彎曲菌疫苗的製作方法

2023-07-11 03:06:16

專利名稱：彎曲菌疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗彎曲菌定居的疫苗、彎曲菌蛋白和彎曲菌抗體在製備這種疫苗中的用途以及製備這種疫苗的方法。
彎曲菌屬的細菌為革蘭氏陰性螺旋形致病菌，具有較強的運動能力並在其細胞的一端或兩端帶有鞭毛。目前已發現好幾種彎曲菌。空腸彎曲菌常見於家禽。豬群中常見大腸彎曲菌，最近還(在較小範圍內)發現豬腸彎曲菌。
空腸彎曲菌是這些彎曲菌中最常分離到的與人類腹瀉有關的彎曲菌。越來越多的證據表明人體中彎曲菌的感染比沙門菌的感染更多見。(Griffiths等，用途細菌學雜誌(Journ.of Applied Bacteriology)1990，69281-301，Walker等，微生物學評論1986，5081-94，Butzler，J-P.，ISBN 0-8493-5446-3，RIVM報告號216852002，Bilthoven，荷蘭)。人的彎曲菌感染難以避免，因為首先彎曲菌是來自食物的人畜互傳細菌，很多動物，不管是野生的還是家養的，也不管是健康的還是患病的，其體內都可能大量帶菌。此外，該細菌有多種不同的傳播途徑。它們可在諸如屠宰後的畜體表面及水中以球形休眠形式存活好幾星期。因而該細菌極易通過直接與動物接觸或經汙染的水源或食物如牛奶或肉類而傳染至人類。空腸彎曲菌可見於很多健康動物，如火雞或小雞之類的禽類、牛、綿羊、馬和齧齒動物。雞肉，作為全世界很多國家的重要營養來源，已知經常受到彎曲菌的汙染(Shane(1992)，S.M.，鳥類病理學21189-213)。不僅發展中國家如此，歐洲也不例外。彎曲菌定居在家禽腸道中。在屠宰場中將常常嚴重汙染了彎曲菌的腸道從動物體內除去時常發生肉類的汙染。屠宰過程中的汙染很難避免。在荷蘭，儘管肉類行業採用了較高的衛生標準，仍有50％的雞肉被汙染。C.M.Karssen的論文(ISBN 90-71463-72-9)對家禽中彎曲菌的流行病學作了最新回顧。由於汙染的情況如此嚴重，僅在荷蘭(總人口15,000,000)每年就有約300,000人因接觸或吃了未煮透的禽肉而感染彎曲菌。其它歐洲國家的這類數據也大同小異。據估計全世界每年發生超過400,000,000例的感染(Pace等，疫苗1998，161563-1574)。彎曲菌引起人體腸道的感染，偶爾還導致更為嚴重的疾病如流產、腦膜炎、盲腸炎及尿路感染。(Blaser等，新英格蘭醫學雜誌1981，3051444-1452，Butzler等，臨床腸胃病學1979，8737-765)。有時還引起嚴重的神經性併發症如急性熱病性多神經炎和Miller-Fisher症候群(Schwerer等，1995，內毒素研究雜誌2395-403和Salloway等，1996，感染與免疫642945-2949)。彎曲菌所致腹瀉常為自限性感染，病程約2-7天。在幼齡兒童、老人和免疫受損患者中，此病不是自限性的，必需抗生素治療。很顯然，若有了抗彎曲菌的有效人用疫苗，就可阻止彎曲菌感染人。但這將要求類似抗腮腺炎和麻疹之免疫接種的標準接種程序。顯然這是不現實的。更合理方法是避免動物向人，特別是家禽向人的傳播。最簡易的方法是免疫接種家禽以抵抗彎曲菌感染。然而家禽的免疫接種(就象人類免疫接種一樣)實施起來比最初預料的要複雜得多。原因是彎曲菌儘管定居於家禽的腸道卻對家禽不致病。已檢驗的大多數疫苗是滅活的全細胞製品，經全身給藥或口服，有時與佐劑聯合使用。部分情況下腸道的定居在一定程度上可減少，但無一例疫苗可避免定居。這些疫苗無一例可阻止彎曲菌的排出。全細胞滅活疫苗若與亞單位疫苗比較，則是疫苗的首選，因為原則上它們仍具有全部潛在的免疫原性決定簇。繼全細胞疫苗的開發之後，很多努力集中在基於鞭毛的亞單位疫苗的開發上。鞭毛是感染期間被識別的免疫顯性抗原，多項研究均顯示此蛋白有保護作用(Martin等，感染和免疫1989，572542-2546，Wenman等，臨床微生物學雜誌1985，21108-112)。已知無鞭毛的突變體不定居腸道，而且它們在一或兩周後從感染動物體內消失，而此時野生型細菌仍留在腸道中。因此鞭毛是製備疫苗的最佳選擇，尤其因為在腸道定居方面它們所起的作用即使不是唯一的也是關鍵的。如果能阻止定居，將邁出消除家禽汙染的第一步。儘管如此，基於彎曲菌鞭毛的潛在疫苗尚不能提供足夠的保護。
繼上述主動免疫接種之後，被動免疫接種作為減少彎曲菌感染的一個方法也受到檢驗。Tsubokura等(1997，臨床實驗免疫學108451-455)施行口服抗空腸彎曲菌全細胞的抗體，然後用空腸彎曲菌攻擊。他們聲稱經此免疫的小雞糞便中發現的細菌數減少了1-2個對數級。迄今所作的所有努力尚未能找到一種能明顯減少定居水平及糞便中排出的細菌量的活性、滅活或基於亞單位的疫苗。顯然仍有必要尋找可靠而安全的疫苗或其它治療方法。
