Notch蛋白及其配體的製作方法

2023-08-11 15:19:16 1

專利名稱：Notch蛋白及其配體的製作方法
技術領域：
本發明涉及在T-細胞活化的修飾中治療化合物的應用。尤其涉及在調節Notch蛋白家族成員和它們配件之間相互作用的應用以及在治療狀態如移植排斥、自身免疫、過敏反應、哮喘、感染疾病和腫瘤下這些化合物的應用。
T細胞之間以及抗原呈遞細胞(APC)和T細胞之間的控制的相互作用對人免疫系統的功能是至關重要的。然而在某些病理狀態下，對這個相互作用的正或負的修飾在治療上有益。例如在狀態如自身免疫、過敏反應或移植排斥下，通過促進負T細胞或T細胞-APC的相互作用誘導免疫反應的下調是合乎需要的。「感染耐受」和「結合抑制」的模型表明在少數T細胞中可以誘導耐受，然後這些T細胞將此耐受傳遞給其它T細胞，從而防止了有效的免疫攻擊。在其它病理條件下如腫瘤誘導的免疫抑制、寄生的病毒或細菌感染，免疫抑制是一個普遍特徵。在這些條件下，抑制傳遞感染耐受的T細胞相互作用是合乎需要的。
然而，至今還未理解T細胞以及T細胞-APC相互作用的機制。
WO 92/19734公開了人Notch和Delta基因的核苷酸序列以及它們所編碼蛋白的胺基酸序列。此公開內容表明Notch基因家族其良好特徵在於作為糾正昆蟲如果蠅屬的胚胎細胞譜系發育是必不可少的。
屬於Notch家族的蛋白是轉膜受體，具有7個保守肽結構域。家族中的每一蛋白表現特徵性的細胞外EGF(表皮生長因子)樣的重複以及近膜Lin-12/Notch結構域。此外每種蛋白在細胞質尾部具6-8錨蛋白重複結構域與PEST序列在一起。Notch配體具有鑑別DSL結構域(D，Delta，S，Serrate，L.Lag2)，在細胞外表面蛋白氨基端與3-8 EFF一樣重複之間包含20-22個胺基酸。蛋白有不具有保守功能結構域的短細胞質尾巴。
近來證據表明Notch信號在胸腺中作用於未成熟T細胞的譜系定型，偏向胸腺細胞向CD8+譜系的發育，CD8+譜系是獨立於MHC識別的(Robey E，等.細胞1996，87483-492)。在胸腺成熟的過程中，T細胞獲取了分辨自身抗原和非自身抗原的能力，此過程稱作自我耐受(von Boehmer H，等，免疫學年度評論，1990；8531)。在周邊也存在誘導和維持耐受的機制，在許多方面它們的重要性被低估。許多移植排斥、自身免疫疾病和對過敏原特異反應的實驗模型清楚地表明在抗原免疫的受體中誘導特異的無應答狀態(耐受或過敏)的能力。從這些系統中產生兩個重要的發現。首先，在選擇的條件下用抗原的肽片段免疫不僅可以抑制對本身的特異反應。而且可以抑制具有相同分子其它區域的完整蛋白激發免疫的特異反應。(結合抑制；Hoyne GF，等，實驗醫學雜誌1993；178183和Metzler B，Wraith DC，國際免疫學1993；51159)。其次，在移植實驗模型中最好描述的是「感染耐受」現象，其中假定對特異抗原產生耐受的免疫活性細胞能抑制其它細胞產生反應，進一步這些第二細胞群體變成調節和耐受的群體(Qin SX，等，科學1993；258974)。至今還未發現這些現象下的免疫機制的特徵。
本發明是由於發現了Notch受體家族和其配體而得到的，Delta和Serrate在外周免疫系統正常成體細胞的細胞表面表達。
因而根據本發明提供Notch-配體在用於免疫治療的藥物生產中的應用。
以前並未描述過Notch受體家族以及它們的配體在正常外周成體免疫系統中的表達方式，但本發明者已表明T細胞組成地表達Notch 1mRNA，而Delta的表達只限於外周淋巴組織中T細胞的一個亞群。Serrate的表達好象限制於外周中抗原呈遞細胞(APCs)的一個亞群(

圖1)。因而如在其它組織中所表明的那樣這受體配體家族在胚胎發育之後可以繼續在免疫系統中調節細胞命運決定(Ellisen LW，等，細胞1991；66649)。Notch信號可以在外周無應答性(耐受或過敏)的誘導中具有核心作用，並可以對結合抑制和感染耐受提供物理解釋。
本發明進一步涉及在治療T細胞介導的反應中Notch-配體的應用。已觀察到在過敏原或抗原存在時通過將原初T細胞群體暴露給APC所表達的Notch-配體，Notch-配體能使T細胞群體對所述過敏原或抗原產生耐受。進一步，此T細胞群體，繼續暴露於天然T細胞的第二群體時能夠使第二個群體對所述過敏原或抗原產生耐受。
這樣，本發明也涉及在影響結合耐受和/或旁觀者耐受(在本領域中也已知為感染耐受)中的Notch-配體的應用。
