從血液或血液級分中分離的凝血酶的製作方法

2023-08-11 16:16:06 3

專利名稱：從血液或血液級分中分離的凝血酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及從血液或血液級分中分離凝血酶的方法，包括用這種方法產生的組合物和施用這些組合物的方法。
背景技術：
全血，如人的全血，含有多種蛋白質、細胞以及其他成分。例如，全血可分離為血液級分如富血小板血漿和貧血小板血漿。全血和血漿級分包含各種凝血因子，如凝血酶,這些凝血因子可形成凝塊來癒合組織或皮膚的損傷或別的破口。凝血酶是能夠活化多種凝血因子並且可活化血小板的多功能絲氨酸蛋白酶。凝 血酶可通過活化的因子X(Xa)對凝血酶原上兩個位點的酶切由凝血酶原產生。因子Xa的活性可通過與活化的因子V(Va)結合而增強，其稱作凝血酶原複合物。一旦形成，凝血酶介導的纖維蛋白原通過蛋白水解而消化為纖維蛋白單體，啟動了可導致凝塊形成的反應級聯，這通常是傷口癒合的第一步。凝血酶還可作為傷口癒合所涉及細胞的化學吸引劑(chemo-attractant)發揮功能,所得纖維蛋白網絡具有很多的功能,其包括作為產生膠原蛋白的成纖維細胞的支架、增加吞噬作用、促進血管發生、以及結合生長因子，其可進一步支持癒合過程提供。血小板也可從非結合模式活化為結合模式。作為促凝血物質，凝血酶在制止出血(即生理止血)中發揮重要作用。凝塊形成的速率可依賴於凝血酶和纖維蛋白原的濃度。因為其在凝塊形成中的重要作用，凝血酶可用作組織封閉劑(tissue sealant)或粘合劑,也可與纖維蛋白原聯合使用。包括凝血酶的傷口封閉劑的應用有很多，其包括在下列中的使用皮膚移植、神經外科、心臟外科、胸外科、血管外科、腫瘤外科、整形外科、眼外科、矯形外科、創傷外科、頭頸外科、婦科及泌尿外科、胃腸外科、口腔外科、藥物遞送、組織工程、以及牙體窩洞(dentalcavity)止血等。

發明內容
本發明包括涉及從血液和/或血液級分中分離凝血酶的方法、裝置和組合物，例如，其中所述分離的凝血酶可用作自體凝血因子。製備包含凝血酶之溶液的方法包括從液體中沉澱纖維蛋白原，所述液體包含全血或血液級分(如貧血小板血漿)。從所述液體中除去沉澱的纖維蛋白原，以形成沉澱後液體。除去沉澱的纖維蛋白原的方法包括過濾所述液體或離心所述液體以使沉澱的纖維蛋白沉積下來。然後，將所述沉澱後液體與鈣和玻璃珠一起孵育以形成凝塊，將包含凝血酶的溶液與凝塊分離。提供包含凝血酶的溶液和組合物，其包含按照本方法製備的凝血酶。向對象之部位施用組織封閉劑的方法中可包括這些溶液和組合物。例如，包含凝血酶的溶液根據本文所述方法製備。然後，將凝血酶施用到對象的所述部位。在某些情況下，使用包含獲得自對象的全血或血液級分的液體來製備凝血酶，從而提供對所述對象來說為自體的凝血酶。在施用組織封閉劑中凝血酶的施用還可包括向對象的部位施用纖維素蛋白原和鈣。


圖I是根據本發明製備包含凝血酶的溶液之方法的圖示。圖2是根據本發明製備包含凝血酶的溶液之另一個方法的圖示。圖3是根據本發明製備包含凝血酶的溶液之另一個方法的圖示。圖4是根據本發明的方法分離血液級分的示例性裝置的局部橫截面圖。圖5A和圖5B分別是根據本發明的方法製備包含凝血酶的溶液之裝置的等軸測視圖(isometric view)和局部橫截面圖。

應當指出這裡給出的附圖意在示例本發明中材料和方法的一般特徵，目的是描述某些實施方案。這些附圖可能沒有精確反映任何給定實施方案的特徵，並且也不一定意在限定或限制本發明範圍內的特定實施方案。
具體實施例方式以下對技術的描述僅僅是根據一項或多項發明的主題、製造和用途之本質的示例，而不是意在限制本申請或者可以要求本申請優先權而申請的其他申請或者這些申請所授專利權中所要求保護的任何具體發明的範圍、應用或用途。在「具體實施方案」末尾提供了意在幫助理解本發明的對術語和短語的非限制性討論。本發明涉及從全血和/或血液級分中分離凝血酶的方法，以及包含用所述方法生產的凝血酶的組合物，如組織封閉劑。本發明還提供了向對象的部位施用包含凝血酶的組織封閉劑的方法。例如，所述組織封閉劑可包含與纖維蛋白原混合的凝血酶，其被施加以形成凝塊或纖維蛋白膠(fibrin glue)。凝血酶也可用於在治療點使多種血液成分凝固，其中血液成分包括純化的纖維蛋白原、全血、富血小板血眾(platelet-rich plasma,PRP)、貧血小板血眾(platelet-poor plasma,PPP)或其濃縮物,和其組合。