空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養方法
2023-07-11 03:12:06
專利名稱：空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養方法
技術領域：
本發明涉及一種空腸彎曲桿菌的分離培養方法，具體涉及一種人獸共患病 病原一空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養方法。屬於醫學微生物技術領域。
技術背景空腸彎曲桿菌(Campylobaderjejuni)是彎曲桿菌屬的一種。空腸彎曲桿菌在 自然界廣泛存在,嚴重威脅人畜健康，是近十幾年受到國內外學者廣泛重視的一 種人獸共患病原菌。空腸彎曲桿菌感染現已成為全球範圍內急性胃腸炎最常見 的病因之一，在發展中國家，空腸彎曲桿菌是兒童腹瀉死亡的重要病原，也是 發展中國家旅行者腹瀉的最常見原因，最嚴重的併發症是外周神經系統的急性 脫髓鞘疾病-格林巴利綜合症。建立一套有效的分離培養和鑑定方法對於確定空 腸彎曲桿菌的感染狀態具有重要意義。空腸彎曲桿菌為微需氧菌，較為脆弱，對乾燥、加熱、消毒、酸性和21% 氧氣的空氣都敏感，因此其培養條件也較為苛刻，尤其是需要5%氧、10%二氧 化碳、85%氮的微需氧環境，且具有"非可培養狀態"，能在環境條件不良時進入 低代謝活力的休眠狀態，存活但不增殖，在常規的分離培養中檢出率很低。微需 氧條件的創造難度較高，國內目前培養該菌的專用設備少而且價格昂貴，不易 基層推廣。 一般採用的燭缸法降低氧壓培養該菌，效果不理想，檢出率偏低。 因此對微需氧條件的優化已成為空腸彎曲桿菌培養急需解決的問題。普通培養基上空腸彎曲桿菌一般生長不良，生長需要含有萬古黴素、多黏 菌素B和三甲苄氨嘧啶等抗菌藥物的血液瓊脂培養基。現在國內普遍用改良 Camp—BAP培養基和Skirrow氏培養基作為空腸彎曲桿菌的選擇性培養基。國 內報導的培養方法有燭缸法、厭氧袋、厭氧手套箱、厭氧盒、生物耗氧法和焦 性沒食子酸法等。以上方法存在或對實驗條件要求高、或材料不易得到、或檢 出率低等問題。因此，尋找一種低成本且對實驗條件要求不高、培養效果好的
培養方法，對空腸彎曲桿菌的培養和監測、控制都有著重要意義。 發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種空腸彎曲桿菌的微需氧 分離培養方法，成本低廉、操作簡單,空腸彎曲桿菌的檢出率高、培養效果好。
為實現上述目的，本發明採用普通燭缸法與焦性沒食子酸法相結合的方法 來創造微需氧環境，對空腸彎曲桿菌分離培養採用直接劃線培養法，用接菌環 挑取少量動物組織檢測樣品直接接種在選擇培養基上，用燭缸法配合焦性沒食 子酸和無水碳酸鈉混合物來降低空氣中氧氣的濃度，利用無水碳酸鈉形成鹼性 環境，促使焦性沒食子酸與氧氣反應吸收氧氣，使培養環境達到空腸彎曲桿菌 培養所需的微需氧條件。挑取分離培養獲得的典型菌落，做PCR鑑定，進一步 確定為空腸彎曲桿菌。
本發明的方法主要分以下幾步進行
1、 材料的採集無菌取動物組織裝入滅菌器皿中，作為待檢樣品。
2、 空腸彎曲桿菌的分離培養將採集的檢測樣品，直接劃線接種在選擇培 養基平板上，置於按一定比例加入焦性沒食子酸和無水碳酸鈉的磨口缸內，再 放一支點燃蠟燭於缸中央，蓋密缸蓋。燃燭自行熄滅後，連同缸一併置於溫箱中42t:培養觀察。其中，焦性沒食子酸和無水碳酸鈉的用量各為2.4-2.6g/L，兩者重量比為l: 1。
3、 觀察可疑菌落從樣品培養所得的菌落中挑取可疑菌落，其中第一型 可疑菌落不溶血，灰白色、棕黃色、扁平、溼潤、有光澤，半透明水滴狀，凸起、 光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；第二型可疑菌落也不溶血，圓形、 有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落，邊緣完整、發亮。