本發明的另一個實施方案涉及Notch-配體在功能性Notch-蛋白表達或Notch信號通路的調控中的應用。
在上面描述的本發明實施方案中，在過敏原或抗原存在下，通過將T細胞與抗原呈遞細胞(APCs)孵育/混合，將Notch配體暴露給T細胞，表達或過表達Notch-配體。通過用能表達Notch-配體的基因轉染APCs或通過將APCs暴露給能上調內源Notch-配體基因表達的藥物，可引起Notch-配體基因的(過)表達。
影響Notch-配體表達的合適藥物包括影響Delta和/或Serrate基因表達的藥物。例如對於Delta的表達，細胞外BMPs(骨形態發生蛋白，Wilson，P.A和Hemmati-Brivanlou A.1997神經元18699-710，Hemmati-Brivanlou，A和Melton，D，1997細胞8813-17)和它們受體的結合由於抑制了Achaete/Scute複合轉錄因子的表達導致了Delta轉錄的下調。我們認為此複合物直接參與了Delta表達的調控。這樣任何抑制BMPs和它們的受體結合的藥物都能造成Delta和/或Serrate表達的增加。這些藥物包括頭蛋白、Chordin、Folhstatin、Xnr3、FGFs、Fringe以及其衍生物和變異體(見參考文獻，頭蛋白-Smith W.C.和Harland，R.M細胞70829-840，Chordin-Sasai，Yet等，1994細胞79779-790)。頭蛋白和Chordin與BMPs的結合，因而防止了它們信號級聯的活化，此信號級聯導致Delta轉錄的下降。
在某些疾病狀態，機體可以是無免疫應答的，為了克服強加的免疫抑制下調Delta和/或Serrate的表達是合乎需要的。在此條件下可以使用抑制Delta和/或Serrate表達的藥物。抑制Delta和/或Serrate表達的藥物的例子包括Toll蛋白(Medzhitov，R.等，1997自然388394-397)、BMPs以及降低或幹擾頭蛋白、Chordin、Follistatin、Xnr3、FGFs和Fringe合成的其它藥物。這樣，本發明進一步涉及在用於逆轉細菌感染或腫瘤誘導的免疫抑制的藥物生產中使用能下降Delta或Serrate蛋白表達的藥物。
如上面所討論的，本發明也涉及在細胞膜上或信號通路中Notch-蛋白表達或呈遞的修飾。已表明這些參與T-細胞介導的反應，而此反應參與耐受(結合的和/或旁觀者)的誘導。加強完整功能的Notch-蛋白在細胞表面呈遞的藥物包括基質金屬蛋白酶，例如果蠅屬Kuzbanian基因的產物(Dkuz，Pan，D和Rubin，G.M.1997細胞90271-280)和其它ADAMALYSIN基因家族成員。降低或幹擾它們作為完整功能細胞膜蛋白呈遞的藥物可以包括MMP抑制劑，如hydroxymate抑制劑。
如此處所用的術語「抗原呈遞細胞等」，並不意味著限於APCs。技術人員將理解為可以使用任何將所需要Notch-配體呈遞給T細胞的載體，為了方便用術語APCs指所有這些。這樣合適的APCs的例子包括樹突細胞、L細胞、雜交瘤、淋巴瘤、巨噬細胞、B細胞或合成的APCs如脂膜。
當APCs用能表達Notch-配體的基因轉染時，通過病毒如逆轉錄病毒或腺病毒，或通過能將基因傳遞給細胞的任何其它載體或方法可以進行轉染。這包括在基因治療中有效的任何載體或方法，包括逆轉錄病毒、脂質體、電穿孔、其它病毒如腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、牛痘、磷酸鈣沉澱DNA、DEAE葡聚糖幫助的轉染、微注射、聚乙二醇、蛋白-DNA複合物。
單獨或聯合使用這些載體或方法，有可能定點將基因轉移至細胞的特異群體，這樣能夠體內執行本發明的方法。例如，為了提高DNA吸收的效率病毒可以和脂質體聯合使用。通過在病毒外殼或脂質體中加入特異的蛋白(如和樹突細胞/巨噬細胞CD11c反應的單鏈抗體)可以獲得點特異的傳遞。
優選使用這樣的構建物，通過此構建物基因(如serrate)的表達和抗原的表達相結合。(過)表達Serrate的APCs因而也表達高水平的相關抗原，所以優先和具有合適特異性的T細胞相互作用。
本發明另一個實施方案涉及一個分子，它包含和T細胞過敏原或抗原部分可操作連接的Notch-配體部分，這樣一旦暴露給T細胞，兩部分都能和其各自位點結合。這個分子能使抗原/過敏原特異的T細胞對抗原或過敏原部分所依據的抗原或過敏原產生耐受，因為Notch-配體部分所需的特異性由過敏原或抗體部分的極近端提供。
