用PCR鑑定體系及酶切圖譜進行鑑定。用BL21(DE3)感受態細胞，將表達質粒轉 化至細胞內，篩選克隆，並用PCR鑑定體系及酶切圖譜進行鑑定。獲得陽性表達工程菌後， 建立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存於-20°C以下冰箱中。
[0132] 2 - 3、CRM197A - P2、P2 - P2 - CRM197A、CRM197A - P2 - P2、P2 - P2 - CRM197A - P2、 以及P2 - CRM197A - P2 - P2蛋白載體表達質粒的構建
[0133] 方法和上節"2 - UP2CRM197A蛋白載體表達質粒的構建"相同。
[0134] 三、含有萬能表位肽P2CRM197A蛋白載體和CRM197A蛋白載體的製備
[0135] 本發明的實驗結果表明，CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載 體的特性相似，因此，這些蛋白載體的純化方法相似，以下以含有P2萬能表位肽的CRM197A 蛋白載體為例說明方法。
[0136] 1、表達含有萬能表位肽P2CRM197A蛋白載體工程菌的製備
[0137] 用分子生物學標準方法將各個表達蛋白載體的質粒轉入至感受態細胞內，並進行 表達檢定。篩選出蛋白表達量高，並且通過用抗血清檢定合格的克隆，建立主種子庫和工作 種子庫。
[0138] 2、含有萬能表位肽P2CRM197A蛋白載體表達工程菌的發酵
[0139] 從大腸桿菌工程菌工作種子庫低溫冰箱中，取出一支含有萬能表位肽P2CRM197A 蛋白載體的工作種子管，在室溫下解凍；將種子管中的菌液無菌轉移至50毫升的培養基 中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養至0D_ = 1. 0左右；將菌液無菌接種至1升培養 基中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養至0D_= 1.0左右；接種種子液至50升發酵罐 中的20升培養基中，在37°C下，240rpm條件下進行發酵；當006。。至7 - 8時，加入IPTG誘 導重組蛋白在細菌中合成；發酵至14小時後，停止發酵，離心，收集菌體待用。
[0140] 3、含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體的純化
[0141] 由於構建含有不同萬能表位肽的蛋白載體都是以CRM197A為主體，實驗表明，盡 管加入了萬能表位肽，但對蛋白純化的參數影響不大，只需要在純化CRM197A蛋白載體的 工藝參數上進行一些修飾，就可建立起其他含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載體的純化方 法。
[0142] 稱重50g溼菌體於2升離心杯中，加入300mllxPBSpH7. 0的緩衝液混懸菌體，在磁 力攪拌器上攪拌混勻30min ;在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清，收集菌體；重複該步驟 兩次；加入300mllxPBSpH7. 0至菌體離心管，在均質機上進行破碎；在4°C下，lOOOOrpm，離 心20min，收集沉澱，棄上清液；加入300mll XPBSpH7. 0緩衝液，在磁力攪拌器上攪拌30min ; 在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清液，收集包涵體；加入900ml變性緩衝液至洗漆後的 包涵體，在25°C下，lOOOOrpm，離心30min，收集上清液，棄沉澱；將離心上清液轉移至6 -8KD 透析袋中，封閉透析袋；置透析袋於10升復性緩衝液1中，室溫下，在磁力攪拌器上攪拌透 析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩衝液2中，室溫攪拌透析8 - 10小時；將透析袋轉 入10升復性緩衝液3中，室溫攪拌透析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩衝液4中，室 溫攪拌透析8 -10小時；將透析袋轉入10升復性緩衝液5中，室溫攪拌透析過夜；次日將透 析袋轉入2升儲備緩衝液中，室溫攪拌透析8 - 10小時；更換儲備緩衝液二次，室溫透析過 夜；取lml透析液，室溫12000rpm離心10min,收集上清，測蛋白質濃度；將蛋白溶液上樣至 預先平衡的DEAE膠柱，用等梯度洗脫，並收集目的蛋白峰；然後上樣至Phenyl疏水柱進一 步純化，收集洗脫峰；最後上樣SP膠柱，收集洗脫峰；將收集獲得的純化目的蛋白轉至透析 袋中，在0. 15M的氯化鈉中透析，完成後轉移至4°C下儲存待用。
[0143] 四、流行性嗜血桿菌b型菌莢膜多糖的製備
[0144] 1、種子庫的建立
