秦川牛microRNA‑320a‑1基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用與流程

2023-07-11 02:35:52 2

本發明屬於生物
技術領域：
，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的方法。
背景技術：
：單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是生物基因組DNA序列中由於單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的變異。研究表明，基因組DNA序列發生單核苷酸替換，會造成DNA序列的改變或編碼蛋白質的胺基酸發生改變，從而使不同基因型的生物體表現出不同的性狀。MicroRNAs是生物基因組DNA轉錄產生的一類長約22nt的非編碼RNA，研究表明，microRNAs發揮作用的方式是與下遊靶基因的mRNA鹼基互補配對，使該mRNA降解或翻譯受到抑制，從而影響生物體的性狀。目前，對microRNA-320a基因的研究多集中在人類，主要包括該基因與癌細胞的轉移和侵染等相關研究，未見microRNA-320a基因在黃牛上的遺傳變異研究。黃牛microRNA-320a基因包括2個亞型，分別是microRNA-320a-1和microRNA-320a-2，這兩個亞型發揮作用的途徑相同。目前黃牛microRNA-320a-1基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因多態位點的功能研究及其遺傳變異與生長發育性狀(如：體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍等性狀)關聯研究仍是空白。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用，加快具有優質經濟性狀秦川牛種群的建立。為達到上述目的，本發明採用了以下技術方案：以包含microRNA-320a-1基因的待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P2為引物，PCR擴增秦川牛microRNA-320a-1基因片段；用限制性內切酶PvuII消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的單核苷酸多態性；所述的引物對P2為：上遊引物：AACTCCCACGTTGCGTCCAGC21nt；下遊引物：GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT20nt。所述的PCR擴增反應程序為：94℃預變性2min；94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸15s，30～36個循環；72℃延伸5min。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為3％的瓊脂糖凝膠電泳。所述的瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的單核苷酸多態性為：CC基因型表現為188bp條帶；CT基因型表現為188bp、168bp和20bp條帶；TT基因型表現為168bp和20bp條帶；其中，TT基因型為突變純合基因型。本發明具有以下有益的技術效果：本發明提供的秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性檢測方法，針對(rs518926539:C>T)位點由C突變為T的突變，通過在設計的上遊引物的3』端引入鹼基錯配，構造出被限制性內切酶PvuII所識別的切割位點。當沒有突變發生時，PCR擴增microRNA-320a-1基因後在錯配位置附近無法形成限制性內切酶PvuII識別位點；當由C突變為T時，PCR擴增microRNA-320a-1基因後可形成PvuII識別位點。通過瓊脂糖凝膠電泳可以準確、快速的檢測microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性：CC基因型表現為188bp條帶；CT基因型表現為188bp、168bp和20bp條帶；TT基因型表現為168bp和20bp條帶。可以對秦川牛群體的microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的等位基因和基因型頻率的變化進行監控。同時，由於秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的多態性與秦川牛體重、體長、十字部高等生長性狀相互關聯，本發明提供的檢測方法為利用microRNA-320a-1基因SNP與生長性狀的關係進行秦川牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)奠定了基礎，可快速建立遺傳資源優良的秦川牛種群。附圖說明圖1為分型引物(引物對P2)設計思路示意圖；圖2為錯配引入PvuII酶切位點PCR產物酶切後鑑定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點處單核苷酸多態性的電泳檢測結果；其中DL500為Marker所在列。