凝血酶將纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，形成可用做封閉劑(sealant)的凝塊。可施加所述凝塊以封閉手術後的切口部位或者封閉創傷，例如還可促進所述部位處的癒合。在某些情況下，這些凝血酶對於所述對象來說可以是自體的。本發明從血液和血液級分中分離凝血酶的方法可提供具有改善的凝血酶酶活性的凝血酶。其他產生或分離凝血酶的方法可導致活性低於期望的凝血酶。例如，一些方法提供了下述凝血酶，其可使得富血小板血漿凝固但不提供足以凝固其他產物(如濃縮血漿或骨髓抽吸物)的凝血酶活性。然而，本方法包括兩個步驟來產生凝血酶纖維蛋白原沉澱和凝塊形成/凝血酶原向凝血酶轉化，其產生包含活性足以有效凝固此類產物的凝血酶的溶液。參看圖I,以示意圖的形式顯示了製備包含凝血酶之溶液的方法100。從包含全血和/或血液級分的液體中沉澱纖維蛋白原，除去所沉澱的纖維蛋白原以形成沉澱後液體。例如，全血或血液級分Iio與有機溶劑120合併以沉澱纖維蛋白原,如130所示。沉澱纖維蛋白原可包括將全血和/或血液級分110與有機溶劑120混合，以及另外孵育一段時間，比如約10分鐘至約20分鐘。液體110可包含全血。當在方法100中使用全血時，所述全血可以與抗凝血劑合併。合適凝血劑的實施例包括酸-朽1檬酸鹽-葡萄糖(Acid Citrate Dextrose, ACD),其是檸檬酸、檸檬酸鈉和葡萄糖的水溶液，可用來保存血液。在某些實施方案中，所述血液成分可包含A⑶-A，其每IOOOml包含總檸檬酸鹽(以檸檬酸計，無水(C6H8O7))約20. 59g至約22. 75g，葡萄糖(C6H12O6 * H2O)約 23. 28g 至約 25. 73g 和鈉(Na)約 4. 90g 至約 5. 42g。在一些實施方案中，使用A⑶-B，其每IOOOml包含總檸檬酸鹽(以檸檬酸計，無水(C6H8O7))約 12. 37g 至約 13. 67g，葡萄糖(C6H12O6 * H2O)約 13. 96g 至約 15. 44g 和鈉(Na)約 2. 94g至約3. 25g。在某些實施方案中，可使用約1/10體積至約1/7體積的A⑶-A對全血進行抗凝血處理。其他合適的抗凝血劑包括本領域所知道的，如肝素、檸檬酸磷酸葡萄糖(citratephosphate dextrose,CPD)和乙二胺四乙酸(EDTA)。這些抗凝血劑可以放在用於從對象抽血的注射器中，或者也可以在抽血後與血液混合。抗凝血劑通常包括螯合劑(如，檸檬酸，EDTA)來螯合游離鈣離子。在某些實施方案中，所述液體110為血液級分，合適的血液級分包括貧血小板血漿。血液級分110可通過多種合適方法中的任一種得到，包括本領域知道的那些。可用來製備血液級分110的裝置的一個實例在圖4中顯示。在這種情況下，裝置400包含容器405， 如管，其在裝滿血液後放置在離心機中。容器405包含浮標系統，所述系統具有隔離器410和浮標415。浮標415具有選定以使得在離心時能到達選定平衡位置的密度，這一位置位於較高密度的血液級分與較低密度的血液級分之間。離心過程中，浮標415通過沉降至兩個級分之間的位置將容器405中的血液分成至少兩個級分，而基本上不使所述級分混合。在這種情況下，分離器410和浮標415限定了包含富血小板血漿420的層，而較低密度的貧血小板血漿425 —般在分離器410上方分級分離，以及較高密度的紅細胞430 —般在浮標415下方分級分離。用裝置400離心後，注射器或者管可以與浮標系統的一部分相連接來提取血液級分(如富血小板血漿和/或貧血小板血漿)。這種裝置的市售實施方案包括GPSh IIPlatelet Separation System,來自 Biomet Biologies, LLC(華沙，印第安納州，美國)和Γ PS'*TTTPlatelet Separation System,來自 Biomet Biologies,LLC(華沙，印第安納州，美國)。可用於分離圖I中血液級分110的裝置還包括例如以下中所描述的美國專利No. 6，398，972，Blasetti 等，2002年6 月 4 日授權;美國專利No. 6，649，072，Brandt 等，2003年11月18日授權；美國專利No. 6，790，371，Dolocek等，2004年9月14日授權；美國專利No. 7，011，852，Sukavaneshvar 等，2006 年 3 月 14 日授權；美國專利 No. 7，179，391，Leach等，2007年2月20日授權(通過引用併入本文);美國專利No. 