4、 空腸彎曲桿菌的初步鑑定將挑取的第一型可疑菌落或第二I型可疑菌 落，塗片作革蘭氏染色鏡檢，根據菌體染色特性取革蘭氏陰性菌落做氧化酶和 過氧化氫酶試驗，將氧化酶和過氧化氫酶試驗陽性者初步確定為可疑彎曲桿菌 菌落。
5、 空腸彎曲桿菌的確定採用空腸彎曲桿菌特異性PCR檢測方法，對初 步確定的可疑彎曲桿菌菌落進行檢測，對擴增出的358bpDNA片段進行測序，測
序結果是空腸彎曲桿菌特異性片段的菌落即確定為空腸彎曲桿菌。
本發明採用燭缸法配合焦性沒食子酸和無水碳酸鈉混合物來降低空氣中氧 氣的濃度，利用無水碳酸鈉形成鹼性環境，促使焦性沒食子酸與氧氣反應吸收 氧氣，使培養環境達到空腸彎曲桿菌培養所需的微需氧條件。
本發明對實驗條件的要求較低，實驗材料容易得到，具有成本低廉、操作 簡單、檢出率高、培養效果好等優點，其培養效果優於單一的燭缸法和焦性沒 食子酸法等培養方法。用本發明方法分離培養空腸彎曲桿菌，出菌時間短，得 到菌落數量多，提高了空腸彎曲桿菌的分離培養效率，解決了微需氧條件培養 空腸彎曲桿菌的難點，適合基層單位推廣應用。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明的技術方案坐進一步描述。以下實施例不構成對 本發明的限定。 實施例11、 材料的採集取雞肝臟裝入加適量滅菌生理鹽水的青黴素瓶中，無菌剪取肝臟約0.8 1.0cm3， 4C保存備用。
2、 空腸彎曲桿菌的分離培養採用直接劃線平皿培養法，將採集的雞肝臟研碎，先以0.65um的微孔濾膜過濾，然後取濾液劃皿接種在改良Camp—BAP 培養基上；將已接種細菌的平板置於容量3000mL的磨口乾燥器內。缸蓋及缸口 塗以凡士林，按每lL容積各2.6g的用量(l: 1比例)加入焦性沒食子酸和無水碳 酸鈉，混合均勻，放入小段點燃蠟燭於缸中央，蓋密缸蓋。燃燭約0.5 1 min後 自行熄滅，連同缸一併置於溫箱中42'C培養24h。
3、 觀察可疑菌落第一型菌落不溶血,灰白色、棕黃色、扁平、溼潤、有 光澤,半透明水滴狀，凸起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；第二 型菌落也不溶血,圓形、有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落(直徑為1 2 mm)，邊緣完整、發亮。
4、 空腸彎曲桿菌的初步鑑定挑取改良Camp—BAP培養基上生長出的第 一型可疑菌落，塗片作革蘭氏染色鏡檢。根據菌體染色特性，取革蘭氏陰性菌 落做氧化酶和過氧化氫酶試驗。革蘭氏陰性菌,大小為0.3 0.4pmxl.5 3^im,如
小逗點狀，兩菌體的末端相連時，呈S形、海鷗形、螺旋狀或紡錘形。氧化酶和 過氧化氫酶試驗陽性者，可初步確定為可疑彎曲桿菌菌落。5、空腸彎曲桿菌的確定採用己發表的陽成波等建立的一種空腸彎曲桿菌 特異性PCR檢測方法(中國人獸共患病雜誌,2003，19(1):91-94)，對初步確定 的可疑彎曲桿菌菌落進行檢測，確定是否為空腸彎曲桿菌。引物序列為VS- F:5，GAT ATC TAT GAT TTT ATC CTG C 3' VS- R:5，GAA TGA AAT TTT AGA ATG GGG 3'模版取上述可疑菌落，接種MH液體培養基，離心收集菌泥提取DNA，作 為PCR的模板。反應體系為2xTaqPCRMasterMix， 12.5)al，上遊引物(25,， ljil，下 遊引物，1 nl，模板DNA (1 U爾L) 2nl,無菌去離子水，8.5pl,反應體積為25 plPCR擴增條件為循環參數為94'C預變性5min, 94 °C 30S, 58 °C60S,72 °C 60S，共35個循環,最後72'C延伸10min， 4'C保存lh。PCR擴增產物的鑑定配置1%的瓊脂糖凝膠。按0.5mg/l加溴化乙錠(EB) 制膠。