抗原或過敏原部分可以是合成的MHC-肽複合物。這是帶有抗原溝的MHC分子的一個片段，而抗原溝帶有抗原的元件。此複合物已在Altman JD等，科學1996 27494-6中描述過。
在另一個優選的實施方案中，化合物是融合蛋白，包含Notch的區段或Notch配體細胞外結構域和免疫球蛋白Fc區段，優選IgGFc或IgMFc。
在上面描述的所有本發明的實施方案中，優選Notch-配體是Serrate家族蛋白或Delta家族蛋白、其衍生物、片段或類似物。
可以描述為由T細胞介導的疾病或感染狀態包括下面的任一個或更多哮喘、過敏反應、移植排斥、自身免疫、腫瘤誘導的對T細胞系統的異常(abberations)以及感染疾病如由瘧原蟲屬、微絲蚴屬、蠕蟲、分枝桿菌、HIV、巨細胞病毒、假單胞桿菌屬、弓形蟲屬、棘球屬、流感嗜血桿菌B型、麻疹、C型肝炎或Toxicara所引起的疾病。這樣使用合適的過敏原或抗原，按照本發明，Notch-配體可用以治療所述疾病或感染。
本發明也提供用於檢測由侵入有機體誘導的免疫抑制的方法。這些有機體可以產生Serrate、Notch和/或Delta家族成員的可溶形式或其衍生物、或者體內影響它們表達的蛋白，這樣誘導了感染耐受免疫抑制。此方法包括檢測體內非膜結合的Serrate、Delta、Notch或其衍生物的存在，並優選包括對Serrate、Delta或Notch或其衍生物的抗體。
在檢測增加或降低的Notch、Delta/Serrate表達和/或加工的篩選實驗中所使用的方法包括1.在培養中將分離的細胞暴露給檢測化合物後用以下評估Delta/Serrate、Notch和Fringe的表達(a)在蛋白水平，使用免疫組織化學和流式細胞術通過特異抗體染色。
(b)在RNA水平，通過定量的逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。使用對Notch 1和Notch 2、Serrate 1和Serrate 2、Delta 1和Delta 2、Delta 3和Fringe特異的引物RT-PCR使用有內標準的對照質粒檢測內源基團的表達。當新配體要鑑定時可以修改此構建物。
(c)在功能水平，用細胞粘著試驗。
增加的Delta/Serrate或Notch表達會導致表達Notch的細胞和其配體Delta/Serrate之間粘著的增加。檢測細胞在培養中將經過特定處理，並在上面鋪上放射標記或螢光素標記的靶細胞(用Notch/Delta/Serrate蛋白轉染的)。細胞混合物將於37℃培養2小時。衝掉非粘著細胞，在平板表達通過放射活性/免疫螢光水平測量粘著水平。
使用此方法有可能檢測影響Notch-蛋白或Notch-配體表達或加工的化合物或Notch-配體。本發明也涉及由這些檢測方法可檢測的化合物或Notch-配體。
本發明也包括一種檢測方法，包括將(a)Notch蛋白以及能和Notch蛋白結合的配體與(b)化合物相接觸；確定是否化合物影響配體與Notch蛋白的結合，其中優選伴隨T細胞的Notch蛋白。
本發明使用的Notch-配體優選Delta或Serrate家族成員蛋白或多肽或其衍生物。這些通過使用本領域技術人員熟知的重組技術的基本操作技術可優選獲得。產生本發明這些化合物的合適基因序列可以從公開文獻WO 97/01571、WO 96/27610和WO 92/19734中獲得。然而發明並不受這些公開文獻所公開的Notch、Delta和Serrate序列限制。更優選地，這些Notch、Delta或Serrate或家庭成員、其蛋白或多肽或衍生物是Notch、Delta或Serrate、或家族成員細胞外結構域片段或這些片段的衍生物。如此處所使用，術語「Notch配體」進一步包括和Notch蛋白家族成員相互作用的任何配體或配體家族成員，以及一組稱為「toporythmic蛋白」的蛋白，即Delta，Serrate、Deltex和破裂基因增強子基因的蛋白產物以及其基因家族的其它成員的蛋白產物，它們可通過如下方式鑑定基因序列可和Notch、Delta或Serrate蛋白雜交或同源，抑或它們的基因顯示出表型相互作用的能力。
