具有協同抗癌增效的還原響應磁性載藥納米粒子及其製備方法與流程
2023-07-11 20:58:46 1
本發明涉及一種具有協同抗癌增效的還原響應磁性載藥納米粒子及其製備方法，屬於醫藥技術領域。
背景技術：
在傳統意義上的抗癌化學治療中，小分子藥物常出現對正常組織的高毒性，易被網狀內皮系統清除(RES)，無法避免細胞內帶來的屏蔽效應所導致的藥物利用度低，毒副作用大等不良影響；而對於小分子藥物本身所具有的水溶性低，穩定性差和容易造成耐藥性等缺陷，都成為化學藥物治療中難以逾越的鴻溝。在近些年的抗癌研究中，針對上述問題，納米粒子作為一種新型載體，已受到醫學界的廣泛關注，其特殊的尺寸帶來的增強滲透滯留(EPR)效應，對於小分子藥物的良好封裝，以及具有選擇性富集於病灶部位等特點，在有效殺死腫瘤細胞的同時，極大地避免了治療時所帶來的毒副作用。
利用人體內的微環境差異，特別是正常組織與癌症組織和癌症細胞間還原性物質的濃度差異性，設計具有還原響應性的載藥體系，可實現藥物在腫瘤部位的選擇性釋放，從而獲得腫瘤細胞內增強的藥物控釋行為，提高藥物對腫瘤的療效。目前，藥物載體大多利用物理包埋、靜電複合等方法對藥物進行負載。由於載體與藥物間作用力較弱，藥物通常會在體循環中提前釋放或暴釋，從而使藥物利用度降低且對正常組織造成傷害，產生較大的毒副作用。此外，單藥物載體存在給藥量大，容易造成耐藥性等缺點。
技術實現要素：
本發明的目的是針對上述現有技術中存在的問題，提供一種具有協同抗癌增效的還原響應磁性載藥納米粒子及其製備方法，該載藥納米粒子具有在靶向區域特異響應性、協同增效、低毒副作用等優點。
為實現上述目的，本發明採取的技術方案是：
一種具有協同抗癌增效的還原響應磁性載藥納米粒子，其特徵在於，所述載藥納米粒子的製備原料包括：雙硫鍵連接的高分子藥物前體和無機納米粒子；其中，所述無機納米粒子包括表面氨基化的超順磁性四氧化三鐵納米粒子(SPION-NH2)和以含氨基的高聚物為模板的氨基化硒納米粒子(NH2-R-SeNPs)。
按上述方案，優選地，所述雙硫鍵連接的高分子藥物前體和所述無機納米粒子的質量比為1:0.5～3。
按上述方案，優選地，所述無機納米粒子中，所述表面氨基化的超順磁性四氧化三鐵納米粒子與所述以含氨基的高聚物為模板的氨基化硒納米粒子的質量比為1:0.5～3。
按上述方案，優選地，所述雙硫鍵連接的高分子藥物前體由下述方法製備得到：1)將氨基巰基試劑與帶羧基的高聚物進行醯胺化反應，得到巰基化高分子衍生物；2)將巰基羧基試劑與帶氨基的抗癌藥物進行醯胺化反應，得到巰基修飾的藥物；3)在室溫下，將步驟1)得到的巰基化高分子衍生物與步驟2)得到的巰基修飾的藥物，在氧化劑作用下進行形成雙硫鍵的反應，將所得粗產物在pH5.5的HCl溶液中透析四次後，再使用超純水透析一次，得到雙硫鍵連接的高分子藥物前體。優選地，所述氨基巰基試劑選自半胱胺鹽酸鹽，11-巰基十一胺鹽酸鹽、氨基聚乙二醇巰基中任一種；所述帶羧基的高聚物選自海藻酸鈉，透明質酸，羧甲基纖維素，羧甲基甲殼素中任一種；所述巰基羧基試劑選自巰基PEG羧基、巰基乙酸、巰基丙酸、巰基丁酸、半胱氨酸中任一種；所述帶氨基的抗癌藥物選自阿黴素、甲氨蝶呤、絲裂黴素、羥基脲、博來黴素中任一種；所述氧化劑為空氣、氧氣、過氧化氫中任一種。優選地，所述氨基巰基試劑的氨基與所述帶羧基的高聚物的羧基的摩爾比為(1.2～1.8):1；所述巰基羧基試劑的羧基與所述帶氨基的抗癌藥物的氨基的摩爾比為(0.8～1.1):1；所述巰基化高分子衍生物的巰基與所述巰基修飾的藥物的巰基的摩爾比為(0.9～1.1):1；所述巰基修飾的藥物與所述氧化劑的摩爾比為(0.9～1.1):1。