原則上，無需在家禽的一生中保護它不受彎曲菌感染。如上所述它們並無感染的痛苦。所以，能減少細菌量並因此減少屠宰前的感染機率的治療方法將能有效抑制屠宰時的後繼肉類汙染。而這就能預防由肉類傳播的人彎曲菌感染。
本發明的目標之一是提供能減少定居水平及排出量、或甚至能從家禽的盲腸清除彎曲菌的疫苗。這可避免屠宰時發生肉類的彎曲菌汙染並因此避免隨後的人類汙染。
現已驚訝地發現，具有這些特徵的疫苗可基於抗彎曲菌之無鞭毛突變體的抗體。這是大大出乎人們預料之外的，因為如上所述，鞭毛已被認為是與粘附和定居有關的關鍵蛋白。更令人驚訝的是，這種疫苗確實減少了野生型有鞭毛彎曲菌的定居和排出。這是首次報導疫苗甚至能將盲腸中的彎曲菌清除至檢測水平以下。
因此，本發明的一個實施方案涉及預防彎曲菌在動物體內定居的疫苗，該疫苗包含抗彎曲菌無鞭毛菌株的抗血清。
這樣的疫苗可以非常簡單地包含新分離的抗彎曲菌抗血清，或許還有稀釋劑。可加入這樣的稀釋劑以使效價過高的抗血清得到稀釋。稀釋劑可以簡單地採用蒸餾水或生理鹽水溶液。事實上任何藥學可接受的稀釋劑均可使用。
本發明在豬和其它動物的彎曲菌感染中與在家禽的感染中同等適用。
由於雞肉汙染率極高，該實施方案的一個優選形式涉及無鞭毛的空腸彎曲菌菌株，並涉及家禽。
任何無鞭毛彎曲菌菌株均可用於製備抗血清。尤其優選那些生長率與野生型菌株相當的無鞭毛彎曲菌菌株。製備抗體的無鞭毛彎曲菌最佳菌株之一已由Wassenaar，T.M.，Bleumink-Pluym，N.M.C.和van derZeijst，B.A.M.於1991年述於EMBO雜誌102055-2061。
因此，在一個優選形式中，用來生成抗體的無鞭毛空腸彎曲菌菌株為R2。
適於本發明疫苗的抗體可得自多克隆血清、單特異性血清或單克隆抗體培養物。多克隆血清的優勢在於可按常規技術簡便製備。生產和加工多克隆血清的技術最為領域內熟知(如Mayer和Walter，編，細胞和分子生物學中的免疫化學方法，Academic出版社，倫敦，1987)。適於製備抗體的動物包括如牛、兔子、小鼠和小雞。獲得抗彎曲菌之牛抗體的有效方法已由Hilpert等1987年述於傳染病雜誌156158-166。生產大量抗體的另一個有效方法即在卵黃囊中的生產已述於Hatta等，1993，生命科學、生物技術及生物化學57450-454。
本發明的另一實施方案涉及針對空腸彎曲菌無鞭毛菌株的抗體在製備抗空腸彎曲菌定居之疫苗中的用途。
更驚訝的發現是針對空腸彎曲菌無鞭毛突變體產生的抗血清在空腸彎曲菌總蛋白之蛋白印跡上可識別三條主要蛋白帶，97KD(+/-5KD)、60KD(+/-5KD)帶和13KD(+/-3KD)帶，而用抗野生型空腸彎曲菌的抗血清則不能顯示這些帶。該現象亦見於野生型彎曲菌和無鞭毛彎曲菌的蛋白印跡中。故，這三種蛋白在彎曲菌的野生型和無鞭毛菌株中都存在。由此得出結論免疫系統對這三種特異性蛋白的識別只發生於鞭毛缺乏時。
如上述，抗彎曲菌無鞭毛突變體的抗血清能自盲腸中將彎曲菌清除至檢測水平以下。這種抗血清與針對野生型彎曲菌的抗血清(不能清除彎曲菌)的區別是它還包含抗97KD、60KD和13KD蛋白的抗體。這三種蛋白顯然只在缺乏鞭毛時誘導抗體的產生，從而可得出結論這三種蛋白能誘導在盲腸的彎曲菌清除中起主要作用的抗體。因此，針對97KD、60KD或13KD蛋白產生的抗體或者它們的混合物均能自盲腸中清除彎曲菌。
因而本發明的另一個實施方案涉及分子量為97KD、60KD或13KD的抗原性蛋白，在空腸彎曲菌蛋白印跡中，將蛋白印跡與抗空腸彎曲菌無鞭毛突變體之抗體溫育後可見這些蛋白質，而與抗野生型空腸彎曲菌抗體溫育後不可見。
對60KD蛋白和13KD蛋白作了進一步分析，已測定它們的胺基酸序列。
60KD蛋白的胺基酸序列如下，亦示於SEQ ID NO 1。