Notch、Delta和Serrate首先在果蠅屬中描述，因而分別代表Notch受體和Notch-配體家族成員的典型蛋白。在許多無脊椎和脊椎動物種中已描述了多個Notch蛋白和配體，但它們的命名不同於蠅中所用的命名。例如Notch是Lin 12和Glp 1的同系物，Serrate/Delta是Jagged、Apx 1和Lag-2的同系物。
根據本領域熟知的原理可以製成本發明的藥物配方。這樣賦形劑的性質和活性的量依賴於要製成的本發明化合物。
優選藥物組合物是單位劑量形式。
以藥物配方形式要施用給患者的本發明化合物的劑量可由合適的醫師確定。
本發明配方優選的用藥途徑是普通用藥方法中的任一個，包括肌肉內、腹膜內、靜脈內注射、鼻內吸收、肺吸入、皮下、皮內、關節內、鞘內、體表以及通過胃腸道(例如通過淋巴集結)。
與本發明蛋白或多肽相關，如此處所用的術語「衍生物」包括從序列中替代、變異、修飾、置換、刪除或加入一個(或多個)胺基酸殘基，只要得到的多肽蛋白具有調節Notch-Notch配體相互作用的能力。
與本發明蛋白或多肽相關，如此處所用的術語變異體包括從序列中替代、變異、修飾、置換、刪除或加入一個(或多個)胺基酸殘基，只要得到的蛋白具有調節Notch-Notch配體相互作用的能力。
與本發明蛋白或多肽相關，如此處所用的術語「類似物」包括任何肽模擬，即以與親本蛋白或多肽相似方式具有調節Notch-Notch配體相互作用能力的化學化合物。這些包括可以興奮或拮抗Notch-蛋白或Notch-配體表達或活性的化合物。
如果化合物能抑制或增強Notch與其配體的相互作用，優選至足夠提供治療效應的程度，我們認為此化合物調節Notch-Notch配體相互作用。
如此處所用術語「Notch-Notch配體」表示Notch家族成員和能與一個或多個此成員相結合的配體之間的相互作用。
如此處所用術語治療應該包括診斷和預防應用。
術語「醫學的」包括人和獸醫應用。
如此處所用，術語蛋白和多肽可以認為是同義詞，廣義上蛋白僅表示比多肽中存在更長的胺基酸序列。
通過無限制實施例的方法現在將描述本發明，參考伴隨的附圖，其中圖1表示如此處實施例1所述進行的原位雜交的結果。
圖2表示實施例4中所述實驗結果。
圖3表示實施例5中所述實驗結果。
圖4表示實施例6中所述實驗結果。
圖5表示實施例7中所述實驗結果。
圖6表示實施例8中所述實驗結果。
圖7表示實施例9中所述實驗結果。
圖8a和8b表示實施例10中所述實驗結果。
圖9表示實施例11中所述實驗結果。
實施例1在外周免疫系統中表達的Notch、Delta和Serrate合成對Notch 1、Delta 1和Serrate 1特異的反義RNA探針並摻入地高辛標記-UTP。每一個探針在雜交緩衝液中溶解，加熱至70℃、5-10分鐘，加到TESPA包被的、含10mm脾或胸腺切片的玻片上，脾或胸腺切片已用4％低聚甲醛+PBS固定。玻片於65℃過夜雜交。第二天，玻片用1×SSC/50％甲醯胺/1％Tween 20在65℃洗滌兩次、室溫(RT)洗滌兩次。玻片在RT用0.1M馬來酸/0.15MNaCl/0.1％tween 20 pH 7.5(MABT)緩衝液洗滌兩次，然後用MABT+20％山羊血清+296 Boehringer封閉劑(BBR)封閉兩小時。玻片室溫用抗-地高辛Fab片段過夜溫育。用MABT洗滌四次後，玻片進一步在鹼性底物緩衝液中洗滌兩次。通過在黑暗中在含NBT+BCIP的底物緩衝液中溫育玻片檢測結合的反義RNA探針的存在。玻片用蘇木精復染，並在Depx封固劑中封片。結果雜交結果顯示於圖1中，表明在3月齡小鼠的脾中，Delta和Serrate在動脈周圍鞘而非生發中心(gc)的分離細胞中表達。Notch在動脈周圍鞘中的許多細胞中表達。
實施例2Delta-Fc融合蛋白的合成pIG-1[D.Simmons，「通過在哺乳細胞中瞬時表面表達克隆細胞表面分子」pp93-128，發育中細胞的相互作用，編輯D.Hartley，出版Ox.Uni.Press(1993)]表達載體允許含有與人IgGl-Fc結構域結合的Delta 1細胞外部分的融合蛋白合成。只含Delta 1蛋白細胞外結構域的限制酶片段克隆進pIG-1載體。得到的質粒轉化進大腸桿菌MC 1061，並在含10μg/ml四環素/氨苄青黴素的SOB上生長。純化的載體用於體外轉染COS細胞。COS細胞生長至50-75％匯合度，通過DEAE-葡聚糖的方法每皿用10μg質粒DNA轉染。轉染後24小時用含1％FCS的培養基置換培養基，細胞體外繼續培養3-6天。細胞5000 rpm離心5分鐘形成細胞沉澱和碎片，去除上清並儲藏至需要時。通過將2ml 50％蛋白懸浮液加至瓊脂糖(phamacia)中並於4℃過夜轉動從培養上清中純化Delta-Fc融合蛋白。通過將培養上清通過0.45mm濾膜分離瓊脂糖珠，洗滌並轉移至10ml塑料柱上。用2ml洗脫液pH4.0洗脫Delta-Fc融合蛋白。加入1M Tris鹼中和洗脫物。
