人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品及製備的製作方法
2023-07-12 20:57:26 1
專利名稱：人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品及製備的製作方法
所屬領域本發明涉及一種生物工程領域中用於治療眼表疾病的產品及其製備方法，特別涉及一種可以修復角膜緣幹細胞損傷，用於眼表重建的人角膜緣幹細胞—羊膜組織工程複合體及其製備方法。
背景技術：
近年來在眼表疾病的治療中，最重要的突破是對角膜緣幹細胞的功能和定位的認識。大量研究結果顯示角膜緣基底層的部分細胞保持了未分化特性，為角膜上皮細胞的「幹細胞」，這些細胞具有以下幾個特徵(1)具有增殖潛力，(2)能夠自我更新，(3)能產生大量終末分化的功能性細胞，(4)能修復組織損傷。以角膜緣幹細胞缺陷為特徵的眼表疾病是由於角膜緣幹細胞損傷造成角膜上皮修復缺陷，最終導致角膜基質瘢痕化，其病變範圍只涉及眼表上皮，但卻往往嚴重損害視功能，是嚴重的致盲性眼病。對於此類患者，其角膜後部基質和內皮以及眼球其它組織都很健康，只需要解決由於幹細胞缺陷造成的眼表重建障礙即可提高患者的視功能。然而傳統的手術方法如瞼緣縫合術、自體結膜移植、口腔黏膜移植、羊膜移植、角膜緣幹細胞移植都具有諸多局限性。嚴重的角膜緣幹細胞缺陷性眼表疾病的治癒亟待新的治療技術和治療產品。
目前，隨著組織工程技術的迅速發展，在借鑑傳統上皮細胞培養體系的基礎上，引入羊膜作為角膜緣幹細胞體外培養的載體，培養的角膜緣幹細胞移植已在臨床應用中獲得了初步成功。在此項技術中，合理的體外培養體系是取得良好結果的最重要的前提，其中最重要的是保證在培養體系中含有一定數量的幹細胞，並且所用的培養體系能較好地維持角膜緣幹細胞的原始細胞特性。此外，上皮細胞培養體系中需要加入3T3成纖維細胞作滋養層，但由於3T3成纖維細胞為鼠源性的永生細胞系，含有鼠源性異種基因和逆轉錄病毒基因，為臨床應用帶來了潛在威脅。因此建立合理的人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的體外培養體系，使之具有有效性和生物安全性，則具有特別重要的臨床意義。
發明內容
本發明的目的就在於克服上述現有技術中存在的不足，而提供一種人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品及製備方法，該羊膜複合體具有有效性和生物安全性。
本發明的技術方案是一種人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品，其特徵在於在組織學形態上接近人角膜上皮形態，在免疫學表型上與人角膜緣上皮類似，其超微結構顯示細胞與細胞之間的連接發育成熟，上皮細胞與羊膜載體之間為緊密的粘連。
上述人角膜緣幹細胞—羊膜組織工程複合體的組織學形態為在羊膜載體上生長的復層人角膜緣上皮細胞分化為4～6層細胞的復層結構，基底細胞呈柱狀。
上述人角膜緣幹細胞—羊膜組織工程複合體的表型為在羊膜上生長的復層角膜緣上皮細胞表層細胞細胞角質蛋白(CK3)陽性，基底層細胞陰性，大部分表層細胞ΔNp63陽性，基底層細胞ΔNp63為陰性；基底層細胞很少表達縫隙連接蛋白(Cx43)，僅在表層細胞有少量表達。
上述人角膜緣幹細胞—羊膜組織工程複合體的超微結構為角膜緣上皮細胞長勢良好，易見上皮有絲分裂相，細胞核大；細胞之間有豐富的橋粒連接；基底部細胞的基底部胞漿有大量的突起深入基底板和網狀板，細胞與基底膜之間沒有空隙，由細胞分泌產生的基底板發育比較完整，網狀板增厚；並與膠原纖維融合。
