篩選靶蛋白配體的方法

2023-08-11 15:19:36

篩選靶蛋白配體的方法
【專利摘要】本發明提供了一種利用質譜篩選與靶蛋白結合的小分子配體的方法，包括以下步驟：將該靶蛋白與小分子化合物庫接觸以生成靶蛋白-小分子複合物，分離該靶蛋白-小分子複合物，將該靶蛋白-小分子複合物中的小分子解離，然後利用質譜檢測從上述複合物中解離出的小分子，從而間接地篩選得到與該靶蛋白有結合作用的小分子，即該靶蛋白的配體。該方法可用於高通量篩選新的小分子藥物。
【專利說明】篩選靶蛋白配體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛋白配體的篩選，特別是涉及利用質譜篩選與靶蛋白結合的小分子配體的方法，可用於新藥研發中對新藥前體分子的發現和創製。【背景技術】
[0002]高通量藥物篩選技術是將多種技術方法有機結合而形成的新的技術體系，它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化作業系統執行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器採集實驗數據，以計算機對實驗獲得的數據進行分析處理。它的正常開展需要有一個高容量的化合物庫、自動化的作業系統、高靈敏度的檢測系統、高效率的數據處理系統以及高特異性的藥物篩選模型。
[0003]高通量篩選技術與傳統的藥物篩選方法相比有反應體積小、自動化程度高、靈敏快速、特異性強等特點。由於組合化學的發展，同時可合成數百個或數千個相關化合物，短時間內即可獲得上萬個化合物。高通量篩選具有更為高效、快速和經濟的優勢，越來越廣泛地參與到藥物發現過程中，形成了線索分子篩選-確定先導化合物-先導化合物優化-藥理學研究的技術路線。高通量分子藥物篩選中心是聯合研究院開發研製大量新藥的關鍵技術支撐。目前已初步建立的藥物篩選流程主要包含高通量篩選和蛋白質複合物晶體結構分析。
[0004]然而，高通量篩選技術目前仍有若干欠缺，這些欠缺包括:假陽性問題；對於某些靶蛋白不存在現成的高通量篩選測試方法；根據靶蛋白的功能發展一套特定的高通量篩選測試方法，往往是費時費力的過程，通常需要對測定該蛋白的酶活性的常規生化方法進行很多的改變和優化才能達到建立高通量篩選方法的要求，而且一旦改換待研究的靶蛋白，就需要重新設計方法；高通量篩選技術通常篩選的對象是純化的化合物單體。如果帶測試的對象為混合物(例如天然產物粗分得到的不同組分)，則給出的數據代表的是多組分共同幹擾酶活性的整體結果，單由這一結果無法得知是混合物中的何種成分真正起到作用；蛋白質三維結構分析往往受到晶體生長的難度和速度等局限。這些因素使得現有的技術平臺迫切需要融入一項(或幾項)獨立的模塊以填補重要的技術空缺，擴充和完善藥物前體篩選優化的整體路線。質譜憑藉其眾多獨特的優勢和成功的應用先例，成為滿足這一大平臺基本建設需要的首選技術。
[0005]質譜由於其高靈敏度和快速的分析速度，能夠發展成為研究生物大分子尤其是蛋白質複合物的關鍵技術手段。與廣泛應用的高通量篩選技術和其他常見的表徵蛋白質-配體相互作用的技術相比，質譜分析具有以下的突出優勢:
[0006]1.利用質譜研究藥物候選分子和靶蛋白的結合作用是一種普適性很高的方法，即研究不同的靶蛋白可以採用基本相同的技術路線。
[0007]2.無需標記底物和靶蛋白，減少化學標記可能對蛋白的結合性質產生的影響。
[0008]3.質譜的高靈敏度使靶蛋白的消耗量可降至微克級。
[0009]4.對配體分子和靶蛋白的純度要求明顯降低。質譜能夠區分混合底物中的不同成分，對它們各自的結合性質同時進行表徵。
[0010]靶分子與靶蛋白複合體的精細三維結構是通過將靶標蛋白質的晶體與化合物分子混合物備選樣品接觸，分析靶標蛋白質的晶體與靶分子接觸後的晶體的X射線衍射數據，進而獲得與靶標蛋白結合的靶分子的電子密度。