[0145] 取出流行性嗜血桿菌b型菌株作為原始種子株，加入0. 5ml的培養基將菌種混勻， 取0.25ml菌液於5%兔血培養液中。接種後的5%兔血培養液管置於36°C ±1°C的培養搖 床上，搖速120rpm，培養12 - 20小時。待0D6(KI至1. 0時，用接種環將5%羊血培養液接種 至培養基平皿上，置於36°C ±1°C的培養箱內培養12 - 20小時。用接種環將瓊脂平皿上 的1至數個菌落接種於l〇ml的培養液中，置於36°C ±1°C，在培養搖床上培養12小時，搖 速150 - 200rpm。培養液中細菌0D6QQ長到1. 0,取出5ml細菌培養液接種到200ml的新鮮 培養液中，置於36°C ±1°C的培養搖床上培養12小時左右，搖速150 -200rpm。0D6QQ至1. 0 時，將細菌培養液以lml分裝於200個小試管中，離心（4000rpm，10min)，去除上清培養液， 然後加入0.5ml的新鮮培養液和0.5ml的無菌脫脂牛奶，混勻，在乙醇乾冰上快速冷凍。真 空凍幹，編號，作為主種子批保存於4°C冰箱內。取出主種子批建立，按照主種子建立方法， 將細菌培養液接種到另一個200ml的新鮮培養液中，置於36°C ±1°C的培養搖床上培養12 小時左右，搖速150 -200rpm。待0D_至1. 0時，將細菌培養液以lml分裝於200個小試管 中，離心（4000rpm，10min)，去除上清培養液，然後加入0. 6ml的新鮮AHC培養液和0. 4ml的 40%甘油溶液，混勻。速凍於乾冰上，作為工作種子保存於-70°C低溫冰箱中。
[0146] 2、細菌發酵
[0147] 將流行性嗜血桿菌b型工作種子接種到平皿培養基上，在36. 5°C培養箱過夜。取 一個Hib菌斑，接種到5毫升的新鮮基本培養液中，在36. 5°C和300rpm細菌培養搖床培養。 當接種的培養液達到了指數生長中期，0D為0. 6 - 1. 0,將接種的培養液轉接到250毫升培 養瓶中，其中有45毫升的新鮮基本培養液，在36. 5°C和300rpm細菌培養搖床培養。當接 種的培養液達到了指數生長中期，0D為0. 6 -1. 0,將接種的培養液轉接到4升培養瓶中，其 中有1升的新鮮基本培養液，在36. 5°C和300rpm細菌培養搖床培養。當接種的培養液達 到了指數生長中期（約16 - 18小時），0D為0. 6 - 1. 0,將接種的培養液轉接到發酵罐中， 其中有20升的新鮮基本培養液。當Hib細菌達到指數生長中期時，加入新鮮基本培養液和 補充培養液，最終培養液中的糖濃度為23g/l，所加入的新鮮補充培養液的總體積為25升。 培養14. 5小時停止發酵。
[0148] 3、多糖純化
[0149] 將Hib培養液離心沉澱的Hib菌體，懸浮在2升的蒸餾水中，用磁力攪拌器混勻。 加入200ml的12% Deoxycholatesodium溶液至細菌懸浮液中，攪拌混勻30分鐘，然後轉 入到10°C ±3°C冷櫃中攪拌8-24小時，保證菌體完全裂解、多糖釋放出來。用50%的醋 酸調節細菌裂解液的pH值到6. 4 - 6. 8,溫度為20°C ±5°C，停止攪拌，靜置12 - 24小時。 以10, OOOrpm離心1小時，收集上清液，丟棄沉澱物，用0. 05M的磷酸鹽pH7. 0透析多糖上 清液。加入等體積的〇. 2% HB溶液，用磁力攪拌器混勻30分鐘，然後，轉入到4°C冷櫃中靜 置過夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉澱，丟棄上清液，加入100ml的0. 5M氯化鈉溶液 溶解沉澱；加入680ml無水乙醇，混勻，然後，轉入到4°C冷櫃中靜置過夜。以10, OOOrpm離 心30min，收集上清液，丟棄沉澱，加入5. 2升無水乙醇，混勻，然後，轉入到4°C冷櫃中靜置 過夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉澱，丟棄上清液，加入500ml的蒸餾水溶解沉澱，透 析、凍幹。
[0150] 步驟二：Hib - P2CRM197A結合物的製備及免疫原性的評估
[0151] 多糖蛋白結合物的合成包括含有萬能表位肽P2的Hib -P2CRM197A結合物和不含 萬能表位肽P2的Hib - CRM197A結合物的合成，兩種結合物的合成方法相同。本發明合成 的含有P2萬能表位肽的Hib - P2CRM197A結合物包括：
[0152] Hib - P2 - CRM197A、Hib - CRM197A - P2、Hib - P2 - CRM197A - P2、 Hib - P2 - P2 - CRM197A、Hib - CRM197A - P2 - P2、Hib - P2 - P2 - CRM197A - P2 和 Hib - P2 - CRM197A - P2 - P2〇
[0153] l、Hib - P2CRM197A多糖蛋白結合物的合成