7，374，678，Leach等，2008年5月20日授權(通過引用併入本文);美國專利No. 7，223，346，Dorian等，2007年5月29日授權(通過引用併入本文);和美國專利No. 7，708，152，Dorian等，2010年5月4日授權(通過引用併入本文)。可使用其他方法來分離血液級分110。如，不使用浮標系統來離心全血，全血可以進行多級離心，可使用連續流動離心，還可以使用過濾。此外，也可通過使用低速離心步驟將血漿與紅細胞分離來產生血液級分，以防止血小板形成聚集成團。在另一些實施方案中，可將由離心的血液所形成的血沉棕黃層與剩餘血漿分開。此外，多種其他市售裝置都可以用來分離血液級分110，其包括-Magellan Autologous Platelet Separator System,由 Medtronic, Inc.(明尼阿波利斯，明尼蘇達)出售；SmartPReP ,由 Harvest Technologies Corporation(普利茅斯，麻薩諸塞)出售；AutoloGel Process,由 Cytomedix, Inc.(羅克維爾，馬裡蘭)出售；和GenesisCS System,由EmCyte Corporation (邁爾斯堡，弗羅裡達)。回到圖1，如上面所討論的，全血/血液級分110與有機溶劑120在步驟130中混合。適合使全血/血液級分110中纖維蛋白原沉澱的有機溶劑120包括與水互溶的溶劑如醇類(如甲醇和乙醇)和酮類(如丙酮)。隨著有機溶劑的加入，全血/血液級分中的蛋白質發生沉澱。以這種方式，纖維蛋白原從全血/血液級分中沉澱出來。不受任何理論的約束，所述有機溶劑可使蛋白質表面脫水，其隨後會在範德華力的作用下結合，至少在它們位於等電點或適當接近等電點的情況下。從帶電基團周圍除去水分子還可去掉它們的屏蔽層使得電荷交換的發生更加強烈。鹽可以結合到蛋白質表面而使得它們的等電性變差，隨後可幹擾有機溶劑的沉澱。因此，用有機溶劑沉澱可在低鹽濃度或降低的鹽濃度下進行。在實踐中，通過加入有機溶劑的沉澱可以在室溫(如約20°C至25°C )或較低溫度下實施。較低溫度的實例包括約4°C至約-20°C。有機溶劑可以緩慢加入並與全血和/或 血液級分混合。可進行使用少量全血和/或血液級分的測試沉澱加入多種不同量的有機溶劑後取少量樣品，離心，以及測定樣品中上清以確定纖維蛋白原在何時沉澱。也可測定沉澱的存在以確定蛋白質是否以及何時有效地沉澱，以及例如，特別地纖維蛋白原是否沉澱。在多個實施方案中，沉澱可包括將約12ml貧血小板血漿與約7ml的全血在室溫下合併。離心後，可測定多種上清和重懸的沉澱中蛋白質內容物，並可對其進行蛋白質電泳以提供蛋白質(包括纖維蛋白原)的定量測定。可使用除加入有機溶劑以外的其他方法來沉澱纖維蛋白原130。其實例包括加入多價金屬離子(如Ca2+、Mg2+、Mn2+和Fe2+)，使用聚電解質(如藻酸鹽、羧甲基纖維素、聚丙烯酸、單寧酸和多聚磷酸)、非離子親水聚合物(如葡聚糖和聚亞烷基二醇)進行絮凝，通過加入酸(如鹽酸和硫酸)的等電點沉澱，以及通過加入中性鹽(如硫酸銨)的鹽析。本領域所知的其他沉澱蛋白質的合適方法也可用於沉澱全血和/或血液級分中的纖維蛋白原。步驟130可包括將全血和/或血液級分液體110與有機溶劑一起孵育適於蛋白質(包括纖維蛋白原)沉澱的一段時間。孵育可以在室溫或者所述的較低溫度下進行。沉澱纖維蛋白原的代表性孵育時間包括從約10分鐘至約20分鐘。在某些實施方案中，包含全血和/或血液級分的液體110包含貧血小板血漿和有機溶劑120 (其包括純乙醇，即基本上100%的乙醇或200pix)Of)，混合和孵育以沉澱纖維蛋白原130可包括將貧血小板血漿抽到含有乙醇的注射器中。適當的體積和比例的實例包括約12ml貧血小板血漿和約7ml200-proof的乙醇(或等同的)。將貧血小板血漿和乙醇混合，並將注射器孵育10至20分鐘。所述孵育可以在室溫下。所述注射器可安裝濾器，其允許液體流過但截留沉澱的纖維蛋白原。除了貧血小板血漿之外或者用來代替貧血小板血漿，可抽取全血到含有抗凝血劑(如Ara-A)和乙醇的注射器中。當抗凝血劑與全血組合時，可改變用來沉澱纖維蛋白原的有機溶劑120(如乙醇)的體積以匹配全血中血漿的降低量。例如，Ilml全血可以與ImlACD-A以及2. 2ml乙醇組合。再回到圖1，在沉澱130以後，去除所沉澱的蛋白質(包括纖維蛋白原)140以提供沉澱後液體。去除所沉澱的纖維蛋白原140可包括使用允許液體通過但截留所沉澱蛋白質(包括纖維蛋白原)的濾器過濾所述混合物。