[0011]現有的技術方案如下:第一，靶標蛋白質的選取，包括:所有用X射線晶體學的方法解析出三維結構的蛋白質都可以作為靶標蛋白質。第二，製備靶標蛋白質的晶體，包括:使用上述經過純化的靶標蛋白，經過自己優化的該靶標蛋白的晶體條件，生長大量、衍射能力強的晶體。第三，化合物備選樣品的製備:對天然產物提取後，提取物先使用不同極性的溶劑如乙酸乙酯進行萃取，萃取後的水相再用大孔樹脂分離的方法進行處理，這樣既能保證去除幹擾因素，又能利用兩種不同分離機制的差別，使小分子集中到極性不同的段位，由此得到能夠用於X射線晶體學等生物物理方法的天然產物混合物備選庫。第四，將天然產物混合物備選樣品對靶標蛋白進行體外活性的測定。第五，將獲得靶標蛋白與有抑制活性的樣品中可能存在的靶標蛋白配體分子複合體能夠穩定存在，並具有可供X射線衍射實驗的衍射能力的晶體。第六，進行X射線衍射數據的收集和分析。第七，化合物分析的分析與鑑定。
[0012]然而，以上方法具有如下缺點:一、整個過程步驟多，成本高，而且要獲得蛋白質與小分子的複合物的晶體難度很高。二、配體分子量較小的基團在低解析度的電子密度中不易與結晶溶液中本身存在的小分子(如DMS0)等區別開，因此對靶標蛋白的晶體質量要求較高，這極大的限制了靶蛋白的選擇範圍。三、通常情況下，這一技術僅用於分析與單一的配體有相互作用的蛋白質，要求配體分子達到很高的純度。因此，對於篩選由天然產物/中藥提取出的組成複雜的混合物，必須進行多步純化得到近乎單一的組分，才能使用該方法逐一地研究特定的小分子化合物和靶蛋白的結合作用。

【發明內容】

[0013]本發明提供一種操作相對簡單、普適性高、分析速度快的篩選方法，對於不同的靶蛋白和結構各異的小分子配體，都能採用該方法快速地檢測配體與蛋白質的結合作用。
[0014]本發明的方法包括以下步驟:將該靶蛋白與小分子化合物庫接觸以生成靶蛋白-小分子複合物，分離該靶蛋白-小分子複合物，將該靶蛋白-小分子複合物中的小分子解離，然後利用質譜檢測從上述複合物中解離出的小分子，從而間接地篩選得到與該靶蛋白有結合作用的小分子，即該靶蛋白的配體。
[0015]具體而言，本發明的方法包括如下步驟:
[0016]I)將小分子混合物溶解在DMSO中。
[0017]上述小分子混合物的特徵在於:
[0018]混合物中每種化合物的分子量至少相差3Da ;酸性小分子和鹼性小分子達到一定的平衡從而避免大的PH變化對蛋白質有影響；其溶解性和結構多樣性可作為藥物前體的特點；混合物中所含有的化合物數目跟其溶解性有關，且各化合物間無相互反應和沒有重疊分子量的問題。
[0019]2)孵育:將合適濃度的靶蛋白與小分子溶液按照1: 5?1: 10的摩爾比例混合，在室溫條件下孵育30分鐘。
[0020]純化好的蛋白質通常情況下濃縮到這種緩衝體系中:緩衝液為20mMTris、IOOmM氯化鈉、5mM氯化鈣、0.1mM氯化鋅、2mM三氮化鈉和3.5mM DTT，pH = 7.0o[0021]3)分離:
[0022]採樣分子排阻色譜柱(例如S^hadex G25)分離靶蛋白-小分子的複合物，並採用電泳分析收集液。
[0023]優選地，首先用50mM的NH4Ac (pH = 7)溶液對分子排阻色譜柱(例如S印hadexG25)進行徹底的浸泡和衝洗，以除去所有會干擾質譜分析的可溶性成分。然後，取出25 μ I的孵育溶液上樣於S印hadex G25柱中。根據分子排阻色譜的原理，先洗脫下來的為靶蛋白-小分子的複合物，而滯留在柱中後被洗脫的是未結合靶蛋白的過量的小分子和溶液中的其他雜質。收集25 μ I的洗脫液NH4HCO3,並用SDS-PAGE電泳分析收集液。
[0024]4)解離:採用60%甲醇溶液將小分子從靶蛋白-小分子複合物中解離出來。