上述人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備方法，其特徵在於依照下列步驟完成①人角膜緣幹細胞的體外培養載體—羊膜的製備分離和保存羊膜，使用時取出凍存的羊膜，0.1％的EDTA和0.1％的胰蛋白酶先後作用去除羊膜上皮細胞；②人角膜緣成纖維細胞滋養層的製備分離胎兒角膜緣間質組織，培養人角膜緣成纖維細胞，用4μg/ml絲裂黴素C處理人角膜緣成纖維細胞；③人角膜緣上皮細胞懸液的製備包括以下步驟分離人角膜緣組織，用1.2U/ml的Dispase II分離人角膜緣上皮細胞，用0.1％的胰蛋白酶和機械抽吸製備單細胞懸液；④人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的培養將上述經過處理的羊膜放入鋪有絲裂黴素C處理過的人角膜緣成纖維細胞的培養板內，並將人角膜緣上皮細胞懸液以5×103/cm2的密度接種於羊膜上，經過培養液的培養14-21天後採用air-lifting技術，把細胞置於氣液交界面7天。
上述羊膜來自健康孕婦剖宮產的胎膜。
上述角膜緣間質組織來自胎兒的眼球。
上述人角膜緣上皮細胞來自新鮮屍體眼、患者自身眼球或親屬健康眼球。
上述培養液採用60％DMEM和30％Ham’s F12培養液，內加10％胎牛血清、5μg/ml胰島素、0.18mM腺嘌呤、0.1nM霍亂毒素、0.4μg/ml氫化考的松、2nM三碘甲腺原氨酸、4mM穀氨醯胺、50IU/ml氫鏈黴素和10ng/ml表皮生長因子。
本發明的優點為1、本發明在人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備方法中引入羊膜作為角膜緣幹細胞的體外培養載體，使產品具有生物相容性，並可發揮羊膜用於眼表疾病治療的優越性。採用細胞懸液法培養，可保證在培養體系中含有一定數量的幹細胞。採用air-lifeing技術以促進細胞分化，且利用人角膜緣成纖維細胞為滋養層，既能有效地發揮滋養層的作用，有助於維持角膜緣幹細胞原始細胞的特徵，又能去除了鼠源性3T3成纖維細胞可能帶來的異源性基因的潛在威脅，使產品具有安全性。2、本發明中的產品人角膜緣幹細胞組織工程產品具有和人角膜緣上皮相似的表型，超微結構顯示細胞之間連接發育成熟，細胞與羊膜之間建立了緊密粘連，從而使產品在臨床應用上具有有效性。
本發明具有特別重要的用途1.按照本發明提供的製備技術，可以為人角膜緣幹細胞的體外培養提供合適載體。
2.按照本發明提供的人角膜緣成纖維細胞滋養層的製備技術，可以建立人角膜緣成纖維細胞系，用於作為人角膜緣幹細胞體外培養的滋養層。
3.按照本發明提供的人角膜緣上皮細胞懸液的製備技術，可以獲得包含人角膜緣幹細胞在內的純的上皮細胞懸液。
4.按照本發明提供的人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備技術，可以使得角膜緣幹細胞在羊膜上大量擴增，並分化為復層上皮樣結構，用於製備人角膜緣幹細胞組織工程產品。
5.按照本發明製備技術製備的人角膜緣幹細胞—羊膜組織工程複合體可以用於治療以角膜緣幹細胞缺陷為特徵的眼表疾病。
圖1為人角膜緣幹細胞組織工程產品的組織學結構圖，其中a在羊膜上形成的單層細胞較為扁平；b在羊膜上生長的復層人角膜緣上皮細胞分化為4～6層細胞的復層結構，基底細胞呈柱狀。
圖2為正常角膜和角膜緣上皮細胞的表型圖，其中a角膜緣上皮表層細胞表達CK3，基底層細胞不表達；b角膜上皮全層表達CK3；c角膜緣基底層細胞ΔNp63表達陽性；d周邊角膜基底層細胞間或有ΔNp63的表達；e中央角膜上皮不表達；f角膜緣基底部細胞表達Cx43較少；g角膜上皮的基底部細胞大量表達Cx43。