按上述方案，優選地，所述以含氨基的高聚物為模板的氨基化硒納米粒子由下述方法製備得到：將含氨基的高聚物和亞硒酸鈉在反應介質中混合，在加入還原劑的條件下，攪拌反應體系，將反應得到的粗產物透析、離心，取上層清液，得到以含氨基的高聚物為模板的氨基化硒納米粒子分散液。優選地，在所述反應體系中所述含氨基的高聚物的質量濃度為0.5～3.0mg/mL，所述的含氨基的高聚物與亞硒酸鈉的質量比為1:10～20，所述亞硒酸鈉和還原劑的摩爾比為1:2～4。優選地，所述含氨基的高聚物選自殼聚糖、聚賴氨酸中的任一種；所述反應介質為醋酸溶液；所述還原劑為抗壞血酸。優選地，所述攪拌時間為12h，所述透析所用的介質為超純水。
本發明還提供了上述具有協同抗癌增效的還原響應磁性載藥納米粒子的製備方法，其特徵在於，包括下述步驟：
1)將表面氨基化的超順磁性四氧化三鐵納米粒子溶液和以含氨基的高聚物為模板的氨基化硒納米粒子分散液混合，調節溶液pH值為4.5～5.5；
2)將含有雙硫鍵連接的高分子藥物前體用超純水溶解，調節溶液pH值為5；
3)將步驟1)得到的溶液滴加至步驟2)得到的溶液中，調節體系的pH值為7.4，再在常溫下攪拌溶液10～14h，得具有協同抗癌增效的還原響應磁性載藥納米粒子。
本步驟的反應原理為：將SPION-NH2，NH2-R-SeNPs和雙硫鍵連接的高分子藥物前體混合，利用高分子結構中的羧基與兩種無機納米粒子表面的氨基間的靜電相互作用，進行自組裝，得到具有協同抗癌增效的還原響應磁性載藥納米粒子。
相比於現有技術，本發明的優點是：
1.本發明以天然高分子為原料，將抗癌藥物通過雙硫鍵鍵合於高分子側鏈，合成具有還原響應性的高分子藥物前體；同時在帶氨基的高聚物模板中通過抗壞血酸還原亞硒酸鈉，得到氨基化硒納米粒子；最後，通過高分子藥物前體與含氨基的無機納米粒子(硒納米粒子和四氧化三鐵納米粒子)間形成靜電相互作用，成功製備出納米級尺寸、粒徑均一且穩定、具有超順磁響應性以及還原響應性的載藥納米粒子。
2.本發明化學反應條件溫和，原料毒副作用低，通過雙硫鍵鍵合的方式實現對藥物的包載，有效避免在正常生理環境中的暴釋和藥物洩露從而導致的不良效應；同時雙硫鍵的使用保證藥物釋放具有強的還原敏感釋放性，實現藥物在癌細胞內的還原性環境的還原響應性並大量快速釋放。
3.硒納米粒子具有顯著的抗氧化效果，能有效清除癌細胞內的過剩自由基和過氧化物。同時，大量文獻也證明硒能使癌細胞處於敏感狀態，使得藥物能夠更有效地發揮作用，從而使硒在抗耐藥癌細胞中得到應用。本發明利用納米硒獨有的抗癌作用，與抗癌藥物聯用協同抗癌增效，相比於單載抗癌藥物的載體，極大地提高了載藥粒子對於癌細胞的抑制作用。
4.本發明製得的載藥納米粒子還可以實現在外源磁場作用下的在病灶部位的主動靶向，可以進一步實現磁性增效作用，從而提高治療效果，降低毒副作用。