實施例3用於研究Notch-配體信號通路的模型的實施例對自身抗原外周的耐受在T細胞受體(TCR)轉基因小鼠中得到分析，其中TCR配體只在外周中作為自身抗原表達。在幾種方法中可以誘導對移植抗原的外周耐受，包括T細胞抗體的受體預處理或共刺激的阻斷。因而有可能顯示結合抑制和感染抑制。通過鼻內轉移過敏原來源的肽可以誘導對過敏原的外周耐受。在過敏原吸入和顯示的耐受修飾後在收集到導氣管內的細胞或/和淋巴組織上測量Notch-Notch配體的表達。進一步，在使用感染劑的感染實驗模型中，在生物體(病原體)和宿主的免疫活性細胞上測量Notch-Notch配體的表達。
實施例4表達Delta的雜交瘤能夠抑制已接觸抗原的淋巴細胞的反應用含有住宅塵蟎過敏原(HDM)Der p1(p110-31)免疫顯性表位的合成肽或用卵白蛋白(OVA，母鳴卵白蛋白)免疫小鼠。一周後去除淋巴結細胞(LNCs)並製備細胞懸液。來自不同抗原免疫的動物的淋巴結保持分離。這些細胞稱作已接觸抗原的LNCs。
T細胞雜交瘤用全長Delta或對照質粒轉染，這樣Delta作為膜蛋白表達。兩天後照射培養的雜交瘤以防止它們增殖或產生細胞因子。因此在實驗中所測量的反應只來自淋巴結細胞。
已照射的雜交瘤以增加的數目加到含有已接觸抗原的LNCs。加入合適的抗原(即p110-131或OVA)，細胞培養24小時。收集上清液，測量IL-2(主要的T細胞生長因子)含量。72小時後也可以測量淋巴結細胞的增殖反應。結果如圖2所顯示，在表達對照質粒的已照射雜交瘤存在下培養的淋巴結細胞仍然增殖，當培養時用合適抗原刺激時可以分泌IL-2。它們的反應性保持在1∶1 LNC雜交瘤的比率。相反當淋巴結細胞在表達全長Delta(1∶1的比率)的雜交瘤存在下培養並用合適抗原刺激時，淋巴結細胞的增殖反應和IL-2的合成降低至少88％。用對照病毒(圓形)、Delta病毒(正方形)轉染雜交瘤。圖2顯示數據為培養開始後72小時3H-Tdr摻入的每分鐘計數(cpm)。與表達Delta或對照構建物的雜交瘤一起培養的淋巴結細胞(LNC)的cpm。總的細胞數目/孔＝4×105(即LNCs的數目根據雜交瘤對LNC的比率而變化，所以cpm將會變化)。p110-131 LNC是已接觸抗原Derp1(p110-131)的細胞，OVA LNC是已接觸抗原OVA的細胞。2BB11和2BC3是兩種不同Der p1反應的雜交瘤。
這些數據表明表達Delta的T細胞所產生反應的抑制可以反式傳遞。儘管在此培養系統中，對Der p1特異的Delta表達的T雜交瘤能抑制已接觸OVA的T細胞的反應，但特異性的明顯缺乏是由於培養系統所產生的緊密鄰近。的確，圖8a和8b顯示的數據表明在動物中表達delta的雜交瘤要對免疫原的免疫應答具有調節效應，則表達Delta的雜交瘤必須與此免疫原共同享有抗原的特異性。在此情況下，如果表達delta的T細胞在相同APC上識別相同抗原，則只能把它們與反應T細胞靠近。
實施例5表達Serrate的樹突細胞防止T淋巴細胞的抗原激活樹突細胞(DCs)是免疫系統中主要的抗原呈遞細胞，對刺激T細胞反應是關鍵的。從脾中獲取DCs，並用允許表達全長Serrate蛋白的逆轉錄病毒或對照逆轉錄病毒轉染。DCs也用HDM肽p110-13137℃體外受脈衝作用3小時。然後洗滌DCs並用105細胞/小鼠皮下免疫原初(首次用於實驗的)小鼠。7天後收集引流的LNCs並在培養中在4×105細胞/孔用肽再刺激。因為小鼠只用肽-接觸的DCs免疫，這使我們可以測量這些細胞激活免疫反應的能力。結果圖3表示顯示的數據為來自對照轉染(圓形)或serrated轉染(正方形)樹突細胞(DCs)免疫的動物、培養後72小時LNCs的cpm。
和對照DCs免疫相比，用表達Serrate的DCs免疫的小鼠在從淋巴結收集的細胞數目上降低10倍。和來自用對照DCs免疫的小鼠的細胞相比，我們進一步發現來自用DCs+Serrate免疫的小鼠的LNCs不能增殖(在對照值上下降93％，圖3)或分泌IL-2。