取5^1 PCR產物和lpl 10xloading buffer混合加樣，用DL2000 Marker對 照。90V電壓電泳40min取膠置於凝膠成像系統拍攝和分析電泳結果。結果在 358bp處出現一條清晰條帶，取PCR產物送上海捷瑞生物工程有限公司進行測 序。結果證明該PCR產物為空腸彎曲桿菌特異性DNA片段。因此，出現這一 條帶的樣品即被確定為空腸彎曲桿菌。 實施例21、 材料的採集取豬肝臟裝入加適量滅菌生理鹽水的青黴素瓶中，無菌剪 取肝臟約0.8 1.0cm3， 4C保存備用。2、 空腸彎曲桿菌的分離培養採用直接劃線平皿培養法，將釆集的豬肝 髒研碎，先以0.65 um的微孔濾膜過濾，然後取濾液劃皿接種在改良Camp—BAP 培養基上；將已接種細菌的平板置於容量3000mL的磨口乾燥器內。缸蓋及缸口 塗以凡士林，按每1L容積各2.4g的用量(l: 1比例)加入焦性沒食子酸和無水 碳酸鈉，混合均勻，放入小段點燃蠟燭於缸中央，蓋密缸蓋。燃燭約0.5 lmin 後自行熄滅，連同容器一併置於溫箱中42'C培養48h。
3、 觀察可疑菌落第一型菌落不溶血，灰白色、棕黃色、扁平、溼潤、有光澤，半透明水滴狀，凸起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；第二 型菌落也不溶血，圓形、有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落(直徑為l 2mm),邊緣完整、發亮。
4、 空腸彎曲桿菌的初步鑑定挑取改良Camp—BAP培養基上生長出的第 二型可疑菌落，塗片作革蘭氏染色鏡檢。根據菌體染色特性，取革蘭氏陰性菌 落做氧化酶和過氧化氫酶試驗。革蘭氏陰性菌，大小為0.3 0.4pmxl.5 3nm,如 小逗點狀，兩菌體的末端相連時，呈S形、海鷗形、螺旋狀或紡錘形。氧化酶和 過氧化氫酶試驗陽性者，可初步確定為可疑彎曲桿菌菌落。
5、 空腸彎曲桿菌的確定採用與實施例1相同的空腸彎曲桿菌特異性PCR 檢測方法確定是否為空腸彎曲桿菌。PCR擴增產物經上海捷瑞生物工程有限公司進行測序，結果證明該PCR產 物為空腸彎曲桿菌特異性DNA片段。因此，出現這一條帶的樣品即被確定空腸 彎曲桿菌。
' 實施例3
1、 材料的採集取雞肝臟裝入加適量滅菌生理鹽水的青黴素瓶中，無菌剪 取肝臟約0.8 1.0cm3， 4C保存備用。
2、 空腸彎曲桿菌的分離培養採用直接劃線平皿培養法，將採集的雞肝臟 研碎，先以0.65um的微孔濾膜過濾，然後取濾液劃皿接種在改良Camp—BAP 培養基上；將已接種細菌的平板置於容量3000mL的磨口乾燥器內。缸蓋及缸口 塗以凡士林，按每lL容積各3.0g的用量(h 1比例)加入焦性沒食子酸和無水 碳酸鈉，混合均勻，放入小段點燃蠟燭於缸中央，蓋密缸蓋。燃燭約0.5 lmin 後自行熄滅，連同缸一併置於溫箱中42 'C培養36h。
3、 觀察可疑菌落第一型菌落不溶血,灰白色、棕黃色、扁平、溼潤、有 光澤,半透明看上去像水滴，凸起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向； 第二型菌落也不溶血，圓形、有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落(直徑為 1 2mm),邊緣完整、發亮。
4、 空腸彎曲桿菌的初步鑑定挑取改良Camp—BAP培養基上生長出的第 二型可疑菌落，塗片作革蘭氏染色鏡檢。根據菌體染色特性，取革蘭氏陰性菌 落做氧化酶和過氧化氫酶試驗。革蘭氏陰性菌,大小為0.3 0.4pmxl.5 3pm，如 小逗點狀，兩菌體的末端相連時，呈S形、海鷗形、螺旋狀或紡錘形。氧化酶和 過氧化氫酶試驗陽性者，可初步確定為可疑彎曲桿菌菌落。5、 空腸彎曲桿菌的確定採用與實施例1相同的空腸彎曲桿菌特異性PCR 檢測方法確定是否為空腸彎曲桿菌。PCR擴增產物經上海捷瑞生物工程有限公司進行測序，結果證明該PCR產 物為空腸彎曲桿菌特異性DNA片段。