60KD蛋白的胺基酸序列是「MAKEIIFSDEARNK-LYEGVKKLNDAVKVTMGPRGRNVLIQKSFGAPSITKDGVSVAKEVELKD-SLENMGASLVREVASKTADQAGDGTTTATVLAHAIFKEGLRNITAGANPIEVK-RGMDKACEAIVAELKKLSREVKDKKEIAQVATISANSDEKIGNLIADA-MEKVGKDGVITVEEPKSINDELNVVEGMQFDRGYLSPYFITNAEKMTVEL-SSPYILLFDKKITNLKDLLPVLEQIQKTGKPLLIIAEDIEGEALATLVVNKLRGV-LNISAVKAPGFGDRRKAMLEDIAILTGGEVISEELGRTLESATIQDLGQASS-VIIDKDNTTIVNGAGEKANIDARVNQIKAQIAETTSDYDREKLQERLAKLSG-GVAVIKVGATTETEMKEKKDRVDDALSATKAAVEEGIVIGGGAALIKA-KAKIKLDLQGDEAIGAAIVERALRAPLRQIAENAGFDAGVVVNSVENAK-DENTGFDAAKGEYVNMLESGIIDPVKVERVALLNAVSVASMLLT-TEATISEIKEDKPTMPDMSGMGGMGGMGGMM」13KD蛋白的胺基酸序列如下，並見SEQ ID NO 2。
13KD蛋白的胺基酸序列是「MAISKEDVLEYISNLSVLELSELVKE-FEEKFGVSAAPVMVAGGAVAGGAVAAAEEKTEFDIVLTDGGAKKIEVI-KIVRALTGLGLKEAKDAVEQTPSTLKEGVAKAEAEEAKKQLEEAGAKVELK」60KD和13KD蛋白的胺基酸序列可能略有變動。胺基酸序列的變異可能是一或多個胺基酸被相同功能的其它胺基酸替換的結果。同功替換十分常見。Neurath等(蛋白質，Academic出版社，紐約(1979)，第14頁，圖6)所述實例尤其是丙氨酸被絲氨酸替換；Ala/Ser、或Val/Ile、Asp/Glu等。除了上述導致被相同功能的其它胺基酸替換的變異外，也有變異是胺基酸被功能不同的另一個胺基酸替換。這種變異與同功替換的區別僅在於可能產生空間摺疊稍有改變的蛋白。兩類變異均常見於蛋白中，它們被稱為生物學變異。
毋庸置疑，60KD和13KD蛋白的胺基酸序列中能保留多肽之免疫原活性的變異方式也包括在本發明的範圍內。
97KD、60KD或13KD蛋白可用於產生多克隆、單特異性或單克隆抗體(或其衍生物)。97KD、60KD和13KD蛋白可按本領域內已知的多種標準的蛋白分離方案進行分離。一個十分簡易的方法是從製備膠上切下這些蛋白。若要多克隆抗體，生產和加工多克隆抗血清的技術為本領域內已知(如Mayer和Walter，編，見上)。對本發明之97KD、60KD或13KD蛋白(或其變異體或片段)有反應性的單克隆抗體，可用本領域內已知技術免疫近交小鼠而製備(Kohler和Milstein，自然，256，495-497，1975)。
用抗這三種蛋白中任一種的抗體而不用抗完整無鞭毛彎曲菌抗血清的好處之一是，抗這三種蛋白的特異性單克隆抗體可自發酵罐中生長的大量雜交瘤中很容易地獲得。從而能低成本/低消耗地生產大量抗體，且無需使用動物。
因此，本發明的另一個實施方案涉及含有抗彎曲菌97KD、60KD或13KD蛋白之抗體的疫苗。
本發明還有一個實施方案涉及抗本發明之97KD和/或60KD和/或13KD蛋白的抗體在製備抗空腸彎曲菌定居的疫苗中的用途。
製備本發明之疫苗的方法不必很複雜。原則上只需在如某種動物體內產生抗無鞭毛突變體或抗97KD和/或60KD和/或13KD蛋白的抗體，然後按常規技術收集血液並分離抗血清。適於用來產生這類抗體的動物有兔子和小雞。若用小雞，則抗體也可從系統性免疫的小雞的卵黃囊獲得。原則上抗體無需稀釋。它們可以是、或必需是濃縮的形式。另外，如果抗體濃度很高，如此獲得的抗血清可以在施用前稀釋。
因此，本發明的另一實施方案涉及製備本發明之疫苗的方法。這些方法包括在宿主動物體內產生抗空腸彎曲菌無鞭毛菌株之抗原物質的抗體，然後分離抗體。原則上，這種方法通常包括從宿主動物體內採集血液再通過如離心或過濾純化抗血清。
亦有可能獲得生產所需針對97KD、60KD和13KD蛋白之抗體的細胞並在如發酵罐中進行培養。然後收集抗體，若有必要，可將其與某種藥學可接受的載體混合。這類方法的好處是無需使用動物來製備抗體。
本發明還十分適於處理宰殺前的肉仔雞。這些肉仔雞通常在六周齡被宰殺。因而，用本發明的疫苗在宰殺前約一周處理這些動物，可顯著降低彎曲菌汙染水平。顯然疫苗用量主要取決於疫苗中抗體的濃度。據說0.1-1ml粗抗血清中的抗體含量就十分合適。
象卵黃囊製備物中的抗體效價可用本領域內熟知的標準技術如ELISA輕易測得。
抗體可以十分粗製的製備物給予。可能的用藥途徑有給小雞餵食粗製抗血清。其它用藥途徑有將血清與飲用水混合。或者，可將抗體直接與小雞飼料混合。為此，還可採用凍幹抗體，從而提高它們在與食物或水混合前的長期穩定性。抗體還可先包入膠囊再加入小雞的食物中。