[0025]5)色譜-質譜分析:取一定量的解離液，加入等量的去離子水進行稀釋，稀釋後取出一部分進樣，進行色譜-質譜串聯分析。
[0026]上述質譜儀優選是Q-TOF-MS四級杆-飛行時間質譜(Waters)。優選的色譜條件為:色譜柱選用 Waters XTerra MS C18 (2.1mmX 100mm, 3.5 μ m),流動相 A 為:0.1% 甲酸水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫:20min從20to 60% B，0.2ml/min。質譜條件:掃描範圍m/z為100-5000，噴霧電壓為3kv，鞘氣流速為100L/h，採集時間間隔為1.5s。
[0027]6)對照實驗
[0028]在相同質譜條件下檢測未與靶蛋白浸泡的小分子化合物庫的質譜結果，以及檢測已知對靶蛋白有特異結合作用的抑制劑與靶蛋白浸泡結合後的質譜結果，通過比較以上不同情況下所得質譜圖，獲知步驟5)中與靶蛋白特異性的結合的小分子的信息。
[0029]本發明建立的質譜篩選方法預期將為早期新藥研發的核心平臺提供重要的技術支撐，具有如下的優點:`[0030](I)提高從化合物庫中篩選活性成分的效率，是一種操作相對簡單，成本較低的高通量藥物篩選方法；
[0031](2)擴充並完善現今廣泛採用的藥物前體分子的初級篩選流程，獨立操作的基於質譜的篩選流程有望克服常規高通量篩選(HTS)的多種局限，提高結果的可信度；
[0032](3)能夠對天然產物中提取的複雜混合物進行快速篩選，直接發現其中的有效結合成分。
[0033]本發明的篩選方法可以用於與人類健康密切相關的靶標蛋白的系統性研究和新藥開發，所針對的疾病包括病毒性傳染病(如SARS和HIV)、糖尿病、心血管病、神經退行性疾病、癌症、自身免疫性疾病等多種人類重大疾病。因而，本發明建立的藥物篩選技術平臺將直接服務於針對這些重大疾病的新藥前體分子的發現和創製，產生可觀的經濟效益和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1示出本發明的流程示意圖；
[0035]圖2示出【具體實施方式】中所得的質譜結果對照圖。
【具體實施方式】
[0036]下面對本發明的各個方面和特點作進一步的描述。[0037]中藥材經過有機溶劑加熱回流提取、液液萃取得到提取物和萃取組分，各萃取組分再經過常壓正相矽膠柱色譜分離法得到標準組分。分析質譜製劑譜法準組分。常用色譜法包括樹脂法、製備液相色譜法等。
[0038](I)稱取IOmg天然產物組分(100種)和木瓜蛋白酶抑制劑(N-對-甲苯磺醯苯丙氨醯氯甲基酮)分別溶解於DMSO中。
[0039](2)取30 μ M的木瓜蛋白酶溶液與天然產物按照1: 10混合，室溫孵育30min。
[0040](3)木瓜蛋白酶與小分子複合物過分子篩系統，先用分子篩緩衝液平衡鎳離子親和層析柱(Amersham Bioscience),然後將上清於4°C上樣於鎳柱,流速lml/min,並收集穿透流出液，取10 μ I洗脫液用12%分離膠SDS-PAGE電泳，分析洗脫液中是否有木瓜蛋白酶。
[0041](4)再用60%甲醇洗脫，收集餾分進行質譜分析。
[0042](5)天然組分0.1mM,進樣I μ I,流動相A為:0.I %甲酸水溶液，B為0.1 %甲酸-乙腈，梯度洗脫:30min從20 to 60 % B,0.2ml/min。質譜條件:掃描範圍m/z為100-1000，噴霧電壓為3kv，採集時間間隔為1.5s，結果如圖a所示；經過上述步驟得到與木瓜蛋白酶結合分離後天然產物小分子組分的結果如圖b所示；根據小分子的結構特徵選取已知與木瓜蛋白酶有結合靶點的木瓜蛋白酶抑制劑與木瓜蛋白酶進行結合試驗，得到與木瓜蛋白酶結合的木瓜蛋白酶抑制劑的結果如圖c所示。