因此，出現這一條帶的樣品即被確定空腸 彎曲桿菌。以下表l為本發明中焦性沒食子酸和無水碳酸鈉用量的實驗結果。 表l焦性沒食子酸和無水碳酸鈉用量實驗結果焦性沒食子酸無水碳 菌落數量(個)酸鈉12345AVG2.0 g/L : 2.0 g/L252425262725.4a2.2g/L: 2.2 g/L262325272525.2a2.4 g/L : 2.4 g/L272628242926.8a2.6 g/L : 2.6 g/L282329282727 a2.8g/L: 2.8 g/L252726262525.8a3.0 g/L : 3.0 g/L262825242926.4a由表1可見，微需氧試劑用量在2.0g/L-3.0g/L之間時，菌落數量差異不顯 著。在其它培養條件相同時，微需氧試劑焦性沒食子酸和無水碳酸鈉的用量在 2.4g/L-2.6g/L之間，空腸彎曲桿菌培養的菌落數量最多(25-27個)，培養效果 最好。即微需氧試劑焦性沒食子酸和無水碳酸鈉的用量在2.4g/L-2.6g/L之間， 是空腸彎曲桿菌的優化微需氧培養條件。
權利要求
1、一種空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養方法，其特徵在於包括如下步驟1)無菌取動物組織裝入滅菌器皿中，作為待檢樣品；2)將採集的檢測樣品，直接劃線接種在選擇培養基平板上，置於加入焦性沒食子酸和無水碳酸鈉的磨口缸內，再放一支點燃蠟燭於缸中央，蓋密缸蓋；燃燭自行熄滅後，連同缸一併置於溫箱中42℃培養觀察；其中，焦性沒食子酸和無水碳酸鈉的用量各為2.0-3.0g/L，兩者重量比為11；3)從樣品培養所得的菌落中挑取可疑菌落，其中第一型可疑菌落不溶血，灰白色、棕黃色、扁平、溼潤、有光澤，半透明水滴狀，凸起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；第二型可疑菌落不溶血，圓形、有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落，邊緣完整、發亮；4)將挑取的第一型可疑菌落或第二I型可疑菌落，塗片作革蘭氏染色鏡檢，根據菌體染色特性取革蘭氏陰性菌落做氧化酶和過氧化氫酶試驗，將氧化酶和過氧化氫酶試驗陽性者初步確定為可疑彎曲桿菌菌落；5)採用空腸彎曲桿菌特異性PCR檢測方法，對初步確定的可疑彎曲桿菌菌落進行檢測，對擴增出的358bpDNA片段進行測序，測序結果是空腸彎曲桿菌特異性片段的菌落即確定為空腸彎曲桿菌。
2、 根據權利要求l的空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養方法，其特徵在於所 述焦性沒食子酸和無水碳酸鈉的用量各為2.4-2.6g/L，兩者重量比為l: 1。
全文摘要
本發明涉及一種空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養方法，採用普通燭缸法與焦性沒食子酸法相結合的方法來創造微需氧環境，對空腸彎曲桿菌分離培養採用直接劃線培養法，用接菌環挑取少量動物組織檢測樣品直接接種在選擇培養基上，用燭缸法配合焦性沒食子酸和無水碳酸鈉混合物來降低空氣中氧氣的濃度，利用無水碳酸鈉形成鹼性環境，促使焦性沒食子酸與氧氣反應吸收氧氣，使培養環境達到空腸彎曲桿菌培養所需的微需氧條件。挑取分離培養獲得的典型菌落，做PCR鑑定，進一步確定為空腸彎曲桿菌。本發明具有成本低廉、操作簡單、檢出率高、培養效果好等優點，提高了空腸彎曲桿菌的分離培養效率，解決了微需氧條件培養空腸彎曲桿菌的難點。
文檔編號C12Q1/68GK101392228SQ200810202320
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月6日 優先權日2008年11月6日
發明者侯建軍, 華修國, 吳忠亮, 毅 姜, 朱建國 申請人:上海交通大學