本發明另有一實施方案提供了用本發明之抗血清或抗體作疫苗的方法。或者，可直接用本發明的97KD、60KD或13KD蛋白作疫苗。當直接給家禽施用97KD、60KD或13KD蛋白時，它們直接誘導抗97KD、60KD或13KD蛋白的抗體產生。動物隨後產生它們自己的抗彎曲菌保護性抗體。這再次讓人驚訝施用完整野生型彎曲菌不能自盲腸清除彎曲菌，因為野生型彎曲菌抑制了抗97KD、60KD和13KD蛋白之抗體的誘導產生。因此，當97KD、60KD和13KD蛋白不是以分離形式給予，而是作為完整野生型彎曲菌細胞的部分給予時，它們無效。因此，另一實施方案涉及含有特異性抗原性的97KD、60KD或13KD蛋白的疫苗，所述蛋白在空腸彎曲菌蛋白印跡中與抗空腸彎曲菌無鞭毛突變體之抗體溫育後可見而與抗野生型空腸彎曲菌抗體溫育後不可見。
這樣的疫苗易與藥學可接受載體混合製成。藥學可接受載體當然是對接種動物的健康無不利影響、至少有不利影響時也不至於比未接種動物中所見影響更差的化合物。藥學可接受載體有無菌水或無菌生理鹽水等。更複雜一點，載體可以是如某種緩衝液。
本發明另有一實施方案涉及本發明之97KD、60KD或13KD抗原性蛋白在疫苗中的用途。
該實施方案的優選形式涉及本發明之97KD、60KD或13KD抗原性蛋白在製備抗空腸彎曲菌定居的藥物組合物中的用途。
製備疫苗所用蛋白的最適量按給藥途徑的不同而不同。若是系統性給藥，最適用量為1-1000μg。口服疫苗的用量也可在此範圍內。若想通過飲用水口服給藥，由於餵食時水的溢出，或許用量更大。
本發明之疫苗優選還包括某種佐劑。通常佐劑包含可非特異性增強宿主免疫應答的物質。多種佐劑為本領域內已知，如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑、維生素E、非離子型嵌段聚合物和聚胺如硫酸葡聚糖、聚羰乙烯和吡喃。表面活性物質如Span、吐溫、十六胺(hexadecylamine)、溶血卵磷脂、甲氧基十六烷基甘油和皂角苷(尤其是Quil A)也很合適。此外，肽如胞壁醯二肽、二甲基甘氨酸、吞噬細胞增強激素均為常用。除了這些佐劑，免疫刺激複合物(ISCOMS)、礦物油如Bayol或Markol、植物油或它們的乳液以及DiluvacForte均可方便地使用。疫苗還可包含所謂的「載體」。載體是無需共價結合而能粘附多肽的化合物。常用的載體化合物有例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁或氧化鋁、矽膠、高嶺土和斑脫土。這樣的載體的一種特殊形式(即抗原部分包埋於載體中)稱為ISCOM(EP 109,942，EP 180,564，EP 242,380)。
疫苗常與穩定劑混合，以便如保護易降解多肽不被降解、延長疫苗的有效期、或提高凍幹效率。有效穩定劑尤其有SPGA(Bovarnik等；細菌學雜誌59509(1950))、脫脂乳、明膠、牛血清白蛋白、碳水化合物如山梨醇、甘露醇、海藻糖、澱粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖，蛋白如白蛋白或酪蛋白或它們的降解產物，以及緩衝液如鹼金屬磷酸鹽。凍幹是有效的保藏法。凍乾物質可穩定保藏多年。凍乾物質的貯存溫度可在零度以上，而對物質無損。
凍幹可按眾所周知的標準凍幹過程進行。
含有97KD、60KD或13KD蛋白的疫苗優選經黏膜給藥。如將疫苗與飲用水混合後口服。尤其對家禽免疫時，其它諸如眼內免疫和鼻內免疫也都是很好的黏膜免疫方法。97KD、60KD和13KD蛋白的檢測細菌菌株
野生型81116空腸彎曲菌，野生型，人類分離物，鞭毛表型A+B+，體外有運動能力和侵襲力(Wassenaar，T.M.，Bleumink-Pluym，N.M.C.和van der Zeijst，B.A.M.1991，EMBO雜誌102055-2061)。
突變型81116-R2FlaA和FlaB缺失突變體(+卡那黴素插入子)，鞭毛表型A-B-，體外無運動能力也無侵襲力(Wassenaar，T.M.，Bleumink-Pluym，N.M.C.和van der Zeijst，B.A.M.1991，EMBO雜誌102055-2061)。細胞培養空腸彎曲菌81116株接種於Blaser彎曲菌瓊脂上，空腸彎曲菌81116-R2株接種於補加了40μg/ml卡那黴素的Blaser彎曲菌瓊脂上。將平板置於微需氧條件下41℃溫育48小時。將瓊脂平板上的小部分81116菌落接種於加有1％酵母提取物的Brucella培養液中，而將小部分的81116-R2菌落接種於加有1％酵母提取物並補加了40μg/ml卡那黴素的Brucella培養液中。41℃微需氧溫育24小時後，檢查培養物中的細菌總數並加入0.2％福馬林滅活(室溫24小時)。滅活細菌經離心收集。細胞沉澱重新懸浮於0.01M Tris pH7.4中，使蛋白質濃度調至1.0mg/ml。