[0043]結果如圖2所示，通過比較b圖與c圖，證明b中的小分子是特異性的結合到靶蛋白上。
[0044]儘管已經示出和描述了本發明的實施例，對於本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由所附權利要求及其等同物限定。
【權利要求】
1.一種篩選靶蛋白配體的方法，其特徵在於包括以下步驟:將該靶蛋白與小分子化合物庫接觸以生成靶蛋白-小分子複合物，分離該靶蛋白-小分子複合物，將該靶蛋白-小分子複合物中的小分子解離，然後利用質譜檢測從上述複合物中解離出的小分子，從而間接地篩選得到與該靶蛋白有結合作用的小分子，即該靶蛋白的配體。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於:所述小分子化合物庫具有如下特徵:每種化合物的分子量至少相差3Da ;酸性小分子和鹼性小分子達到一定的平衡從而避免大的pH變化對蛋白質有影響；小分子的溶解性和結構多樣性使其能夠作為藥物前體；且各化合物間無相互反應和沒有重疊的分子量。
3.根據權利要求1或2的方法，其特徵在於包括如下步驟: 1)將小分子混合物溶解在DMSO中； 2)孵育:將靶蛋白與小分子溶液按照1: 5?1: 10的摩爾比例混合，在室溫條件下孵育30分鐘； 3)分離:採樣分子排阻色譜柱分離靶蛋白-小分子的複合物，並採用電泳分析收集液； 4)解離:採用60%甲醇溶液將小分子從靶蛋白-小分子複合物中解離出來； 5)色譜-質譜分析:取一定量的解離液，加入等量的去離子水進行稀釋，稀釋後取出一部分進樣，進行色譜-質譜串聯分析； 6)對照:在相同質譜條件下檢測未與靶蛋白浸泡的小分子化合物庫的質譜結果，以及檢測已知對靶蛋白有特異結合作用的抑制劑與靶蛋白浸泡結合後的質譜結果，通過比較以上不同情況下所得質譜圖，獲知步驟5)中與靶蛋白特異性的結合的小分子的信息。
4.根據權利要求3的方法，其特徵在於:步驟2)中，純化後的蛋白被濃縮到這種緩衝體系中:0.1mM，緩衝液為20mM Tris、IOOmM氯化鈉、5mM氯化鈣、0.1mM氯化鋅、2mM三氮化鈉和 3.5mM DTT，pH = 7.0。
5.根據權利要求3的方法，其特徵在於:步驟3)中首先用50mM且pH= 7的NH4Ac溶液對分子排阻色譜柱進行徹底的浸泡和衝洗；然後，取25 μ I的孵育溶液上樣，根據分子排阻色譜的原理，先洗脫下來的為靶蛋白-小分子的複合物，而滯留在柱中後被洗脫的是未結合靶蛋白的過量的小分子和溶液中的其他雜質；收集25 μ I的洗脫液NH4HCO3，並用SDS-PAGE電泳分析收集液。
6.根據權利要求3或5的方法，其特徵在於:步驟3)中所用分子排阻色譜柱是Sephadex G25。
7.根據權利要求3的方法，其特徵在於:步驟5)的色譜-質譜串聯分析中，色譜條件:色譜柱選用規格為2.lmmX100mm、3.5μπι的Waters XTerraMS C18，流動相A為:0.1 %甲酸水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫:30min從20至60% B, 0.2ml/min ;質譜條件:掃描範圍m/z為100-5000，噴霧電壓為3kv，鞘氣流速為100L/h，採集時間間隔為1.5s。
8.根據前述任一項權利要求的方法，其特徵在於:上述質譜優選採用Q-TOF-MS四級杆-飛行時間質譜。
【文檔編號】G01N30/02GK103792293SQ201210422212
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月29日 優先權日:2012年10月29日
【發明者】饒子和, 水雯菁, 楊誠, 陳欣, 李利新, 傅晟, 於飛, 王新剛 申請人:天津市國際生物醫藥聯合研究院有限公司, 旭和（天津）醫藥科技有限公司