或者，可將所沉澱的蛋白質(包括纖維蛋白原)離心以使得沉澱的纖維蛋白原聚集成團或沉積下來，收集液體上清作為沉澱後液體。如170所示，隨後，將沉澱後液體與珠150和鈣160混合併孵育以形成凝塊。所述鈣可包括鈣鹽，如氯化鈣、碳酸鈣、硫酸鈣和其組合。所述鈣可以以固體形式(如鹽晶體)提供，其可預先測定，從而根據特定的容器體積來提供特定的濃度。或者，鈣可以以被沉澱後液體稀釋的濃縮液的形式提供。在某些實施方案中，沉澱後液體可包含螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽，它們可因包含全血或血液級分的液體在沉澱步驟中用抗凝血劑處理而存在。向包含螯合劑的沉澱後液體中加入鈣可以以下述方式進行提供的鈣的終濃度大於可被螯合劑螯合的鈣的量。在這種情況下，加入的鈣提供了可參與凝血級聯的未螯合鈣。在某些實施方案中，沉澱後液體在如「美國專利7，694，828, Swift等，2010年4月3日授權」中所描述的裝置中與珠150和鈣160的結合。這種裝置的一個實例為Clotalyst Autologous Clotting Factor System,由 Biomet Biologic, LLC(華沙，印第安納州)出 售。例如，氯化鈣可以在Clotalyst 管中提供，其可以是與所述珠一起裝入管中的粉末形式或者以在使用前加入到Clotalyst Autologous Clotting Factor System管中的濃縮液體形式。與沉澱後液體體積混合的鈣濃度可以為約3. 4X IO-4M,該鈣濃度可逆轉ACD-A的作用，後者按上面提到的體積和比例使用在沉澱步驟中來防止包含全血或血液級分的液體凝血。170中用來形成凝塊的珠150包括活化珠如玻璃珠。所述珠可以幫助活化一部分沉澱後液體以產生凝血酶。多種珠包括玻璃珠、聚苯乙烯珠、或其他合適的珠。聚苯乙烯和/或玻璃珠150可活化沉澱後液體的多種成分以生產凝血酶，並且可幫助分離和濃縮凝血成分。比如，玻璃珠或聚苯乙烯珠可活化沉澱後液體中的血小板。所述珠可以是任何合適的尺寸，如約0. 001毫米至約3毫米。比如，玻璃珠可以在管中(如Clotalyst 裝置的管)提供，其直徑為約2毫米。在某些實施方案中，在形成凝塊170中攪動沉澱後液體、珠、鈣的混合物。攪動可以通過顛倒、震搖、搖動、攪拌或渦旋混合裝有沉澱後液體、珠和鈣的管或容器來完成。攪動可以實施一次、多次重複、周期性重複、或者可以是持續的。在某些情況下，使用混合組件來攪動沉澱後液體、珠和鈣，如「美國專利7，694，828, Swift等，2010年4月3日授權」中描述的。在混合後或混合時可以保持沉澱後液體、珠、和鈣相接觸以形成凝塊170。如混合物可以孵育約5分鐘至約10分鐘來使凝塊形成。孵育可以在室溫下。在某些實施方案中，混合物在高於室溫的溫度(如37°C )孵育，以促進凝塊形成。如圖I中180所示，使包含凝血酶的溶液與170中所形成的凝塊分離。所述分離可包括離心所述凝塊並取出部分上清作為包含凝血酶的溶液。離心所述凝塊可引起所述珠、凝血物質以及任何殘留細胞物質沉積並聚集成團，使得可傾出包含凝血酶的溶液上清或者將其從聚集成的團上吸去。例如，離心可以是在約3200RPM下約5分鐘。吸去上清(即包含凝血酶的溶液)可以用注射器、移液管或別的合適方式實施。包含凝血酶的溶液可任選地進行濃縮，如190所示。濃縮可包括使用乾燥劑如乾燥用聚丙烯醯胺珠，其吸收凝血酶溶液中的部分液體但可具有小到足以防止凝血酶進入所述珠的孔徑。然後，可將濃縮的凝血酶與液體填充的聚丙烯醯胺珠分離。別的方法也可以用來濃縮和/或分離凝血酶，包括沉澱、過濾、冷凍乾燥、以及本領域所知的其他方法。這些包含凝血酶的溶液可以就這樣使用或者可以保存起來備用。比如，所述凝血酶溶液可通過向含有凝血酶的溶液中加入甘油、多羥基化合物、或醇來保存；加入螯合劑以螯合所述包含凝血酶的溶液中的鈣；將所述包含凝血酶的溶液的PH降低到低於7 ;和/或降低所述含有凝血酶的溶液的溫度。圖2中給出了製備包含凝血酶的溶液的另一個方法200。在210中，將貧血小板血漿吸取到含有乙醇的注射器中以沉澱纖維蛋白原。注射器中乙醇的量與抽到注射器中的貧血小板血漿的量成正比，從而有效地沉澱纖維蛋白原。比如，乙醇可以是貧血小板血漿總體積的25%。在一些實施方案中，所述注射器可設置成容納特定量的貧血小板血漿，而含有對應於該量的25%的乙醇量。一旦纖維蛋白原沉澱，則通過與所述注射器相連的濾器注射所述液體至管中。濾器截留所沉澱的纖維蛋白原，還可截留液體中存在的任何血細胞、血小 板、以及其它沉澱的蛋白質。通過過濾獲得沉澱後液體。