圖3為人角膜緣幹細胞組織工程產品的表型圖，其中a在羊膜上生長的單層角膜緣上皮細胞CK3陽性率14.3％；b在羊膜上生長的單層角膜緣上皮細胞ΔNp63陽性率為87.5％；c在羊膜上生長的單層角膜緣上皮細胞僅偶有Cx43的表達；d在羊膜上生長的復層角膜緣上皮細胞表層細胞CK3陽性，基底層細胞陰性；e在羊膜上生長的復層角膜緣上皮細胞基底層細胞ΔNp63陽性，表層細胞大部分為陰性；f在羊膜上生長的復層角膜緣上皮細胞基底層細胞很少表達Cx43，僅在表層細胞有少量表達。
圖4為人角膜緣幹細胞組織工程產品的超微電鏡結構圖(細胞在羊膜上生長至單層的形態)，其中a角膜緣上皮細胞核大，染色質豐富，有大核仁；b細胞間可見到橋粒結構(arrow)和緊密連接(arrowhead)；c基底部的胞漿突起伸入間斷的基底板(arrow)，偶見錨狀纖維(arrowhead)；d部分胞漿突起處有濃集的蛋白質沉著(arrow)，上皮細胞分泌形成間斷的基底板(arrowhead)，網狀板不完整(star)，其下為膠原纖維組成的羊膜基質。
圖5為人角膜緣幹細胞組織工程產品的超微電鏡結構圖(細胞在羊膜上生長至復層的形態)，其中a角膜緣上皮細胞長勢良好，易見上皮有絲分裂相(arrowhead)，細胞核大；b有豐富的橋粒連接(arrowhead)，遠較單層細胞為多；c基底部細胞的基底部胞漿深入基底板和網狀板的乳頭多而大，細胞與基底膜之間基本沒有明顯的空隙，基底板發育比較完整(arrow)，網狀板增厚(star)；d基底板發育完整，網狀板增厚，與膠原纖維融合(star)。
具體實施例方式一種用於治療角膜緣幹細胞缺陷性眼表疾病的人角膜緣幹細胞—羊膜組織工程複合體的培養方法依照下列步驟完成1、羊膜的製備取健康孕婦剖宮產胎膜，沿生理間隙分離羊膜和絨毛膜，將羊膜上皮面朝上平鋪於硝酸纖維膜上，放入由50％的DMEM(Gibco，USA)和50％的甘油組成的保存液中，置-80℃保存三個月以上。使用時從冰箱取出凍存的羊膜，置37℃水浴箱中融化。用0.1％的EDTA作用30分鐘，再用0.1％的胰蛋白酶作用30秒，用細胞刮子輕輕刮去羊膜上皮細胞。將羊膜上皮面朝上平鋪於culture insert(Millipore，USA)內備用。2、人角膜緣成纖維細胞滋養層的製備顯微鏡下取胎兒眼角膜緣組織，用1.2U/ml的Dispase II(Millipore，USA)作用後去除上皮，將上皮下結締組織置入25cm培養瓶中，加入DMEM(10％胎牛血清，100U/ml青鏈黴素)培養液進行培養。待人角膜緣成纖維細胞鋪滿約1/2瓶底後傳代。用4μg/ml的絲裂黴素C作用生長近融和的人角膜緣成纖維細胞2小時，作用後的細胞凍存備用。用時以2×104/cm2的密度接種六孔板，24小時後備用。3、人角膜緣上皮細胞懸液的製備取來自眼庫的新鮮屍體眼球，顯微鏡下取厚約100μm的板層角膜緣組織，用1.2U/ml的Dispase II 37℃作用2小時。顯微鏡下分離角膜緣上皮，將上皮置入0.1％的胰蛋白酶溶液中作用4分鐘。用4號針頭抽吸細胞製成單細胞懸液。4、人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的培養人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的培養將鋪有羊膜的culture insert放入鋪有絲裂黴素C處理過的人角膜緣成纖維細胞的6孔板內，人角膜緣上皮細胞懸液以5×103/cm2的密度接種於羊膜上，培養液採用DMEM和Ham’s F12(Gibco，USA)培養液(2∶1混合)，內加胎牛血清(10％)(Hyclone，USA)、胰島素(5μg/ml)(Sigma，USA)、腺嘌呤(0.18mM)(Sigma，USA)、霍亂毒素(0.1nM)(Sigma，USA)、氫化考的松(0.4μg/ml)(Sigma，USA)、三碘甲腺原氨酸(2nM)(Sigma，USA)、穀氨醯胺(4mM)、氫鏈黴素(50IU/ml)，置37℃、5％的CO2孵箱中培養。接種3天以後，培養液中開始加入表皮生長因子(10ng/ml)(PeproTech，UAS)。之後每兩天換液一次。培養21天以後，採用air-lifting技術，把細胞置於氣液交界面7天。