[0154] 稱取5mg純化Hib莢膜多糖於反應瓶中，量取0. 5ml的lmol/LNaCl加入反應瓶 中，磁力攪拌使多糖完全溶解，記錄多糖溶液的初始pH。分別量取適量的CDAP溶液，加入 反應瓶中，室溫下攪拌反應1. 5min，30s時測定溶液的pH。1. 5min後，用0. 2mol/LNa0H調 節溶液的pH至9. 5,室溫下攪拌反應3min (用(λ 2mol/LNa0H維持pH在9. 5)。3min後立 即向反應瓶中加入5mg的P2CRM197A蛋白，在室溫下（25°C)攪拌反應lh。量取37. 5μ的 12mol/L賴氨酸加入反應瓶中，用0. 1Μ的HC1調節溶液pH至9. 0,室溫下攪拌反應30min， 將反應瓶轉移到4°C下反應過夜。將反應混合物轉移至透析袋（MWC06 -8000)中，在4°C下， 用0. 85% NaCl溶液透析3次，6L/次。透析結束後將反應混合液lOOOOrpm，離心10min後 取上清液，採用SepharoseCL - 4B凝膠柱純化透析後的多糖結合物，並收集結合物峰，取樣 送檢。
[0155] 2、免疫用Hib - P2CRM197A結合疫苗的製備
[0156] 分別將Hib - CRM197A和Hib - P2CRM197A結合物純化液進行稀釋，至多糖濃度約 為250 μ g/ml，用0. 22 μ m膜除菌過濾，加入無菌磷酸鋁膠，最終鋁離子濃度為125mg/ml ;用 緩衝液定容至最終體積；灌裝，〇. 5ml/瓶。
[0157] 3、結合疫苗免疫及採血
[0158] 取5 - 6周的KM57系小鼠240隻，每支小鼠免疫注射製備的7種Hib - P2CRM197A 結合疫苗，注射容量為〇. lml/支小鼠/次。每種結合疫苗設定為三組，即免疫注射一針、二 針和三針。
[0159] 採集小鼠血液至離心管，在室溫下靜置2小時，在lOOOOrpm條件下離心10分鐘， 用移液槍小心吸取離心上清血清，儲存於4°C冰箱中，待檢。
[0160] 4、ELISA法檢測小鼠血清中Hib多糖抗體IgG滴度及結合物免疫原性的評估
[0161] 配製Hib莢膜多糖儲備液lmg/ml (1XPBS溶液中），存儲於冰箱中。用包被緩衝液 稀釋至4 μ g/ml,加100 μ 1包被溶液到每一個孔中來包被ELISA板，在室溫下孵育過夜。用 洗板緩衝液洗4次，加入100 μ 1封閉緩衝液，在室溫下孵育2小時，用洗板緩衝液洗4次， 可在4°C下保存一周。
[0162] 將小鼠注射結合疫苗及對照樣品獲得的待測血清，以1:10稀釋成工作樣品血清， 稀釋適當倍數，加入到ELISA板第一排孔內，總體積200 μ 1，從第一排開始向下進行二倍系 列稀釋，在室溫下孵育2小時。用洗板緩衝液洗4次，加入100 μ 1鹼性磷酸酶標記羊抗鼠 抗體（1:2000稀釋），在室溫下孵育4小時。用洗板緩衝液洗4次，加入100 μ 1磷酸-4 -硝基苯酯二鈉鹽底物溶液，在405nm讀盤。
[0163] 下表為小鼠結合物免疫血清中多糖IgG抗體滴度結果表：
[0164]
【權利要求】
1. 一種增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特徵在於： 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 QYIKANSKFIGITEL (簡稱P2)，通過基因重組工程菌來生產含有P2的CRM197A蛋白載體（簡 稱 P2CRM197A); 步驟二：將流行性嗜血桿菌b型多糖通過共價鍵形式連接到P2CRM197A蛋白載體上形 成流行性嗜血桿菌b型多糖-P2CRM197A結合物。
2. 根據權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特徵在於：在所述的P2CRM197A蛋白載體中含有X個P2,1彡X彡3。
3. 根據權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特徵在於：在P2CRM197A蛋白載體中，P2連結在CRM197A蛋白的N -末端或C -末端，或 者同時連接在N-末端和C-末端。
4. 根據權利要求1、2或3所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的 方法，其特徵在於：在P2CRM197A的蛋白載體中，P2與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基 酸序列進行連接的。
5. 根據權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特徵在於：所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
6. 根據權利要求1所述的增強流行性嗜血桿菌b型多糖蛋白結合物免疫原性的方法， 其特徵在於：所述流行性嗜血桿菌b型多糖是通過培養流行性嗜血桿菌b型菌獲得的莢膜 多糖。
【文檔編號】A61K47/48GK104096228SQ201410199354
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年5月11日 優先權日:2014年5月11日
【發明者】李建平 申請人:江蘇康泰生物醫學技術有限公司