如220所示，液體通過濾器注入含有珠和鈣的管中。所述含有珠和鈣的管可以是圖5A和5B描述的分離裝置。然後將含有沉澱後液體、珠和鈣的管如230所示攪動並孵育以形成凝塊。攪動和孵育可包括在至少為約20°C的溫度(如37°C )下加熱至少約20分鐘。凝塊形成之後，如240所示，通過離心使得加熱的珠和固體凝塊物質聚集成團；如250所述，之後取出包含凝血酶的液體上清。參考圖5A和圖5B,分離裝置500 —般包含具有圓柱形壁以及第一端504和第二端506的本體,所述第一端和第二端限定了主室502。在第一端504處有第一口 508、第二口 510、第三口 512、開口 513 和濾器 514。第一口 508、第二口 510、第三口 512 和開口 513中的每一個都延伸穿過第一端504，並允許裝置500的外部與主室502之間流體連通。第一口 508可蓋有第一帽516，第二口 510可蓋有第二帽518，第三口 512可蓋有第三帽520。第一口 508的第一替代帽522可通過第一鏈524與第一口 508相連。當第一替代帽522不使用時，第一蓋526可扣緊至第一替代帽522上。第二口 510的第二替代帽528可通過第二鏈530與第二口 510相連。當第二替代帽528不使用時，第二蓋532可扣緊至第二替代帽528上。第一口 508和第二口 510各自包含截止閥以阻止物質(如玻璃珠540)通過第一口 508和第二口 510離開主室502。所述閥可以是任何合適的閥，如鴨嘴閥。特別參照圖5B，第三口 512包含延伸到主室502內的延長管狀部分534。延長部分534從第一端504延伸到主室502內允許吸取選定物質的深度，所述物質如凝血酶或其他凝血因子。例如以及如下文進一步描述的，當主室502包含沉澱後液體、玻璃珠和鈣時，該混合物的孵育和離心在主室502的第二端506形成包含血細胞、血漿和玻璃珠的凝集團(clotted mass)。在凝集團的上面,在凝集團最接近第一端504的一側,形成包含凝血酶和多種其他凝血因子的流出液。可憑藉肉眼將第二端506上的凝集團與流出液區分開來。為了用延長管狀部分534提取凝血酶以及其他凝血因子，所述延長管狀部分534延伸到主室502內，其深度大約是最接近凝血團的流出液之部分的水平。在延長部分534的遠端提供頂端附加物536。所述頂端附加物536大體上以直角從延長部分534上伸出。所述頂端附加物包含凹槽或凹口 537。兩個支撐杆539大約在頂端附加物536處呈輻射狀從延長部分534上伸出，以接觸主室502的內部。支撐杆539使頂端附加物536偏向挨著主室502內部，以使頂端附加物536維持在主室502內的固定位置。當頂端附加物536接觸到主室502內部時，凹口 537在主室502內壁和頂端附加物536之間提供了缺口或空隙，以允許物質穿過凹口 537並進入頂端附加物536。頂端附加物536幫助使得通過延長部分534抽取的物質的量最大化，特別是當使主室502傾斜以使得更多的圍繞頂端附加物536的物質到達凹口 537上時。所述兩個支撐杆539和頂端附加物536幫助使得延長部分536處於主室502的中央。口 508、510、和512的尺寸與合適的液體遞送或轉移裝置(如注射器)相匹配。例如，第一口 508的尺寸可以與試劑注射器匹配以允許藥劑通過第一口 508並進入主室502 ；第二口 510的尺寸可以與血液注射器匹配以允許血液通過第二口 510並進入主室502 ;以及第三口 512的尺寸可以與注射器匹配以允許從主室502中抽出血液成分(如凝血酶和其他凝血因子)。當物質通過第三口 512從主室502中抽出時，濾器514可以是任何適合過濾這些 物質的濾器。濾器514包含安裝在第一口 508和第二口 510頂上的聚酯濾網。所述聚酯濾網包含尺寸為約15微米至約25微米範圍的開口。比如，開口尺寸可以是約17微米。替代濾器514或除其以外，可以在延長部分534或頂端附加物536上提供與濾器514類似的濾器。主室502還包含活化劑，如玻璃珠540。玻璃珠帶負電的表面活化凝固並釋放凝血因子，其在主室502的第二端506上形成凝集團。玻璃珠540可以是任何合適類型的玻璃珠，如硼矽玻璃珠。用圖5A和圖5B中的裝置產生包含凝血酶的溶液的方法可包括以下方面。首先，將包含氯化鈣和乙醇的試劑通過第一口 908注入主室902中。試劑注入以後，用第一替代帽522關閉第一口 508。將沉澱後液體(如沉澱並除去纖維蛋白原的貧血小板血漿)通過第二口 510注入主室502中。沉澱後液體注入以後，用第二替代帽528關閉第二口 510。任選地，將注射器和血液分離裝置500提前加熱到約25°C的溫度。