5.通過抗癌藥物與納米硒聯用協同抗癌作用以及磁性增效作用，本發明可實現在減少抗癌藥物的劑量的同時達到更高的抗癌效果。
附圖說明
圖1為實施例1合成的磁性載藥納米粒子的透射電鏡(TEM)圖(如圖1-a所示)和粒徑分布曲線圖(如圖1-b所示)。
圖2為實施例1合成的磁性載藥納米粒子在磁鐵作用下隨時間的磁泳動行為的對比照片(如圖2-a所示)和所述磁性載藥納米粒子的M-H磁化曲線(如圖2-b所示)。
圖3為實施例1合成的磁性載藥納米粒子在體外的藥物釋放性能曲線。
圖4為在實施例1合成的磁性載藥納米粒子(MSDAN-gel)以及阿黴素和納米硒的作用下的細胞相對活性曲線(如圖4-a和4-b所示)、所述磁性載藥納米粒子中納米硒和阿黴素兩者間的協同抗癌效果圖(如圖4-c所示)以及在不載藥凝膠作用下的細胞相對活性曲線(如圖4-d所示)。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例1
製備磁性含硒的雙硫鍵鍵合的載藥納米粒子，包括下述步驟：
1、製備殼聚糖模板納米硒(CS-SeNPs)儲備液：
將24mg殼聚糖溶於10mL醋酸(w/v,1％)，得到濃度為2.4mg/mL殼聚糖(CS)溶液。稱量1.4g(8mmol)抗壞血酸(VC)溶於10mL超純水，得到VC溶液。稱量346mg(2mmol)亞硒酸鈉溶於10mL超純水，得到濃度為200mmol/L的亞硒酸鈉溶液。然後將配製好的CS溶液和亞硒酸鈉溶液放入燒杯中，經磁力攪拌混合均勻後，將VC溶液緩慢滴加完畢後用保鮮膜封口並繼續攪拌。溶液顏色由澄清的淡黃色逐漸變為濃稠的暗紅色。攪拌12h後，得到粗產品。之後將其放入透析袋(MWCO 14000)在超純水中透析5遍後，放入高速離心機中，以常溫1500rpm的條件離心10min，取出上層清液繼續以同樣條件離心，得到殼聚糖模板納米硒(CS-SeNPs)分散液。
2、參照文獻(Biomaterials,2009,30:4716-4722)方法合成具有表面氨基化的超順磁性四氧化三鐵納米粒子(SPION-NH2)。
3、參照文獻(J.Mater.Chem B,2015,3:8949-8962)方法合成雙硫連結的海藻酸鈉藥物前體(SA-SS-DOX)，將所得溶液凍幹後，得到SA-SS-DOX固體。
4、將3mg的SA-SS-DOX溶於6mL的超純水加入三口燒瓶中，用HCl將其pH調至5；再將2mL質量濃度為1.2mg/mL的SPION-NH2和2mL質量濃度為1.8mg/mL的CS-SeNPs的分散液混合均勻，用HCl溶液調節pH至5，緩慢滴加入三口燒瓶中的SA-SS-DOX溶液中。攪拌均勻後，將總體系溶液的pH用NaOH溶液調至7.4，得到磁性含硒的雙硫鍵鍵合的載藥納米粒子，其性狀為納米凝膠的分散體系。
按照下述方法對本實施例合成的磁性載藥納米粒子進行性能測定，包括粒徑測定、磁性測定、體外藥物釋放測定和細胞學評價。
1、粒子形貌和粒徑測定
採用透射電鏡(TEM)觀察本實施例所製備的磁性載藥粒子的形貌和尺寸分布情況，結果如圖1-a所示。可見製備的粒子形貌均一且穩定，能明顯觀察到硒和鐵兩種無機納米粒子同時存在於磁性載藥粒子中。