然後在4-12％Bis-Tris的NuPage凝膠上按每個樣品槽20μl該懸浮液進行標準聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAAGE)。用NuPage轉移緩衝液/甲醇進行蛋白印跡。採用Adessi，C.(電泳1997，18127-135)和Gorg，A.(電泳1995，16，1079-1086)所述標準方法以及Pharmacia 18-1038-63的說明書進行雙向(2-D)電泳。小雞抗血清的製備4周齡小雞肌肉內注射81116菌株或81116-R2菌株的全細胞疫苗(見下)1ml。剩下一組小雞不免疫。免疫4周後所有小雞放血處死。合併每組的血清用於免疫4日齡小雞。
將由此獲得的血清稀釋20、200或400倍，按標準方法與蛋白印跡膜溫育。結果

圖1中左側蛋白印跡膜包含野生型彎曲菌81116菌株的全部抗原，右側蛋白印跡膜包含無鞭毛彎曲菌81116-R2菌株的抗原。泳道1和7、2和8、3和9分別與20倍、200倍或400倍稀釋的野生型彎曲菌81116菌株抗血清進行溫育。泳道4和10、5和11、6和12分別與20倍、200倍或400倍稀釋的無鞭毛彎曲菌81116-R2菌株抗血清進行溫育。
泳道4-6和泳道10-12均可清楚地看見兩條分子量分別為97和60KD的帶，這兩條帶在泳道1-3和7-9中看不到。(這些泳道之間略顯模糊並較為擴散的帶都是分子量標準物)。
圖2顯示了包含野生型彎曲菌81116菌株全部抗原的雙向電泳凝膠。雙向凝膠更適於檢測較小分子蛋白，因而比常規單向聚丙烯醯胺凝膠電泳更適於檢測13KD蛋白(相應抗體)的存在。圖3顯示了此凝膠的蛋白印跡結果。印跡/溫育按圖1所用的標準過程執行。圖3a顯示與無鞭毛彎曲菌81116-R2菌株的抗血清溫育的雙向凝膠蛋白印跡。圖3b顯示同一蛋白印跡與野生型彎曲菌81116菌株的抗血清溫育的結果。圖3a的蛋白印跡顯示在針對無鞭毛彎曲菌的抗血清中存在抗60KD(箭頭1)和13KD(箭頭2)蛋白的抗體，而在針對野生型彎曲菌的抗血清中未發現這兩種抗體(圖3b)。
這些蛋白印跡清楚地顯示，無鞭毛彎曲菌菌株能誘導針對97KD、60KD和13KD蛋白的免疫應答，而野生型彎曲菌菌株無這種現象。疫苗的製備細菌菌株野生型81116見上。突變型81116-R2見上。用於被動免疫的小雞抗血清的製備4周齡小雞經肌肉內注射81116株或81116-R2株的全細胞疫苗(見下)1ml。剩下一組小雞未免疫。免疫4周後，所有小雞放血處死。收集每組的血清並用於免疫4日齡小雞。滅活的全細胞疫苗的製備將空腸彎曲菌81116株接種於Blaser彎曲菌瓊脂上，空腸彎曲菌81116-R2株接種於補加了40μg/ml卡那黴素的Blaser彎曲菌瓊脂上。將平板置於微需氧條件下41℃溫育48小時。將瓊脂平板上的81116菌落接種於加有1％酵母提取物的Brucella培養液中，而將81116-R2菌落接種於加有1％酵母提取物並補加了40μg/ml卡那黴素的Brucella培養液中。41℃微需氧溫育24小時後，檢查培養物中的細菌總數並加入0.2％福馬林滅活(室溫24小時)。滅活細菌經離心收集，懸浮於PBS，將細胞與不完全弗氏佐劑的油包水乳液混合製成疫苗製品。疫苗乳液每ml約含細菌109個。彎曲苗攻擊菌株的製備將空腸彎曲菌81116株在Blaser彎曲菌瓊脂平板上於41℃微需氧培養48小時。將其中一個平板上的培養物懸浮於加有1％酵母提取物的Brucella培養液中，並在緊閉小瓶內41℃培養48小時。小雞們口服給予0.2ml此培養物進行攻擊。攻擊培養物的活力計數通過平板計數測定。免疫接種實驗在此實驗中，比較了用野生型彎曲菌抗血清和無鞭毛彎曲菌抗血清進行的被動免疫，以及用滅活的野生型彎曲菌全細胞製品進行的主動免疫。小雞4日齡或兩周齡SPF小雞。實驗1的實驗設計4組每組10隻4日齡小雞(每天一次)口服抗野生型彎曲菌81116株之小雞抗血清0.8ml，或口服抗無鞭毛突變體81116-R2之小雞抗血清0.8ml，或口服未滅活的小雞抗血清對照0.8ml，或不作處理作為對照。第一天(即在4日齡時)各小雞在臨近3.2×107CFU/ml攻擊之前、或在攻擊的6小時後接受抗血清。口服處理持續至屍檢。攻擊後5或10天，每組處死5隻小雞，測定每克盲腸內容物的CFU(見下屍檢和細菌學)。實驗2的實驗設計4組每組10隻4日齡小雞(每天一次)口服抗野生型彎曲菌81116株之小雞抗血清0.8ml，或口服抗無鞭毛突變體81116-R2之小雞抗血清，或口服未滅活的小雞抗血清對照，或不作處理作為對照。第一天(即在4日齡時)各小雞在臨近1.4×108CFU/ml攻擊之前、或在攻擊後6小時接受抗血清。口服處理持續至屍檢。攻擊的5天後每組處死5隻小雞，測定每克盲腸內容物的CFU。實驗3的實驗設計3組每組10隻2周齡小雞肌肉內注射與不完全弗氏佐劑的油包水乳液混合的全細胞疫苗(包含野生型彎曲菌81116株或無鞭毛突變株81116-R2的滅活細胞)1ml，或不免疫。在5周齡時所有小雞都口服接受野生型彎曲菌81116株1.4×108CFU/ml的攻擊。攻擊的一周後處死小雞，測定每克盲腸內容物的CFU。屍檢和細菌學處死小雞，輕柔地取出每段盲腸的內容物，稱重，在0.04 M PBS中稀釋至0.1g/ml。經連續10倍稀釋後鋪板於Blaser彎曲菌選擇瓊脂平板上。41℃微需氧培養48小時後，測定每克盲腸內容物的CFU。結果實驗1從表1可得出結論每天重複用野生型彎曲菌抗血清或用未免疫小雞的對照血清進行的被動免疫，與未處理的對照小雞相比(在攻擊後5和10天)，對野生型彎曲菌的盲腸定居沒有影響。所有三個組均顯示彎曲菌的高水平盲腸定居(每克盲腸內容物高達108CFU以上)。與之形成明顯對比的是，用本發明之抗血清(即針對無鞭毛突變體刺激產生的抗血清)被動免疫導致了野生型彎曲菌從盲腸中清除(或阻止了定居)。每克盲腸內容物中CFU＜3，這意味著在檢測水平之下。實驗2在本實驗中重複了檢驗(見表2)。再次發現，用本發明之抗血清(即針對無鞭毛突變體刺激產生的抗血清)被動免疫導致了小雞中盲腸定居的大大減少6/10的小雞完全無盲腸定居，顯示平均減少3log以上。實驗3因為文獻指出，用野生型彎曲菌主動免疫最多可導致彎曲菌定居減少2log(Widders，P.R.，Perry，R.，Muir，W.I.，Husband，A.J. Long，K.A.，1996，英國禽類科學37765-778)，我們檢驗並比較了主動保護模型中基於野生型和R2的疫苗。
從結果(表3)可看出無一疫苗對盲腸定居有影響。
表1a攻擊後5天，空腸彎曲菌81116的再分離
表1b攻擊後10天，空腸彎曲菌81116的再分離
表2 攻擊後5天，空腸彎曲菌81116的再分離
a與接受未免疫小雞抗血清的小組比較p≤0.05(兩樣本t檢驗)b與接受未免疫小雞抗血清的小組比較p≤0.001(兩樣本t檢驗)表3 攻擊後6天，空腸彎曲菌81116的再分離
結論基於針對無鞭毛彎曲菌產生的抗體的疫苗能從盲腸中清除野生型彎曲菌。這與其對應物，即含有針對野生型彎曲菌產生的抗體的疫苗的效果形成明顯對照。亦與含有野生型彎曲菌細胞的疫苗形成明顯對照。圖例說明圖1.包含野生型彎曲菌81116株總抗原的蛋白印跡(左)，和包含無鞭毛彎曲菌81116-R2株之抗原的蛋白印跡。泳道1和7、2和8、3和9分別與20倍、200倍、400倍稀釋的抗野生型彎曲菌81116株之抗血清溫育。泳道4和10、5和11、6和12分別與20倍、200倍、400倍稀釋的抗無鞭毛彎曲菌81116-R2株之抗血清溫育。
圖2.野生型彎曲菌81116株總抗原的雙向電泳凝膠。
圖3a.與抗無鞭毛彎曲菌81116-R2株之抗血清溫育的雙向電泳凝膠的蛋白印跡。60KD蛋白用箭頭1指示，13KD蛋白用箭頭2指示。
圖3b.與抗野生型彎曲菌81116株之抗血清溫育的蛋白印跡。
序列表110AKZO Nobel N.V.120彎曲菌疫苗130彎曲檢驗(campylotest)1401411602170PatentIn Ver.2.12101211125212PRT213空腸彎曲菌4001Met Ala Ile Ser Lys Glu Asp Val Leu Glu Tyr Ile Ser Asn Leu Ser1 5 10 15Val Leu Glu Leu Ser Glu Leu Val Lys Glu Phe Glu Glu Lys Phe Gly20 25 30Val Ser Ala Ala Pro Val Met Val Ala Gly Gly Ala Val Ala Gly Gly35 40 45Ala Val Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Ile Val Leu Thr50 55 60Asp Gly Gly Ala Lys Lys Ile Glu Val Ile Lys Ile Val Arg Ala Leu65 70 75 80Thr Gly Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ala Val Glu Gln Thr Pro85 90 95Ser Thr Leu Lys Glu Gly Val Ala Lys Ala Glu Ala Glu Glu Ala Lys100 105 110Lys Gln Leu