通過反覆顛倒分離裝置500 (如約12次)，來混合裝置500中的內容物，使得血液與玻璃珠接觸。混合以後孵育該裝置。孵育過程可以在一定的溫度下持續一段時間，所述溫度和時間將允許裝置500的內容物在約25°C下加熱約15分鐘。在孵育時期完成時，在主室502的第二端506上形成紅細胞、血漿、玻璃珠的凝集團。孵育完成以後，充分震搖裝置500以除去和打碎任何可能存在的凝膠。然後將裝置500放置在合適的離心機上在3200RPM下旋轉約15分鐘，以將凝血酶與其餘血液成分分離。離心後，將凝血酶和其他凝血因子的流出液與凝集團分離。離心完成以後，取下第三帽520，並使用合適的抽取裝置(如注射器)通過第三口 512、延長部位534和頂端附加物536從主室502中取出凝血酶和其他凝血因子的流出液。圖3顯示了製備包含凝血酶的溶液的另一個方法300。如320所示，將全血310抽吸到具有一定量A⑶-A的容器中以防止血液凝集。然後將所述抗凝集的血液與乙醇330混合來沉澱纖維蛋白原，以及將合併的液體離心並通過濾器以除去纖維蛋白原沉澱，此時將濾液(即沉澱後液體)收集到包含珠和鈣的新容器中，如340所示。將沉澱後液體、珠和鈣混合併孵育來形成凝塊，如350所示，並且將其離心以使珠和凝塊聚集成團，如360所示。然後，在370中，將液體部分或上清(為包含凝血酶的溶液)轉移到包含乾燥劑的另一個容器中。所述乾燥劑從包含凝血酶的溶液中除去一部分液體。然後從乾燥劑中分離出濃縮的凝血酶，如380所示。本方法可包括產生用作組織封閉劑的凝血酶，此時所述凝血酶可以直接使用或者可另外與其他凝血因子、血液成分或血液產品相組合。例如，所述包含凝血酶的溶液可以與纖維蛋白原混合，並作為纖維蛋白膠施用於創口、傷口或切口。凝血酶可以將纖維蛋白原轉變為纖維蛋白(比如在約5秒至約60秒內)，其隨後形成可密封所施用部位並促進這些部位癒合的纖維蛋白支架。在凝血酶活化後，纖維蛋白原交聯形成三維基質。在某些實施方案中，向對象的部位施用組織封閉劑的方法包括根據本文公開的方法製備包含凝血酶的溶液。然後將所述包含凝血酶的溶液施用到對象的所述部位。例如，可用包含獲得自對象的全血或血液級分的液體製備包含凝血酶的溶液，由此提供自體凝血酶。

施用組織封閉劑的方法還可包括在對象的所述部位施用纖維蛋白原和鈣。纖維蛋白原和/或鈣可與凝血酶相組合，或者這些成分可分開使用。在某些情況下，施用所述組織封閉劑包括共施用(i)包含纖維蛋白原的第一溶液(ii)包含凝血酶和鈣的第二溶液。在這些實施方案中，第一溶液和第二溶液在施用前保持分開，使得直到溶液混合併施用到治療部位凝血酶才活化纖維蛋白原以形成纖維蛋白基質。所述溶液可在臨施用到治療部位前混合，或者可在治療部位混合。凝血酶、纖維蛋白原、和鈣也可在施用到對象部位前就合併在一起以引發凝血級聯。隨著凝血級聯的進展，凝膠樣的物質開始形成，其隨後可施用到部位以用作組織封閉劑。本發明組織封閉劑和方法可在外科手術(如整形外科手術)時用在切口部位、移植部位或修復部位。所述組織封閉劑可通過封閉所述部位幫助組織中切口癒合，並且之後還可有助於機體康復。除了纖維蛋白原和鈣之外，根據本發明方法製備的包含凝血酶的組織封閉劑還可包含一種或多種血液成分。血液成分的實例包括全血、富血小板血漿、血小板濃縮物、貧血小板血漿或其濃縮物。當所述血液成分包含螯合劑(如檸檬酸鹽)時，所述組織封閉劑可包含過量的鈣來掩蓋螯合劑並提供用於凝血級聯的游離鈣離子。本發明的方法和組合物可用於從多種來源(包括自體的、同源的、或異源)製備凝血酶。比如，可製備牛凝血酶以用作對人進行手術時的組織封閉劑。凝血酶還可以從同源來源得到，如相匹配的人供體。然而，在組織封閉中使用自體凝血酶和自體凝血因子(如自體纖維蛋白原和自體血液成分)是期望的，以降低感染、免疫反應、或使用非自體來源引起的其它副作用的可能性。因此，本發明方法可提供自體組織封閉劑，其可在對象接受外科手術或者治療對象身上的創傷或外傷之前或期間製備。術語的非限制性討論本文使用的標題(如「背景技術」和「發明內容」)和小標題只是為了一般性組織本公開內容的主題，並不是為了限制本發明的公開內容或其任何方面。特別的，在「背景技術」公開的主題可能包括新技術，可能不構成對現有技術的記載。在「發明內容」公開的主題，並不是對本發明或其任何實施方案整個範圍的窮舉性或完全的公開。由於具有特定的用途而在本說明書的某章節中對物質的分類或討論僅是為方便起見，而不應推斷出當其在任何給定組合物或方法中使用時所述物質必須或僅僅根據本文中的該分類發揮作用。本文引用的參考文獻並不是承認這些參考文獻為現有技術或者與本文所公開發明的專利性有任何關聯。對技術領域和背景技術部分所引用的參考文件內容的任何討論，只是為了提供參考文獻作者觀點的一般性總結，而不是承認這些參考文獻內容的正確性。本說明書的具體實施方式
章節中引用的所有參考文獻通過引用以整體併入本文。當給出本發明的實施方案時，描述和具體實施例的目的只是為了舉例說明本發明而不旨在限制其範圍。另外，具有所述特徵的多個實施方案的記載並不旨在排除其他具有額外特徵的實施方案或者併入所述特徵的不同組合的實施方案。除非另外明確規定，提供具體實施例是為了舉例說明怎樣製備和使用本發明組合物和方法的目的，而不旨在陳述本發明給定的實施方案已製備或測試或者未製備或測試。可以在本發明範圍內對某些實施方案、材料、組合物、和方法進行等同的改變、修改或變化，具有基本上類似的結果。本文使用的詞語「期望」或「可以期望」指在特定的情況下提供某些優點的本發明的實施方案。然而，在相同的情況或別的情況下，別的實施方案也可能是「期望」的。此外， 一個或多個期望的實施方案的記載並不暗示其他實施方案不可用，也不旨在從本發明範圍內排除其他實施方案。本文使用的詞語「包括」以及它的多種變化形式意為非限制性的，使得列表中項目的記載不排除在本發明的物質、組合物、裝置和方法中也可用的其他類似項目。類似的，術語「可」和「可以」以及其變化形式也意為非限制性的，使得對實施方案的記載「可」或「可以」包含某些要素或特徵，而不排除不含有這些要素或特徵的本發明的其他實施方案。儘管作為非限制性術語如「包含」、「含有」、「具有」同義詞的開放式術語「包括」在本文中用於描述或限定本發明的實施方案，但是作為替代地，實施方案也可用更具限制性的術語如「由...組成」或「基本上由...組成」來描述。因此，對於記載物質、組分或過程步驟的任何給定的實施方案，本發明還特別包括由這些物質、組分或過程步驟組成或者基本上由其組成的實施方案，以排除額外的物質、組分或過程(由...組成)，以及排除影響實施方案重要性質的額外的物質、組分或過程(基本上由...組成)，即使這些額外物質、組分或過程未在本申請中明確記載。例如，記載了要素A、B和C的組合物或過程的敘述特別預想了由A、B和C組成以及基本上由其組成的實施方案，排除了在本領域可涉及的要素D，即使本文並沒有明確指出排除要素D。除非另外規定，本文提到的組合物的所有百分比為以總組合物重量計。除非另外規定,範圍的公開包括端點，包括公開內容的所有不同值，以及整個範圍內進一步細分的範圍。因此，比如，某範圍為「從A至B」或者「從約A至約B」就包括了 A和B。對於特定參數(如溫度、分子量、重量百分比等)，值和值的範圍的公開並不排除其他本文有用的值和值的範圍。對於給定的參數，認為兩個或更多個具體示例的值可確定對於該參數所要求權利的值範圍的端點。比如，如果在本文中舉例說明參數X具有值Z，另外舉例說明具有值Z，那麼可認為參數X可具有約A至約Z的值的範圍。類似的，認為對於參數(無論這些範圍是嵌套的、重疊的還是不同的)，兩個或更多值範圍的公開包括了可使用所公開範圍的端點要求權利的值範圍的所有可能組合。例如，如果本文舉例說明參數X具有1-10或2-9或3-8範圍的值，那麼可認為參數X可具有其他值的範圍，包括1-9，1-8，1-3，1-2，2-10，2-8，2-3，3-10，和 3-9。
當提到要素或層位於另一要素或層「上」，或者與之「連接」、「相連」或「結合」時，則它可以直接位於另一要素或層上，與其連接、相連或結合，也可以存在介於它們之間的要素或層。相反的，當提到某一要素或層「直接位於」另一要素上，或者與之「直接連接」、「直接相連」或者「直接結合」時，就不存在介於它們之間的要素或層。其他用於描述要素間關係的詞也應該按同樣的使用方式理解(如「位於...之間」和「直接位於...之間」，「相鄰 」和「直接相鄰」等)。本文使用的術語「和/或」包括一個或多個相關列出項之間的任何以及所有組合。
權利要求
1.用於製備包含凝血酶的溶液的方法，所述方法包括 從包含貧血小板血漿或全血的液體中沉澱纖維蛋白原； 從所述液體中除去沉澱的纖維蛋白原以形成沉澱後液體； 將所述沉澱後液體與鈣和多個珠一起孵育以形成凝塊；和 將包含凝血酶的溶液與所述凝塊分離。
2.根據權利要求I的方法，其中所述包含貧血小板血漿或全血的液體包含貧血小板血漿。
3.根據權利要求I的方法，其中所述包含貧血小板血漿或全血的液體還包含抗凝血劑。
4.根據權利要求3的方法，其中所述抗凝血劑包括酸-檸檬酸鹽-葡萄糖溶液。
5.根據權利要求I的方法，其中所述沉澱步驟包括向所述包含貧血小板血漿或全血的液體中添加有機溶劑。
6.根據權利要求5的方法，其中所述有機溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮或其組合。
7.根據權利要求I的方法，其中所述孵育步驟包括孵育約5分鐘至約10分鐘。
8.根據權利要求I的方法，其中所述包含貧血小板血漿或全血的液體還包含螯合劑，並且鈣以大於所述螯合劑可結合之量的量存在。
9.根據權利要求I的方法，其中所述珠包括玻璃珠、聚苯乙烯珠或其組合。
10.根據權利要求I的方法，其中將包含凝血酶的溶液與所述凝塊分離包括離心所述凝塊和取出作為包含凝血酶之溶液的一部分上清。
11.根據權利要求I的方法，其還包括以下步驟中的至少之一向所述包含凝血酶的溶液中加入甘油、多羥基化合物或醇；向所述包含凝血酶的溶液中加入螯合劑以螯合鈣；將所述包含凝血酶之溶液的PH調節到低於7 ;以及降低所述包含凝血酶之溶液的溫度。
12.根據權利要求I的方法，其中 從包含貧血小板血漿或全血的液體中沉澱纖維蛋白原包括向貧血小板血漿中添加乙醇； 從所述液體中除去沉澱的纖維蛋白原以形成沉澱後液體包括過濾所述液體； 將所述沉澱後液體與鈣和多個珠一起孵育以形成凝塊包括將所述沉澱後液體、氯化鈣和珠混合；和 將包含凝血酶的溶液與所述凝塊分離包括將所述凝塊離心並取出作為包含凝血酶之溶液的一部分上清。
13.根據權利要求I的方法，其中 從包含貧血小板血漿或全血的液體中沉澱纖維蛋白原包括將貧血小板血漿或全血抽吸到含有乙醇的注射器中，其中當所述液體包含全血時，所述注射器中還含有抗凝血劑；從所述液體中除去沉澱的纖維蛋白原以形成沉澱後液體包括將濾器與所述注射器相連並將所述液體過濾進包含所述鈣和所述多個珠的管中； 將所述沉澱後液體與鈣和多個珠一起孵育以形成凝塊包括將所述沉澱後液體、氯化鈣和珠在所述管中混合；以及 將包含凝血酶的溶液與所述凝塊分離包括離心所述凝塊並取出作為包含凝血酶之溶液的一部分上清。
14.根據權利要求13的方法，其還包括濃縮所述包含凝血酶的溶液。
15.根據權利要求14的方法，其中濃縮所述包含凝血酶的溶液包括將所述溶液與聚丙烯醯胺珠一起孵育。
16.用於向對象的部位施用組織封閉劑的方法，其包括 根據權利要求I的方法製備包含凝血酶的溶液； 向所述對象的所述部位施用所述包含凝血酶的溶液。
17.根據權利要求16的方法，其中使用包含獲得自所述對象的全血或血液級分的液體製備所述包含凝血酶的溶液。
18.用於在具有混合組件的容器中由全血樣品製備包含凝血酶之溶液的方法，所述方法包括 採集全血樣品； 沉澱所述全血樣品中的纖維蛋白原； 通過過濾所述全血樣品或離心所述全血樣品以使得沉澱的纖維蛋白原沉積下來，從而從所述全血樣品中除去沉澱的纖維蛋白原以形成沉澱後全血樣品； 將所述沉澱後全血樣品引入所述容器中； 將所述沉澱後全血樣品與鈣鹽和活化珠混合；和 在將所述沉澱後全血樣品與所述成分混合後，從所述容器中抽出一定體積的包含凝血酶的溶液。
19.根據權利要求18的方法，其中所述沉澱步驟包括添加選自甲醇、乙醇、丙酮、和其組合的有機溶劑。
20.根據權利要求18的方法，其還包括將乙醇混入所述混合的沉澱後全血樣品，以得到在所述混合的沉澱後全血樣品中約4%至約7%的乙醇濃度。
21.根據權利要求18的方法，其中將所述沉澱後全血樣品與聚丙烯醯胺珠混合。
22.用於向對象的部位施用組織封閉劑的方法，其包括 根據權利要求18的方法製備包含凝血酶的溶液；和 向所述對象的所述部位施用所述包含凝血酶的溶液。
23.根據權利要求22的方法，其中使用從所述對象採集的全血樣品製備所述包含凝血酶的溶液。
24.根據權利要求22的方法，其中所述施用包括共施用(i)包含纖維蛋白原的第一溶液和(ii)第二溶液，所述第二溶液包含所述包含凝血酶的溶液和鈣。
全文摘要
本發明涉及有關生成和使用凝血酶的方法、裝置和組合物。所述方法包括通過從液體中沉澱纖維蛋白原來製備包含凝血酶的溶液，所述液體包含全血或血液級分。從所述液體中除去所沉澱的纖維蛋白原，以形成沉澱後液體，所述沉澱後液體與鈣、多個珠一起孵育以形成凝塊。將包含凝血酶的溶液與所述凝塊分離。由此製備的凝血酶可用作組織封閉劑，以及用在給對象施用組織封閉劑(包括施用自體組織封閉劑)的方法中。
文檔編號C12N9/74GK102766616SQ20121013539
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月2日 優先權日2011年5月2日
發明者希拉蕊·奧弗霍爾澤, 珍妮弗·E·沃德爾-馬伊 申請人:拜歐米特生物製劑有限責任公司