圖3為秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點處SNP的不同基因型(CC、CT、TT)測序圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。本發明通過對秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的單核苷酸多態性進行檢測，以便用於中國秦川牛肉用生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的秦川牛種群。1、秦川牛microRNA-320a-1基因含(rs518926539:C>T)突變的PCR引物的設計以NCBI所公布的海福特牛(GCF_000003055.6)序列為參考，利用Primer5.0設計能夠擴增包含秦川牛microRNA-320a-1基因及其上下遊各200bp的PCR引物對P1，其引物序列如下：上遊引物F1(SEQ.ID.NO.1)：CCGAGCCCAGCCTAGAGC18nt；下遊引物R1(SEQ.ID.NO.2)：CGCACCCCTTCGCACCCA18nt；以上述引物對秦川牛基因組擴增，能夠擴增秦川牛microRNA-320a-1基因的488bp片段，其中包含突變鹼基的序列部分。由於在此SNP位點處無自然酶切位點，不能通過直接酶切檢測，而如果人工設計PCR引物錯配，將CAGA(如圖1下劃線所示序列)錯配為CAGC，在沒有突變發生時，PCR擴增microRNA-320a-1基因後在錯配位置附近無法形成限制性內切酶PvuII識別位點而由C突變為T時，PCR擴增microRNA-320a-1基因後可形成PvuII識別位點這樣就可以對該位點SNP多態性進行檢測。所設計PCR擴增引物對P2為：上遊引物F2(SEQ.ID.NO.3)：TTCTCCCACGTTGCGTCCAGC21nt；下遊引物R2(SEQ.ID.NO.4)：GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT20nt。其中，上遊引物第21bp的A被錯配成C；引物對P2擴增的基因片段在引物對P1擴增的基因片段內部，大小是188bp，酶切分型後的電泳檢測如圖2所示。2、以引物對P2PCR擴增待測秦川牛的microRNA-320a-1基因片段(1)秦川牛樣本採集及基因組DNA提取1)秦川牛樣本的採集本發明具體以中國優良秦川牛品種的種群作為檢測對象，具體採集樣本見表1：陝西秦川牛(N＝227)，採集時間2014年6月；表1.秦川牛樣本的採集2)血樣基因組DNA的分離、提取a)冷凍血樣(主要為血細胞)室溫解凍，轉移500μL至1.5mLEppendorf離心管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心10min(4℃)，棄去上清液，重複上述步驟至上清液透明、沉澱呈淡黃色；b)在離心管中加入DNA抽提緩衝液500μL，搖動，使血細胞沉澱脫離離心管管壁，37℃水浴1h；c)加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)並混勻，55℃過夜至澄清。d)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500μL，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉入另一1.5mL離心管中，重複一次；e)加氯仿500μL，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉入另一1.5mL離心管中；f)加氯仿、異戊醇混合液(24:1)500μL，充分混勻20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉入另一1.5mL離心管中；g)加0.1倍體積的NaAc緩衝液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，直至白色的絮狀沉澱析出，-20℃保存30～60min；h)4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉澱2次；i)4℃，12000r/min離心10min，棄上清液，室溫下使乙醇揮發乾淨；j)乾燥後的DNA溶於80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-80℃保存。(2)PCR擴增PCR反應體系採用混合加樣法，即根據每一個反應體系所需的各種組分的數量和1次反應所需的PCR反應的個數，算出各種反應組分的總量，加入到1個1.5mL或者2.0mL離心管中，充分混勻後瞬時離心，再分裝到每個200μLEppendorfPCR管中，然後加入模板DNA，再瞬時離心後進行PCR擴增；PCR反應體系見表2：表2.PCR反應體系2×TaqPCRMasterMix12.5μL上遊引物F2(10pmol/L)0.5μL下遊引物R2(10pmol/L)0.5μLDNA模板(50ng/μL)1.0μLddH2O補足25μLPCR反應程序：3、PvuII酶切消化PCR擴增的microRNA-320a-1基因片段(1)PvuII酶切反應消化體系(20μL)：17μLPCR產物，10×Mbuffer2μL，PvuII(15U/μL)為1μL；(2)酶切消化條件：37℃恆溫培養箱中消化過夜。