Glu Glu Ala Gly Ala Lys Val Glu Leu Lys115 120 1252102211545212PRT213空腸彎曲菌4002Met Ala Lys Glu Ile Ile Phe Ser Asp Glu Ala Arg Asn Lys Leu Tyr1 5 10 15Glu Gly Val Lys Lys Leu Asn Asp Ala Val Lys Val Thr Met Gly Pro20 25 30Arg Gly Arg Asn Val Leu Ile Gln Lys Ser Phe Gly Ala Pro Ser Ile35 40 45Thr Lys Asp Gly Val Ser Val Ala Lys Glu Val Glu Leu Lys Asp Ser50 55 60Leu Glu Asn Met Gly Ala Ser Leu Val Arg Glu Val Ala Ser Lys Thr65 70 75 80Ala Asp Gln Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala His85 90 95Ala Ile Phe Lys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Thr Ala Gly Ala Asn Pro100 105 110Ile Glu Val Lys Arg Gly Met Asp Lys Ala Cys Glu Ala Ile Val Ala115 120 125Glu Leu Lys Lys Leu Ser Arg Glu Val Lys Asp Lys Lys Glu Ile Ala130 135 140Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asp Glu Lys Ile Gly Asn Leu145 150 155 160Ile Ala Asp Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asp Gly Val Ile Thr Val165 170 175Glu Glu Pro Lys Ser Ile Asn Asp Glu Leu Asn Val Val Glu Gly Met180 185 190Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Ile Thr Asn Ala Glu195 200 205Lys Met Thr Val Glu Leu Ser Ser Pro Tyr Ile Leu Leu Phe Asp Lys210 215 220Lys Ile Thr Asn Leu Lys Asp Leu Leu Pro Val Leu Glu Gln Ile Gln225 230 235 240Lys Thr Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Ile Glu Gly Glu245 250 255Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Lys Leu Arg Gly Val Leu Asn Ile260 265 270Ser Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu275 280 285Glu Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Glu Val Ile Ser Glu Glu Leu290 295 300Gly Arg Thr Leu Glu Ser Ala Thr Ile Gln Asp Leu Gly Gln Ala Ser305 310 315 320Ser Val Ile Ile Asp Lys Asp Asn Thr Thr Ile Val Asn Gly Ala Gly325 330 335Glu Lys Ala Asn Ile Asp Ala Arg Val Asn Gln Ile Lys Ala Gln Ile340 345 350Ala Glu Thr Thr Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu355 360 365Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Thr Thr370 375 