實施例6表達Delta的T細胞雜交瘤在動物中能夠抑制對Der p1抗原的免疫發展T細胞雜交瘤(用Der p1激活)用含小鼠Delta的逆轉錄病毒或用對照病毒轉染，此Delta在細胞表面表達。C57 BL小鼠用1×107已照射的雜交瘤腹腔內注射，並用乳化在完全弗氏佐劑(CFA)中的50微克Der p1皮下免疫。7天後收集引流的淋巴結細胞，以4×105細胞/孔用Der p1(10微克/ml)、Der p1的肽110-131(10微克/ml)、或Der p1的肽81-102(10微克/ml)培養。培養物37℃培養72小時，在最後8小時的培養中加入氚化的胸苷。圖4顯示來自用對照轉染(puro)或Delta轉染(Delta-FL)注射的動物的細胞增殖實驗的結果。結果在Der p1、肽110-131或肽81-102存在時在培養中增殖。來自用對照病毒轉染的雜交瘤注射的動物的LNC產生高水平的IL-2，相反，來自用表達Delta的雜交瘤注射的動物的細胞對Der p1抗原的任一個都無反應(圖4)。
實施例7表達Delta的人T細胞能封閉正常T細胞流感激活的人T細胞克隆(HA 1.7)用含小鼠Delta的逆轉錄病毒構建物轉染以允許細胞表面表達Delta蛋白。將此細胞群和正常HA1.7的混合防止了這些正常HA 1.7用肽HA 306-318和抗原呈遞細胞的隨後活化。5×105HA 1.7和1×106已照射的DRB1*0101外周血單核細胞(PBMC)+1微克HA 306-318混合，並在37℃培養。6小時後5％lymphocult(含IL-2的培養基)加至1ml的總體積中。開始培養後24小時加入Delta或對照逆轉錄病毒或不加任何東西。開始培養後7天，收穫、衝洗細胞，並照射轉染的細胞。轉染的細胞以2∶1的比率和未處理的HA 1.7混合，並培養2天。然後收穫混合培養物，衝洗並以2×104可成活細胞和下列一起鋪盤a)2.5×104DRB 1*0101 PBMCs(培養基)b)2.5×104DRB1*0101 PBMCs+肽(Ag+APC)c)5％lymphocult(IL-2)培養68小時，在最後8小時加入氚化的胸苷後收穫細胞。結果顯示於圖5。結果單獨培養或與對照病毒轉染的HA 1.7培養後，未處理的HA 1.7對肽+抗原呈遞細胞有很好的反應。與Delta轉染的已照射HA 1.7一起培養完全防止了未處理HA 1.7對抗原+APC的反應。然而這些細胞與未處理或對照病毒培養的HA 1.7一樣對IL-2有反應，表明它們不僅僅是不能增殖(圖5)。
實施例8抗原呈遞細胞的Serrate表達防止T細胞的反應克隆HA 1.7在表達HLA-DRB1*0101的L細胞(作為抗原呈遞細胞)存在下與肽HA 306-318(1.0微克/ml)混合，每種細胞類型使用2×104。L細胞用對照(puro)或表達Serrate(Serrate L細胞)的逆轉錄病毒轉染。72小時以後，最後8小時的培養加入氚化胸苷，測量增殖反應。對HA 1.7培養物的結果顯示於圖6a)單獨
b)+IL-2
c)+肽+DRB1*0101-L細胞
d)+肽+用對照病毒轉染的DRB1*0101-L細胞
e)+肽+用serrate病毒轉染的DRB1*0101-L細胞
結果與由對照轉染的L細胞所激活的HA 1.7相比，由表達serrate的L細胞所激活的HA 1.7對抗原反應很弱(圖6)。
實施例9表達Serrate的抗原呈遞細胞誘導調節T細胞克隆HA 1.7在2％IL-2存在下和肽HA 306-318以及L細胞(表達DRB1*0101，作為抗原呈遞細胞)混合。L細胞用對照或表達serrate的逆轉錄病毒轉染。培養7天後，與新鮮HA 1.7混合之前收穫、衝洗並照射HA 1.7(每種細胞群用2×104)。用肽(1.0微克/ml)+正常的抗原呈遞細胞(DRB1*0101 PBMCs)刺激之前細胞進一步培養2天。培養72小時後，最終8小時的培養加入氚化的胸苷，測量增殖反應。對新鮮HA 1.7的結果顯示於圖7a)單獨
b)+IL-2
c)+對照病毒誘導的HA 1.7，然後肽+DRB1*0101 PBMC
d)+serrate病毒誘導的HA 1.7，然後肽+DRB1*0101 PBMC
結果由表達serrate的L細胞誘導的HA 1.7阻止了正常HA 1.7對正常抗原刺激的反應(圖7)。這表明由暴露給serrate所耐受的細胞將它們的耐受傳遞給原初細胞群的能力(感染/旁觀者耐受)。
實施例10由表達delta的T細胞所誘導的調節是抗原特異的用107delta或對照逆轉錄病毒轉導的T細胞雜交瘤細胞注射小鼠。雜交瘤是2BC3，它對Der p1的肽110-131具有特異性。同時動物接受乳化於完全弗氏佐劑中的Der p1或卵白蛋白。7天後，去除淋巴結細胞，在Der p1或卵白蛋白(用與它們被免疫時相同的抗原)存在下培養4×105細胞。
開始培養後24小時測量IL-2的合成。對用對照(puro)或Delta(delta)逆轉錄病毒轉染的雜交瘤注射的動物，IL-2合成的刺激指數顯示於圖8a(用Der p1免疫的動物的反應)和8b(用OVA免疫的動物的反應)。結果在用表達delta的2BC3雜交瘤注射的動物中對Der p1的反應基本上完全取消，而對卵白蛋白的反應則無影響。數據顯示於圖8a和8b，其中每一點作為對照反應(無抗原加入)的刺激指數(SI)代表由每個小鼠對抗原的IL-2的合成。
實施例11耐受誘導的過程中Delta在T細胞上表達在缺少APCs、存在肽HA 306-318(50μg/ml)時培養HA 1.7。此條件在HA 1.7中產生耐受狀態。0、30、120、240或360分鐘後收穫細胞(1.5×106)、沉澱並冷凍。通過在硫氰酸胍中勻漿接著通過CsCl密度離心從細胞沉澱中製備RNA。使用oligo dT引物將1μgRNA轉換成cDNA。使用對人delta同系物特異的引物將得到的cDNA的1/20用於PCR(40個循環)。凝膠電泳分析PCR樣品(圖9)，其中第一道、標記、第2道、t＝0、第3道、t＝30分鐘、第4道、t＝120分鐘、第5道、t＝240分鐘、第6道、t＝360分鐘、第7道是負對照。結果檢測的HA 1.7並不表達Delta mRNA，但在耐受試驗開始2小時內出現轉錄物。
實施例12耐受誘導過程中通過免疫組織學和原位雜交分析Notch 1、Serrate 1和Delta 1在連續三天內用100μg Der p1肽110-131或對照溶液(磷酸鹽緩衝液，PBS)鼻內處理C57 BL/6J小鼠。已知此種方法鼻內施用抗原可誘導對抗原的耐受。通過將50μg Der p1/CFA皮下注射進尾基部用抗原再激發之前，一些動物休息2周。在此後幾個時間點(do是鼻內處理或抗原再激發的第一天)收穫表層的淋巴結及動物的脾，並進行免疫組織學或原位雜交。對免疫組織學，冷凍組織並切3μm的切片，在冰預冷的丙酮中固定並用對Notch 1和Serrate 1特異的單克隆抗體染色。用以二氨基聯苯胺為底物的辣根過氧化酶偶聯的山羊抗兔抗體檢測結合抗體。對此研究未得到Delta 1特異的抗體。對原位雜交，冰凍組織切片並在4％多聚甲醛中固定。在65℃切片用對Notch 1、Serrate1及Delta 1特異的地高辛偶聯反義RNA探針雜交。通過鹼性磷酸酶偶聯的山羊抗地高辛抗體檢測結合抗體接著用NBT和BCIP作為底物檢測對顯示於表1和表2的數據分別是免疫組織學和原位雜交。數據代表單獨鼻內肽(PBS/p110-131最初的)或鼻內和皮下抗原(PBS/p110-131再激發)後從5個不同小鼠中所取組織的分析。+弱染、++中度染色、+++強染結果在只接受PBS的對照小鼠中表達基本水平的Notch、Delta和Serrate。鼻內施用PBS並皮下注射抗原的小鼠在再激發的8天內三種分子的表達都表現中度的增加。單獨鼻內施用肽或鼻內施用肽接著用抗原再激發的動物表現出相同方式的Notch、Delta和Serrate增加的表達，它比對照小鼠增強快得多並且大得多。
表1誘導免疫耐受過程中Notch和Serrate蛋白的表達處理 0天 1天 4天 8天12天Notch 1PBS首次+ ++ + +PBS再刺激 + ++ +/++ +/++p110-131首次 + +++++++++p110-131再刺激 + +++++++++Serrate 1 PBS首次+ ++ + +PBS再刺激 + ++ +/++ +/++p110-131首次 + +++++++++p110-131再刺激 + +++++++++表2誘導免疫耐受過程中Notch、Delta和Serrate轉錄物的表達處理 0天 1天4天8天12天Notch 1PBS首次++ + + +PBS再刺激 ++ + +/++ +/++p110-131首次 ++ ++ ++++++p110-131再刺激 ++ ++ ++++++Serrate 1 PBS首次++ + + +PBS再刺激 ++ + +/++ +/++p110-131首次 ++ ++ ++++++p110-131再刺激 ++ ++ ++++++Delta 1PBS首次++ + + +PBS再刺激 ++ + +/++ +/++p110-131首次 ++ ++ ++++++p110-131再刺激 ++ ++ ++++++