4、PvuII消化PCR產物後瓊脂糖凝膠電泳分析(1)瓊脂糖凝膠電泳製作3％的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳50min，EB染色；(2)待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在BIO-RADGelDoc2000凝膠成像系統成像；(3)根據瓊脂糖凝膠電泳結果分析SNP多態性：用BIO-RADGelDoc2000凝膠成像系統照相分析，判斷SNP的多態性：microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點發生由C到T的突變時，由於引入了鹼基錯配，PCR擴增microRNA-320a-1基因產物的序列為形成了限制性內切酶PvuII(CAG^CTG)的酶切位點；當沒有發生突變時時，PCR擴增microRNA-320a-1基因產物的序列為限制性內切酶PvuII不能識別，這樣就可以對該位點SNP多態性進行檢測。秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點多態性的瓊脂糖凝膠電泳結果為：CC基因型表現為188bp條帶，CT基因型表現為188bp、168bp、20bp條帶，TT基因型表現為168bp和20bp條帶。由於20bp較小，故在瓊脂糖電泳分析中不易觀察到，但通過188bp和168bp條帶還是能夠準確的鑑別CC基因型、CT基因型和TT基因型。如圖2，不包含168bp條帶為CC基因型個體，不包含188bp條帶為TT基因型個體，同時包含188bp和168bp條帶為CT基因型個體。5、不同基因型個體PCR產物的測序驗證利用ABI3730測序儀對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向測序；同時，進行SNP位置分析，結果見圖3。包含188bp和168bp條帶的雜合子CT基因型個體的測序結果的確為C或T，而CC基因型、TT基因型分別為C、T。6、秦川牛種群microRNA-320a-1基因SNP位點的頻率統計分析(1)基因型頻率基因型頻率是指一個群體中某種基因型個體數佔總個體數的比率。PCC＝NCC/NPTT＝NTT/N其中PCC、PTT代表某一位點的CC、TT基因型頻率；NCC、NTT表示群體中具有CC、TT基因型的個體數；N為檢測群體的總數量。(2)等位基因頻率基因頻率是指一個群體中某一基因數對其等位基因總數的相對比率。計算的公式可以寫成：PT＝(2NTT+NTT1+NTT2+NTT3+NTT4+……+NTTn)/2N式中，PT表示等位基因T頻率，NTT表示群體中具有TT基因型的個體數量，NTTi表示群體中具有TTi基因型個體數量，a1-an為等位基因T的n個互不相同的復等位基因。本研究所涉及的等位基因為C和T，所以具體的基因頻率計算公式為：PC＝(2NCC+NGC)/2NPT＝(2NTT+NGC)/2N式中，PC，PT分別表示等位基因C和T等位基因的頻率，NCC、NCT和NTT分別表示CC、CT和TT基因型的個體數量，N表示總群體數目。秦川牛microRNA-320a-1基因SNP中的C等位基因頻率以及T等位基因頻率如表3所示。表3.秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點基因頻率分布表7、microRNA-320a-1基因SNP位點與秦川牛生長性狀的相關性分析(1)數據分析測定的性狀包括：體重，體高，體長，胸圍，胸寬，胸深，坐骨端寬，腰角寬，十字部高，以及尻長。關聯分析一般線性的模型：用SPSS17.0軟體一般線性模型GLM(GeneralLinearModelsProcedure)對各基因型對生長性狀的影響進行顯著性檢驗。依據本實驗的其體情況建立如下統計模型：Yijk＝μ+Ai+Gj+Eijk,其中：Yijk：個體表型記錄；μ：總體均數；Ai：年齡效應；Gj：基因型效應；Eijk：隨機誤差。(2)關聯分析結果結果見表4。具有TT基因型的成年秦川牛個體在十字部高、體重上顯著大於CT型個體(PT)位點不同基因型表型差異顯著不同，如果傾向於選擇體格高大、體重大的個體，應選擇TT型。由此，在今後的育種工作中，可參考以上結果進行選種和淘汰，從而加快具有優質經濟性狀秦川牛種群的建立。表4.秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點多態性與生長性狀的關聯分析註：表中數值表示均值±標準誤差。上角標具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。核苷酸序列表西北農林科技大學秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用4118DNA人工合成1ccgagcccagcctagagc18218DNA人工合成2cgcaccccttcgcaccca18321DNA人工合成3aactcccacgttgcgtccagc21420DNA人工合成4gctcccctccgccttctctt20當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp