檢測人類免疫缺陷病毒的方法及試劑盒的製作方法

2023-08-11 18:32:21

專利名稱：檢測人類免疫缺陷病毒的方法及試劑盒的製作方法
檢測人類免疫缺陷病毒的方法及試劑盒所屬領域本發明涉及檢測臨床樣品中愛滋病病原體人類免疫缺陷病毒(Human Imraimodificidncy Virus, HIV) HIV I型(HIV-1)的方法及試劑盒，特別是涉及以實時定量螢光聚合酶鏈反應 技術早期診斷HIV-l感染的方法及所使用的試劑盒。發明背景愛滋病的全稱叫獲得性免疫缺陷症候群(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS), 是一種由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的傳染病。HIV主要型別為HIV-1和HIV-2，愛滋病 大多由HIV-1引起。HIV感染人體後特異性地侵犯並損耗T淋巴細胞造成肌體細胞免疫損傷。 HIV感染的初期，感染者可以是無症狀的病毒攜帶狀態。但感染髮展到一定程度，感染者的 免疫系統受到相當程度的損害時，病人將出現持續性全身淋巴結腫大症候群(PGL)和愛滋病 相關症候群(ARC),最後並發各種嚴重機會性感染和惡性腫瘤，成為愛滋病。目前無特效治 療，病死率極高。自1981年在美國洛杉磯首次發現愛滋病病例後，愛滋病正在全世界迅速流行。據世界衛 生組織2004年12月報告提供的數據，全世界感染愛滋病病毒者達3940力'，其中僅2004年 死於愛滋病的人數就達到310力。現在愛滋病流行正以每天8500個新感染者的速度發展。尤 其是佔亞洲人口近50%的中國、印尼和越南的愛滋病病毒感染人數急劇增長。在中國，自從1985年6月發現第--例愛滋病患者以來，愛滋病病毒己蔓延到所有31 個省、自治區和直轄市。到2004年12月底，中國累積報告HIV感染人數89067人，AIDS 病例數20786例，死亡5024人。據中國CDC及WHO預測，HIV/AIDS實際感染人數約84萬 人。1999年，分子流行病學調查證實我國已有HIV-2型病毒存在，並首次從基因水平上確認 我國存在HIV-1和HIV-2的混合感染，但目前我國存在的主要是HIV-1型感染，HIV-2型感染目前只有個別病例報導。HIV感染的病毒學診斷技術一般包括病毒分離和病毒成份(如抗原、核酸)的檢測。實驗 室檢査包括病毒分離培養、病毒核酸檢測、病毒蛋白抗原檢測、HIV抗體檢測等方法。
從早期的病毒分離培養，到FDA批准了第 一個HIV抗體篩選試劑並用應用於獻血員篩選 形成第一代的抗體檢測試劑以來(1985年3月1 H)，迄今已經發展到第四代HIV抗體/抗原 試劑，窗口期從最初3個月縮短到大約兩周。提高檢測的敏感性，縮短窗口期是HIV抗體檢 測試劑持續發展的方向。利用PCR檢測病毒RNA具有早期發現、靈敏度和特異性高等優點。RT-PCR方法雖然靈敏並 能在早期對病毒進行檢測，但是因其歩驟繁瑣且容易造成汙染，從而使其使用上受到一定限 制。實時螢光定量PCR技術是上世紀90年代中期基於傳統的PCR技術發展起來的。與傳統的(終 點檢測)PCR技術相比，實時定量監測方法不僅實現了低拷貝數靶多核苷酸的定量分析，而且 還具有特異性和精確度更強、自動化程度更高以及汙染的可能性更小等優點。實時螢光PCR技術是在聚合酶鏈反應(PCR)體系中加入螢光標記探針，使用一種帶有核電偶聯裝置(CCD)的PCR擴增儀。通過檢測螢光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光。收集檢測螢光信號，並通過軟體分析匯總到工作站得到擴增曲線。通過對擴增曲線以及循環閾值(Ct)的分析，即可以對檢測樣品進行定性和定量分析。實時螢光PCR將DM擴增與檢測過程融合為--體動態檢測DNA擴增的全過程，省掉了 PCR後處理過程大大縮短了結果分析時間，使得該方法更加快捷、方便。由於實時螢光PCR採取一種封閉的檢測模式，從而減少了氣溶膠汙染和山此的造成的假陽性。因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。TaqMan PCR技術是實時螢光PCR的一種(Mackay 1M " a/. Rea卜time PCR in virology..Nucleic Acids Res. 2002 5;30(6):1292-1305; Lie, Y.S.， Petropoulos, C. J. ， Advancesin quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology1998. 9， 43 - 48.)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記螢光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，螢光報告基團發出螢光的能量轉移給淬滅基團，呈現淬滅效應。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，螢光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間螢光共振能量轉移效應，螢光報告基團發出螢光信號。隨著擴增的進行，螢光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。利用新興的螢光定量技術，能夠對樣本進行定量檢測，對病情檢測尤其是處在"窗口期" 病人的檢測十分有利。研究表明，感染5天就能在外周血中檢出HIV RNA，因此在現有基礎 上檢測HIV RNA可以實現進一歩早期診斷。HIV螢光定量檢測在愛滋病輔助診斷、病程監控、指導治療方案及療效判定、預測疾病進程等方面均具有非常重要的作用。 然而，在目前國內外已經批准用於HIV-1的核酸檢測的試劑中，尚未使用套式PCR方法。 本發明選取人類免疫缺陷病毒(HIV-1)基因組中高度保守的單拷貝基因序列為擴增耙區域， 設計特異性引物及螢光探針進行靶序列擴增，擴增片段長度達148bp。使用逆轉錄體系將RNA 逆轉錄為cDNA後，對cDNA進行套式PCR擴增。然後，利用實時螢光定量PCR技術，定量檢 測血清樣本中人類免疫缺陷病毒(HIV-1) RNA。臨床考核結果表明，本發明的方法可用於人 類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的輔助診斷和愛滋病病人藥物治療的療效監控。由於臨床上HIV-1的病毒載量通常較低(100 10000IU/ml)，因此本發明應用濃縮裂解 病毒和靈敏的套式PCR方法，巧妙地解決了短時間內準確定量的方法學問題。實驗結果顯示， 根據本發明方法生產的產品靈敏度達到100IU/ral。眾所周知，在使用已知的實時螢光定量PCR技術檢測和定量分析臨床樣品中某特定靶核酸 的實踐中，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性， 一個關鍵 性的基本技術環節是如何基於已知的靶多核苷酸序列設計並製備適當的引物和寡核苷酸探 針。本發明人在以往多年從事PCR技術特別是實時螢光定量PCR技術研究的基礎上，將該技術 應用於H工V-l的基因組多核苷酸的檢測和定量分析，成功地完成了本發明。發明的目的本發明的一個目的是提供一種使用實時螢光定量PCR技術定量檢測樣品中HIV病毒的方 法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴增體系，和螢光監測體系在內的反應與檢測混 合物，(2)通過擴增反應循環擴增所說的靶多聚核苷酸，(3)使所說的螢光發生基團與被擴 增的靶多核苷酸間接結合，(4)確定螢光發生基團所產生的螢光量，(5)根據循環反應中產 生的螢光量，結合定量標準曲線確定靶多核苷酸的存在及其相對量(即靶核酸序列的拷貝數)； 其中核酸擴增系統包括可與靶多核苷酸結合的寡核苷酸引物，並且螢光實時監測系統包括一 個可與靶多核苷酸特異性結合的寡核苷酸探針；特徵在於所使用的是套式PCR，正向和反向 寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC (;CC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: l)和5' 一 TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 2)，正向和反向寡核苷酸內引物分別是5'— CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3 (SEQ ID NO: 3)，和5， -CCT GCA CTG TAC CCC (XA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4)並且所使用的寡核苷酸探針是5' -ACAGC AGTAC AAAT(; GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的樣品是可疑HIV病毒感染者的臨床血液樣 根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的靶多核苷酸來自HIV-l病毒。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的核酸擴增系統是套式聚合酶鏈反應系統， 並且所說的第 一次擴增反應循環是大約重複15次的聚合酶鏈反應循環；第二次擴增反應循環 是大約重複35次的聚合酶鏈反應循環。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的核酸擴增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、 (b) 2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第 -條鏈結合的正向引物，和(d) 能夠與雙鏈耙多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的螢光實時檢測體系包括能夠與靶多核苷酸 結合併且兩末端分別結合的有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針。根據本發明的一個優選實施方案，所說的方法進一歩包括(1)確定樣品中的靶多核苷 酸經擴增後所產生的螢光水平達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環次數；(2)將已確定 的樣品中靶多核苷酸的閾循環次數與標準溶液中己知量靶多核苷酸的閾循環次數相比較，以 計算出樣品中靶多核苷酸的相對量。本發明的另一個目的是提供一種使用實時螢光定量PCR技術定量檢測臨床樣品中HIV病毒 的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A、 RNA提取液B、逆轉錄酶系、逆轉錄酶 反應體系、經焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPCH20)、 PCR擴增反應液I (用於第一次PCR擴增 反應)、PC財廣增反應液Il (用於第二次PC時廣增反應)、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標準 品和RNA陽性對照品，以及加蓋密封的多個試劑瓶或離心管。(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶 或離心管的包裝盒。RNA提取液A是Si02經DEPC水處理後，高壓滅菌後4'C保存並分裝的市售標準試劑。RNA提 取液B山GuSCN (異硫氰酸胍)120g， 0. 1M Tris-HC1 (pH 6.4) 100ml 0. 2M， EDTA (PH8. 0) 22ml混合組成，4t保存。PCR反應液I由正向和反向寡核苷酸外引物(25pmo]/ul)各O. lul、 2mM dNTPs 5 ul 、 5XRT Buffer 4 ul組成，共18 ul混合，-20。C保存。PCR擴增反應液II 由正向和反向寡核苷酸內引物(25pmol/ul)各0.4ul、螢光探針SEQ ID NO. 3 (20Pmol/ul) 0. 5ul 、 2mM dNTPs 5 ul 、 5XRT Buffer 10 u] 、 ddH20 29. 10. 4ul組成，-20。C保存。根據本發明的再-個優選實施方案，所使用的是套式PCR，其中用於靶多核苷酸擴增 體系的正向和逆向寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ 1D NO: l)和5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' (SEQ ID NO: 2)，正向和反向寡核苷 酸內引物分別是5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID N'O: 4)。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用於靶多核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸探
針是5'-ACAGC AGTAC AAATG GCA〔;T ATTCA TTCAC-3，(SEQ ID NO: 5)。


圖l顯示Std curve窗口下的標準曲線。針對模板數為10' l(r拷貝的反應體系進行TaciMan PCR分析。當100拷貝數為100時，檢測樣品得Ct值在20左右，即檢測下限靈敏度可到達100拷 貝。繪製得到的標準曲線斜率為-3.01, R = -0.998168。圖2顯示強中弱三個陽性標本曲線。三個標本的Ct值分別是11.07, 14.11， 17.07;結合 擴增曲線為S形，均能夠判定位陽性。圖3顯示陰性標本曲線。三個標本的擴增曲線為比較平直的折線，與螢光檢測閾值線沒 有交點，或者顯示Ct值為30並且擴增曲線不具有S形特徵。圖4顯示5個臨床陽性標本曲線，CT值均小於:K)，擴增曲線為S形，均能夠判定為陽性。發明的詳細內容本發明涉及實時定量螢光PCR方法及試劑盒，特別是涉及實時定性定量螢光聚合酶鏈反應 方法及其試劑盒在HIV病毒感染的早期實驗室診斷中的應用。本發明提供了一種使用實時螢光定量PCR技術定性定量檢測臨床樣品中HIV病毒存在的 方法，該方法包括(1)提供包括HIV病毒基因組核酸的樣品、逆轉錄反應體系、核酸擴增 體系，和螢光監測體系的反應與檢測混合物，(2)通過逆轉錄反應得到PCR擴增的靶DNA序 歹ij， (3)通過擴增反應循環擴增所說的靶多核苷酸，(4)使所說的螢光發生基團與被擴增的 靶多核苷酸間接結合，(5)確定螢光發生基團所產生的螢光量，(6)分析擴增循環後產生的 螢光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴增體系包括可與靶多核苷酸結合的 寡核苷酸引物，並且螢光檢測體系包括可與靶多核苷酸結合的寡核苷酸探針；特徵在於所使 用的是套式PCR，正.向和反向寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: l)和5' — TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' (SEQ ID NO: 2)，正向和反 向寡核苷酸內引物分別是5' - CAA TCC CCA AA(; TCA AG(; AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4)並且所使用的寡核苷酸探針是5' -ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。與基於擴增反應完成後進行單一終點檢測的傳統PCR方法不同，實時定量聚合酶鏈反應方 法可以在擴增反應的進程中隨時監測擴增產物的產生，從而大大提高了定量檢測的準確性和 精密度。如眾所周知，實時螢光定量PCR是在PCR擴增中，同時加入引物和5' 、 3'末端分別 標記有螢光報告基團(例如6-F層amidite羧基螢光素6)和螢光淬滅基團(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補結合，其序列保持完整，報告基團發射的螢光信號將被淬滅基團吸收，所以沒有螢光信號產生；而當PCR擴增反應進行時，DNA聚合酶的5' -3'外切酶活性將降解螢光探針，導致螢光報告基團與螢光淬滅基團分離，因而螢光監測系統可接收並記求到螢光信號。每擴增一條DNA鏈即有 一個螢光分子產生，從而實現螢光信號的累積與PCR產物形成完全同歩，實時地監測整個PCR反應進程，並可藉助標準曲線對未知靶多核苷酸(模板)進行定量分析。與通常的實時定量螢光PCR技術相似，本發明的檢測樣品中HIV病毒基因組雙鏈靶多核苷酸存在的方法中同樣包括(1)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(c) 2-脫氧核苷三磷酸(dNTP)的擴增反應體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第--條互補鏈結合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈耙多核苷酸的第二條互補鏈結合的反向引物，以及(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的任一條鏈結合併且兩末端分別標記有螢光發生基團和螢光淬火基團的寡核苷酸探針的螢光檢測體系；(2)通過一次或多次聚合酶鏈反應擴增所說的靶多核苷酸；(3)退火後使所說的螢光發生基團通過探針與靶多核苷酸結合併產生螢光信號；(4)檢測並確定螢光發生基團所產生的螢光量；(5)分析一次或多次擴增循環所發出的螢光量，以檢測耙多核苷酸的存在；特徵在於其中所說的靶多核苷酸是HIV病毒基因組多核苷酸，所使用的PCR技術是套式PCR技術，TF.向和反向寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCCTGT TGG T -3'(SEQ ID NO: l)和5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3'(SEQ ID NO:2)，正向和反向寡核苷酸內引物分別是5' -CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQIDNO: 3)，和5' -(XT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID NO: 4)並且所使用的寡核苷酸探針是5，-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有HIV病毒株，並能夠準確有效地將HIV 病毒感染與人乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、B型肝炎黃 病毒、以及A型肝炎病毒等其他常見相關病毒等感染鑑別開來，設計並製備實現這些目的的 寡核苷酸引物和探針是一個非常重要的技術環節。為此，我們在使用適當的核酸分析軟體對 己知的HIV—1病毒的基因組核苷酸序列進行分析，進一歩使用適當的引物設計軟體(例如 Primer Express 2)選擇並設計具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物l: 5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: 1)、引物2: 5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 2)，引物3: 5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'， 引物 4: 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4);以及具有下示序列的寡核 苷酸探針5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。
其中引物1位於來自加拿大的HIV-1病毒株CANB6FULL (基因存取號為AY779556)的 3885-3903位，包括19個鹼基；引物2位於4091-4112位，含22個鹼基;引物3位於3938-3958 位，含21個鹼基；引物4位於4079-4100位，含22個鹼基；螢光探針FPHIV位於4029-4058 位，含30個鹼基，擴增區段均位於HIV基因的POL蛋白的編碼區。外引物所對應的擴增區段長度為228bp。內引物所對應的擴增區段長度為163bp。可使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速液相層析法(FPLC)純化後 進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理後分別在其5'端標記作為螢光發生基團 (報導基團)的6-FAM amidite，並在其3'端標記藉助活性連接臂偶聯的作為螢光淬滅或抑 制基團的TAMRA。以FPLC層析法純化螢光標記的探針。然後，使用變性條件下的聚丙烯醯胺凝 膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑑定所合成的引物和探針。使用常規RNA提取方法或市售的RNA提取試劑盒，從得自受試者的早期血清樣品中提取 RNA，然後使用逆轉錄反應體系(在每微升由250mMTris-HCL(pH8. 0)、 250mMKCL、 20mM MgCU 和50 mM DTT組成的緩衝液中含有50單位mMLV酶和l單位RNA酶)將所提取的RNA轉化成。DNA， 並將此逆轉錄產物用於繼後的PC財廣增。在含有引物1和2 (各20pmo1)、 DNA模板(PCR擴增靶序列)、dNTP (lOrnM)、耐熱DNA聚合 酶(Plantini, DNA聚合酶)、PCR緩衝液和水的反應體系中，使用ABI 7000型或其他結構類 型的自動螢光檢測熱循環儀上對如上得到的(DNA序列進行第一次PCR擴增。所使用的反應條 件是50°C—5分鐘；93'C預變性3分鐘；93°C 30秒一55°C 30秒一72°C 30秒，共進行15個循 環。在含有引物3和4 (各20 pmol)、核酸探針、DNA模板(PCR擴增靶序列)、dNTP (10mM)、 耐熱DNA聚合酶(Plantinium DNA聚合酶)、PCR緩衝液和水的反應體系中，使用ABI 7000型 或其他結構類型的自動螢光檢測熱循環儀上對如上得到的t.DNA序列進行第二次PCR擴增。使 用PE GeneAmp 5700 (AB1 Prism 7300、 ABI Prism 7000、 DA—7600、 Line Gene、 iCycler 參照此方法)所使用的反應條件是93'C預變性2分鐘後，9、TC 45秒，55°C l分鐘，進行IO 次循環；然後93。C 30秒，55°C 45秒，進行30個循環。使用Light Cycler所使用的反應條件 是93t 2分鐘；93°C 5秒57°C 45秒，共40個循環；最後置37。C下保溫1秒。1. 陰性結果判定如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則實驗結果判為樣品的HIV RNA含量小於檢測極限。2. 陽性結果判定如果增長曲線呈S型曲線且CT值〈40，則實驗結果按以下方法判斷 反應完成後，藉助裝置上配置的自動分析系統分析結果。在本研究中，對PEGeneAmp 5700(ABI Prism 7300、 ABI Prism 7000、 DA—7600、 Line Gene、 iCycler參照此方法)而由、
如果增長曲線不呈S型或循環閾(Ct)值等於30，結果即為陰性；如果增長曲線呈S型且Ct值 小於30，結果則為陽性。對Light Cycle而言，如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，結 果即為陰性；如果增長曲線呈S型曲線且CT值小於40，結果則為陽性。其中以反應的前15個循 環所產生的螢光信號作為螢光本底信號，螢光域值的預設設置為3-15個循環的螢光信號的標 準偏差的10倍。 一般說來，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數呈線性關係。起始 拷貝數越多，Ct值越小。因為在擴增反應的Ct值之前的階段，擴增系統中的酶、引物、探針 和dNTPs均大大過量，而且系統的p值和離子濃度等也相對穩定，所以此時擴增反應的效率是 一個與模板數無關的飽和定值。與Ct值相關的只有起始模板數(多聚核苷酸樣品的拷貝數) 和與樣品無關的PCR系統效率。可利用已知起始拷貝數的標準品製作標準曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數的對數為 橫坐標，並以如上測得的Ct值為縱坐標。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值後，即可從基於平行 實驗得到的數據製作的標準曲線上得知其起始拷貝數的對數，然後計算出該靶多核苷酸的起 始拷貝數(當擴增循環達到Ct值即初始進入指數擴增期時，Ct值的重現性極好，即同一靶多 核苷酸在不同時間擴增或同一時間在不同管內擴增所得到的Ct值總是恆定的)。也就是說，為 了基於上述的擴增反應結果推算出靶多核苷酸的量(起始拷貝數)，本發明的方法還進一歩包 括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經擴增後所產生的螢光達到基線以上的固定閾值時所需的 閾循環次數；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環次數與標準溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環次數相比較，從而計算出樣品中靶多核苷酸的量。