採用雷射粒度儀(DLS)測試本實施例所製備的磁性載藥粒子的粒徑，結果如圖1-b。所測得粒徑大小為166.4±12.7nm，與透射電鏡結果相符。
2、磁性測定
將磁性載藥粒子置於永磁體旁放置12h，觀察磁性載藥粒子隨時間的磁泳動行為，結果如圖2-a；在298K下，採用電磁鐵振動樣品磁強計(VSM)測定載藥粒子的超順磁特性，結果見2-b所示。可見，所製備的納米藥物載體具有良好的磁性，可快速在磁體附近富集；且該納米藥物載體無明顯磁滯，具有超順磁性，且飽和磁強度達到37.2emu/g Fe。
3、體外藥物釋放測定
將2mL的本實施例所製備的磁性載藥粒子分別放入14KDa透析袋中，並將其分別放入含有濃度分別為0、2μmmol/L、2mmol/L和10mmol/L穀胱甘肽(GSH)的磷酸鹽緩衝液中，模擬載體在正常組織與腫瘤還原性環境下的藥物釋放行為。間隔一定時間取出定量的透析液，通過確定透析液中藥物的濃度，從而計算出不同時間的累計釋放量，結果如圖3所示。
結果表明該載體具有強烈的還原敏感性，在含有高濃度還原劑的環境液中，使藥物大量釋放，而在低濃度還原劑的環境液中，雙硫鍵鍵合的方式對藥物則有很好的保護作用，不會使其爆釋。
4、細胞學評價
以人類宮頸癌細胞(HeLa細胞)為模型，通過四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)對納米硒，阿黴素和載藥粒子進行細胞學上的評價,如圖4-a和4-b。並通過等效線圖解法分析載藥粒子中納米硒和阿黴素兩者間的協同抗癌效果，結果如圖4-c，硒納米粒子的引入使得載藥凝膠的毒性大大增強，起到了與阿黴素協同增效的功能。同時不載藥凝膠基本無毒，如圖4-d。
實施例2
1、製備聚賴氨酸模板納米硒(PAM-Se NPs)分散液：
首先將20mg聚賴氨酸溶於10mL去離子水，得到濃度為2.0mg/mL聚賴氨酸溶液。稱量1.4g抗壞血酸(VC)溶於10mL超純水，得到VC溶液。稱量346mg亞硒酸鈉溶於10mL超純水，得到亞硒酸鈉溶液。先將配製好的聚賴氨酸溶液和亞硒酸鈉放入燒杯中，經磁力攪拌混合均勻後，將VC溶液緩慢滴加完畢後用保鮮膜封口並繼續攪拌。溶液顏色由澄清的淡黃色逐漸變為濃稠的暗紅色。攪拌12h後，得到粗產品。之後將其放入透析袋(MWCO 14000)在超純水中透析，放入高速離心機中，以常溫1500rpm的條件離心10min，取出上層清液繼續以同樣條件離心提純，直至得到無沉澱出現的分散液，作為聚賴氨酸模板納米硒(PAM-Se NPs)分散液。
2、參照文獻(Biomaterials,2009,30:4716-4722)方法合成具有表面氨基化的超順磁性四氧化三鐵納米粒子(SPION-NH2)。
3、參照專利(申請號201510427070.X)方法合成雙硫連結的透明質酸藥物前體：雙硫交聯的阿黴素鍵合透明質酸(HA-SS-DOX)，將所得溶液凍幹後，得到HA-SS-DOX固體。
4、將3mg的HA-SS-DOX溶於6mL的超純水加入三口燒瓶中，用HCl將其pH調至5。再將2mL，1.2mg/mL的SPION-NH2和2mL，1.8mg/mL的PAM-Se NPs均勻混合後的分散液pH調至5，緩慢滴加入三口燒瓶中。待攪拌均勻後，將總體系溶液的pH調至7.4，反應12h。得到磁性含硒的雙硫鍵鍵合的載藥納米粒子。