本發明的其它修改對本領域的技術人員是顯而易見的。
權利要求
1.Notch-配體在生產用於免疫治療的藥物中的應用。
2.根據權利要求1的應用，其中免疫治療涉及T細胞介導的疾病或感染的治療。
3.根據權利要求2的應用，其中T細胞介導的疾病或感染是由於下面疾病中的一個或更多過敏反應、移植排斥、自身免疫、腫瘤誘導的對T細胞系統的異常以及感染疾病如由瘧原蟲屬、微絲蚴屬、蠕蟲、分枝桿菌、HIV、巨細胞病毒、假單胞桿菌屬、弓形蟲屬、棘球屬、流感嗜血桿菌B型、麻疹、C型肝炎或Toxicara所引起的疾病。
4.根據權利要求1至3的應用，其中Notch-配體選自serrate、Delta或其片段、衍生物或類似物。
5.Notch-配體或其片段、衍生物或類似物，用於影響結合抑制。
6.Notch-配體或其片段、衍生物或類似物，用於影響感染耐受。
7.使T細胞對過敏原或抗原耐受的方法，包括在所述過敏原或抗原存在下，將所述T細胞和表達或過表達Notch-配體的抗原呈遞細胞培養/暴露。
8.根據權利要求7的方法，其中Notch-配體的(過)表達是由於用能表達所述配體的病毒轉染的APC。
9.根據權利要求7的方法，其中Notch-配體的(過)表達是由於由上調Notch-配體表達基因表達的藥物所刺激的APC。
10.根據權利要求9的方法，其中藥物選自頭蛋白、Chordin、Follistatin、Xnr3、成纖維細胞生長因子或其衍生物或片段。
11.根據權利要求7、8、9或10的方法，其中APC選自樹突細胞、L細胞、雜交瘤、淋巴瘤、巨噬細胞、B細胞或合成的APCs如脂膜。
12.根據權利要求7至11任一項的方法，其中Notch-配體選自Serrate、Delta或其片段、衍生物或類似物。
13.一種分子，包括與T細胞過敏原或抗原部分可操作地連接的Notch抗原部分，從而在與T細胞接觸時兩部分都能與其各自位點結合。
14.根據權利要求12或13的分子，其中Notch-配體部分選自Serrate、Delta或其片段、衍生物或類似物。
15.一種融合蛋白，包括Notch配體細胞外結構域區段和免疫球蛋白Fc區段。
16.根據權利要求15的融合蛋白，其中Notch配體細胞外結構域源於Notch、Delta或Serrate。
17.根據權利要求15或16的融合蛋白，其中Fc區段是IgGFc或IgMFc。
18.試劑盒，包括固定化的Notch或其家族成員，以允許對源自病原體、移植物或移植宿主細胞的可溶Notch配體進行測量。
19.一種檢測方法，包括將(a)Notch蛋白和能夠與Notch蛋白相結合的配體和(b)化合物相接觸；並確定是否化合物影響配體和Notch蛋白的結合。
20.能夠和病原生物體、腫瘤或移植物所表達或分泌的Delta或Serrate蛋白或它們的衍生物相結合的配體，用於醫學治療。
21.一種檢測方法，包括確定可溶的、游離的Serrate、Notch或Delta家族成員或其形式的體內水平。
22.一種檢測化合物對有功能的Notch-蛋白或Notch配體表達或加工影響的測定方法，包括將表達Notch-蛋白或Notch配體的細胞和化合物相互接觸；並監控所述蛋白或配體表達或加工的增加或降低。
23.由權利要求22的檢測方法可檢測到的化合物、Notch-配體、其衍生物、片段或類似物。
24.能夠下調Delta或Serrate蛋白的表達或降低作為細胞膜蛋白存在的製劑在製備用於逆轉細菌、感染或腫瘤誘導的免疫抑制的藥物中的應用。
25.根據權利要求24的應用，其中製劑是Toll蛋白或骨形態發生蛋白。
26.Notch-配體在調節有功能的Notch蛋白表達或Notch信號通路中的應用。
全文摘要
本發明涉及T細胞修飾中治療化合物的應用,T細胞抗原呈遞細胞(APC)相互作用和發病生物體與宿主免疫活性細胞相互作用。它尤其涉及這些化合物在Notch蛋白質及其配體相互作用的修飾中的應用以及這類化合物在移植排斥、自身免疫、過敏反應和哮喘及傳染病治療中的應用。
文檔編號A61P33/00GK1242802SQ97181159
公開日2000年1月26日 申請日期1997年11月6日 優先權日1996年11月7日
發明者J·R·拉姆布, M·J·達爾曼, G·F·霍因 申請人:洛倫蒂斯有限公司