本發明的另一個目的是提供一種使用實時螢光定量PCR技術定量檢測臨床樣品中HIV病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A、 RNA提取液B、 HIV-l逆轉錄酶反應液、逆轉錄酶系、經焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPC H20)、由己知常規成分組成的PCR擴增反應液I (第一次PCR反應液)和II (第二次PCR反應液)、陰性質控品、HIV臨界陽性質控品)HIV強陽性質控品和HIV陽性定量參考品，以及加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用於靶多核苷酸擴增體系的if.向和逆向外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCC TGT T(;G T -3' (SEQ ID NO: l)和5， — TAC TAT TCT TTC CCCTGCACTG-3' (SEQIDN0: 2)， if.向和反向寡核苷酸內引物分別是5' - CAA TCC CCA AAGTCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'禾P 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID NO:4)根據本發明的再一個優選實施方案，其中用於靶多核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸是 5'-aCAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。
如甜所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有HIV病毒變異體，並能夠準確有效地將 HIV病毒感染與人乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、非洲淋巴細胞瘤病毒、B型肝炎 黃病毒、以及A型肝炎病毒等其他常見相關病毒等感染鑑別開來，本發明基於HIV-l和相關病 毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設計了適用本發明檢測試劑盒的寡核苷酸引物和探 針。使用這些引物和探針完成的實時定量檢測，大大減小了HIV病毒多核苷酸檢測的假陽性和假陰性。我們的實驗證明，本發明檢測Hiv病毒基因組核苷酸的精確度幾乎為iooy。，靈敏度達到100個拷貝/mJ。值得特別說明的是，為了確保本發明的HIV病毒檢測方法的準確性，我們使用了根據已知 的HIV病毒RNA序列合成的單鏈DNA作為陽性標準品。並且，還使用攜帶有HIV病毒核苷酸(,.DNA) 序列的重組質粒作為DNA定量檢測標準品。藉助這些額外標準品製作所謂的外標定量標準曲 線，以進一歩提高本發明試劑盒的檢測精確度和準確性。實施例實施例l: HIV檢測試劑盒及其使用(1) 製備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液A (100 ul /管)l管、RNA提取液B (4000 ul /管)l管、H1V-l逆轉錄反應液(180ri/管)l管、逆轉錄酶系(20 ul /管)1管、第一次PCR反應管(l人份/管)若干、第二次PCR反應管(l人份/管)若干、DEPCH20 (2000 lU/管)l管、強陽性標準品(1000 ul /管)l管、臨界陽性標準品(1000ul/管)l管、陰 性對照(1000 "l/管)l管、HIV陽性定量參考品(1X咖/ml， ,1/管)l管、H1V陽性定 量參考品(lXL0'IU/ml，醇l/管)l管、HIV陽性定量參考品axiO'IU/ml， 10W/管)l狩、 HIV陽性定量參考品(lX105IU/ml， 10W/管)l管。(2) 標本採集、運送和保存無菌操作取疑似愛滋病人發病早期的血清標本，然後將血 清通過漏鬥樣紙杯收集到無菌塑料試管中並置於低溫冰箱(一7(TC或一2(TC)中冷凍保存。 如集中檢驗，標本需在(TC以下環境中運送並於24小時內送達實驗室。(3) 檢測歩驟和結果分析向新的經高壓滅菌處理過的O. 5ml離心管中加入10u 1充分混勻的RNA提取液A(RNA提取液 A易沉澱，取樣前需用移液器反覆吸打混勻後吸取)。再加入100u l血清標本或陰性或臨界、 強陽性質控品，然後加入200w l的RNA提取液B並充分混勻。室溫放置5分鐘後，8000轉/分(rpm) 離心1分鐘，小心吸去上清；再次加200W RNA提取液B，充分混勻(用移液器吹打)，8，000rpm 離心1分鐘，小心吸去上清；並用75%的預冷乙醇(用DEPC水配製)洗沉澱兩次(取75%乙醇40ul洗沉澱，充分震蕩混勻，8000轉/分(rpm)離心l分鐘後去上清後再用75。/。乙醇400ii l洗-次)，65。C乾燥並沉澱10分鐘。其中，配製75%乙醇時須使用試劑盒中提供的焦碳酸二乙酯處 理的純水(DEPC H20)。然後，在沉澱管加入18yl逆轉錄反應液以及逆轉錄酶系2u ]，震蕩混勻，瞬時(3秒) 離心後37'C放置45分鐘，95'C加熱3分鐘。8000rpm離心l分鐘後，吸取5 y l逆轉錄產物加入第 -次PCR反應管中進行第一次PCR反應。將HIV陽性定量參考品8000rpm離心數秒，備用。然後分別取PC財廣增一的擴增產物5nl (標本或陰性或臨界、強陽性質控品)或陽性定量 參考品5w 1加入第二次PCR反應管中，進行第二次PCR擴增。PCR循環條件是95"預變性2 分鐘後，94°C 45秒，55°C l分鐘，進行10次循環；然後93。C 30秒，55°C 45秒，進行30 個循環(使用ABI Prism 7000)。反應結束後保存檢測數據文件。根據分析後圖像調節分析參數使標準曲線(Std curve ) 窗口下的標準曲線圖達到最佳(即相關性數值<-0.95)(參見圖4)。由圖2和圖3可分別看出， 陽性標本的螢光曲線與設定的閾值線有一交點，而陰性標本的螢光曲線則低於閾值。最後由 儀器自動分析裝置計算出的未知標本的測定數值(Qty)，即標本中H1V病毒的RNA含量，為2. 07 X 10'IU/ml。實施例2:使用本發明的試劑盒檢測150例臨床血清樣品的結果及分析委託山西山西省疾病預防控制中心考核了300個臨床標本。以Genelabs公司出品的免疫印跡試劑——H1V Blot檢測試劑盒為參考，以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR H]V-1MONITOR⑧Test (vl.5)試劑覆核。考核結果表明陽性病例(達安PCR為陽性)共103個，數值分布為l. 86X10' — 4.61X105IU/ml。其中102個Western Blot結果均為陽性，符合，結果一致；l個Western Blot結果為陰性，結果不 一致。陰性病例(達安PCR為陰性)共197個，其中 178個Western Blot結果為陰性，結果一致；19個Western B]ot結果為陽性，結果不一致。總符合率93. 3%。以羅氏(R0CHE)公司出品的The AMPLICOR 1UV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑覆核，PCR結果與覆核結果一致的判斷為真陰(陽)性，PCR結果與覆核結果不--致的判斷為假陰(陽)性。標本覆核結果為20個不一致的標本中，真陰性18個，假陽性1個，假陰性1個。因此本次考核假陽性有l個，假陰性1個，真陽性102個，真陰性196個。根據靈敏度計算公式以Genelabs公司出品的免疫印跡試劑——HIV Blot檢測試劑盒為參考，以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑覆核，本發明的試劑盒準確度為99. 33%。而相反，以本發明的試劑盒為參考，以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑覆核，Genelabs公司出品的免疫印跡試劑——HIV Blot檢測試 劑盒準確度為94%。以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑覆核，本 發明的試劑盒準確度高於HIV Blot檢測試劑盒。 序列表<110〉中山大學安達基因股份有限公司檢測HIV的方法及試劑盒〈141〉5〈210〉 1 19 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 2 22 〈212> DNA <213〉人工序列 〈223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400〉 2tactattctt tcccctgcac tg 3 〈211>21 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 3caatccccaa agtcaaggag t〈210〉 422 ' DNA <213〉人工序列 《220〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400〉 4cctgceictgt accccccaat cc<210〉 5 30 〈212> DNA 〈213〉人工序列 〈223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。 5acagcagtac aaatggcagt attcattcac
權利要求