380Glu Thr Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg Val Asp Asp Ala Leu Ser385 390 395 400Ala Thr Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ile Gly Gly Gly Ala405 410 415Ala Leu Ile Lys Ala Lys Ala Lys Ile Lys Leu Asp Leu Gln Gly Asp420 425 430Glu Ala Ile Gly Ala Ala Ile Val Glu Arg Ala Leu Arg Ala Pro Leu435 440 445Arg Gln Ile Ala Glu Asn Ala Gly Phe Asp Ala Gly Val Val Val Asn450 455 460Ser Val Glu Asn Ala Lys Asp Glu Asn Thr Gly Phe Asp Ala Ala Lys465 470 475 480Gly Glu Tyr Val Asn Met Leu Glu Ser Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys485 490 495Val Glu Arg Val Ala Leu Leu Asn Ala Val Ser Val Ala Ser Met Leu500 505 510Leu Thr Thr Glu Ala Thr Ile Ser Glu Ile Lys Glu Asp Lys Pro Thr515 520 525Met Pro Asp Met Ser Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met530 535 540Met54權利要求
1.預防動物體內彎曲菌定居的疫苗，其特徵在於該疫苗包含針對無鞭毛彎曲菌菌株產生的抗血清。
2.權利要求1的疫苗，其特徵在於所述無鞭毛彎曲菌菌株為空腸彎曲菌。
3.權利要求2的疫苗，其特徵在於所述無鞭毛空腸彎曲菌菌株為R2株。
4.彎曲菌之分子量為97KD(+/-5KD)的抗原性蛋白，其特徵在於在空腸彎曲菌蛋白印跡中，將所述蛋白印跡膜與抗空腸彎曲菌無鞭毛突變體之抗體溫育後可見該蛋白，而該蛋白印跡膜與抗野生型空腸彎曲菌之抗體溫育後不可見。
5.彎曲菌之分子量為60KD(+/-5KD)的抗原性蛋白，其特徵在於在空腸彎曲菌蛋白印跡中，將所述蛋白印跡膜與抗空腸彎曲菌無鞭毛突變體之抗體溫育後可見該蛋白，而該蛋白印跡膜與抗野生型空腸彎曲菌之抗體溫育後不可見。
6.彎曲菌之分子量為13KD(+/-3KD)的抗原性蛋白，其特徵在於在空腸彎曲菌蛋白印跡中，將所述蛋白印跡膜與抗空腸彎曲菌無鞭毛突變體之抗體溫育後可見該蛋白，而該蛋白印跡膜與抗野生型空腸彎曲菌之抗體溫育後不可見。
7.權利要求4、5或6的抗原性蛋白在疫苗中的用途。
8.權利要求4、5或6的抗原性蛋白在生產抵抗空腸彎曲菌定居的藥物組合物中的用途。
9.預防家禽體內空腸彎曲菌定居的疫苗，其特徵在於該疫苗包含針對權利要求4、5或6之抗原性蛋白的抗體。
10.預防家禽體內空腸彎曲菌定居的疫苗，其特徵在於該疫苗包含權利要求4、5或6的抗原性蛋白。
11.抗無鞭毛彎曲菌菌株、或抗權利要求4、5或6之抗原性蛋白的抗體在製備可用於抗動物體內彎曲菌定居之疫苗中的用途。
12.製備權利要求1-3或9中任一項之疫苗的方法，其特徵在於包括在宿主動物體內產生抗無鞭毛彎曲菌菌株之抗原物質的抗血清，並隨後從該宿主動物體內分離抗血清。
13.製備權利要求9之疫苗的方法，其特徵在於包括培養抗體生成細胞並收穫抗體。
14.製備權利要求10之疫苗的方法，其特徵在於包括將權利要求4-6中任一項的蛋白質與藥學可接受的載體混合。
全文摘要
本發明涉及含有抗無鞭毛彎曲菌菌株之抗血清、可用於預防動物體內彎曲菌定居的疫苗,在空腸彎曲菌蛋白印跡中所述蛋白印跡膜與抗空腸彎曲菌無鞭毛突變體抗體溫育後可見、而與抗野生型空腸彎曲菌抗體溫育後不可見的彎曲菌抗原性蛋白,並涉及它們在疫苗及其生產中的用途。本發明還涉及包含這些蛋白和抗這些蛋白之抗體的疫苗,這些彎曲菌蛋白的用途,抗彎曲菌抗原之抗血清和抗體在疫苗製備中的用途,以及製備這些疫苗的方法。
文檔編號A61P31/04GK1270061SQ0010498
公開日2000年10月18日 申請日期2000年4月7日 優先權日1999年4月9日
發明者A·A·C·扎科布斯, J·F·范·登·伯施, P·J·M·紐坦 申請人:阿克佐諾貝爾公司