1、 一種使用實時螢光定量聚合酶鏈反應技術定量檢測樣品中HIV-1病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、包括耐熱DNA聚合酶、2，-脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多 核苷酸的第一條鏈結合的TH向引物和能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物的核 酸擴增體系，以及螢光監測體系的反應與檢測混合物，(2)通過擴增反應循環擴增所說的耙 多核苷酸，(3)使所說的螢光發生基團與被擴增的靶多核苷酸間接結合，(4)確定螢光發生 基團所產生的螢光量，(5)分析擴增循環後產生的螢光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對 量；其中核酸擴增系統包括可與靶多核苷酸結合的寡核苷酸引物，並且螢光監測系統包括可 與耙多核苷酸結合的寡核苷酸探針；特徵在於所使用的是套式PCR，核酸擴增體系中TH向和反 向寡核苷酸外引物分別是5， — GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: 1)和5' — TAC TATTCTTTCCCCTGCACTG-3' (SEQ ID N0: 2)，正向和反向寡核苷酸內引物分別是5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3， (SEQ ID NO: 4)並且其螢光監測體系中所使用的寡核苷酸探針是5' -ACAGC AGTAC AAATG GCAGT 八TTCA TTCAC-3， (SEQ ID NO: 5)。
2、 根據權利要求l的方法，其中所說的核酸擴增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b) 2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物5' -GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3'，和(d)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' , (e)能與擴增子雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結合的IH向引 物5'-CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3， (f)能與擴增子雙鏈靶多核苷酸的第二條 鏈結合的反向引物5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'。
3、 根據權利要求l的方法，其中所說的螢光檢測體系包括能夠與靶多核苷酸結合併且兩 末端分別結合的有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'。
4、 根據權利要求1的方法，其中第(5)步驟中所說的方法進一歩包括(1)確定樣品 中的耙多核苷酸經擴增後所產生的螢光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環次數；(2) 將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環次數與標準溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環次數相 比較，以計算出樣品中靶多核苷酸的量。
5、 根據權利要求l的方法，其中所說的靶多核苷酸來自HIV-1病毒。
6、 使用實時螢光定量聚合酶鏈反應技術定量檢測臨床樣品中HIV-1病毒的試劑盒，改試 劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A、 RNA提取液B、逆轉錄酶反應體系、經焦炭酸乙 二脂處理的純水、擴增反應液I、擴增反應液II、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標準品和 RNA陽性對照品並加蓋密封的多個試劑瓶或離心管，(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或離心 管的包裝盒，特徵在於靶多核苷酸擴增體系的正向和反向寡核苷酸外引物分別是5' -GTTAAG GCC GCC TGT TGG T -3，和5， - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' ， j下向和反向寡核 苷酸內引物分別是5， - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'，並且其中用於靶多核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸探針是5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'。
全文摘要
本發明涉及檢測臨床樣品中愛滋病的病原體人類免疫缺陷病毒(HIV)I型(HIV-1)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實時定量螢光聚合酶鏈反應技術早期診斷HIV-1感染的方法及所使用的試劑盒。
文檔編號G01N21/00GK101144771SQ20061003759
公開日2008年3月19日 申請日期2006年9月11日 優先權日2006年9月11日
發明者何蘊韶, 周新宇, 鋼 程 申請人:中山大學達安基因股份有限公司