採用上述方法培養的人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的實驗檢測1、組織學觀察培養14天和培養28天的人角膜緣幹細胞—羊膜複合體作冰凍切片，HE染色。
2、免疫組織化學技術檢測ΔNp63和CK3的表達在培養14天細胞形成單層後，將人角膜緣幹細胞—羊膜複合體直接鋪於載玻片上，正常人角膜組織和培養28天分化為復層上皮的人角膜緣幹細胞—羊膜複合體作冰凍切片，採用免疫組織化學技術行ΔNp63和CK3的檢測，分別以鼠抗CK3單克隆抗體(ICN，USA)和鼠抗ΔNp63單克隆抗體(BD，USA)為一抗，採用SAB試劑盒(中山公司)，DAB顯色，蘇木素復染。
3、免疫螢光技術檢測Cx43的表達單層人角膜緣幹細胞—羊膜複合體直接鋪於載玻片上，正常人角膜組織和復層人角膜緣幹細胞—羊膜複合體作冰凍切片，採用免疫螢光技術檢測Cx43的表達。以鼠抗Cx43單克隆抗體(CHEMICON，USA)為一抗，FITC標記的羊抗鼠IgG(Sigma，USA)為二抗，用Hoechst螢光染料(Sigma，USA)復染核，螢光顯微鏡觀察。
4、透射電鏡觀察取培養14天和28天的角膜緣上皮細胞—羊膜複合體，用2.5％的戊二醛/多聚甲醛固定，1％的四氧化鋨後固定，上升梯度酒精脫水後，用Epon812環氧樹脂包埋。LKB-V超薄切片機半薄切片(1μ)定位後，進行超薄切片。醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，JEOL-100CX透射電鏡觀察。
檢測結果如下1)人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的組織學形態組織學切片顯示，在羊膜上形成的單層細胞較為扁平，與羊膜粘連緊密。28天後，上皮細胞分化為4～6層細胞的復層結構，基底層細胞接近柱狀。(附圖1)2)人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的表型正常的人角膜緣上皮表層細胞表達CK3，基底層細胞不表達，角膜上皮全層CK3陽性；角膜緣基底層細胞ΔNp63表達強陽性，周邊角膜基底層細胞間或有ΔNp63的表達，中央角膜上皮不表達ΔNp63；角膜緣基底部細胞表達Cx43較少，而角膜上皮的基底部細胞大量表達Cx43。(附圖2)培養的人角膜緣上皮細胞長成單層時，ΔNp63表達陽性率為87.5％，表達細胞角質蛋白3的細胞只有14.3％，免疫螢光顯示只極少數細胞表達Cx43。分化為復層的人角膜緣上皮細胞的基底層細胞ΔNp63表達強陽性，不表達CK3和Cx43，基底層以上細胞CK3陽性。以上結果表明在我們的培養體系中，角膜緣幹細胞的原始細胞特性能夠在整個培養過程中得以保留。(附圖3)3)人角膜緣幹細胞—羊膜複合體超微結構培養14天後，電鏡下可見在羊膜上生長的單層角膜緣上皮細胞核大，染色質豐富，有大的核仁，細胞間有完整的橋粒和緊密連接形成。角膜緣上皮細胞基底部有胞漿突起伸入間斷的基底板以及網狀板，基底部的胞漿與基底板留有多處空隙，在部分胞漿突起處有濃集的蛋白質沉著，偶見斜向或略垂直的錨狀纖維。上皮細胞分泌形成間斷的基底板，網狀板不太完整。(附圖4)培養28天以後，角膜緣上皮細胞長勢良好，易見上皮有絲分裂相，細胞核大，上皮細胞表面微絨毛增生，呈複雜的指狀交叉。有豐富的緊密連接和橋粒連接，遠較單層細胞為多。基底部細胞的基底部胞漿深入基底板和網狀板的乳頭多而大，細胞與基底膜之間基本沒有明顯的空隙；基底板發育更加成熟，比較完整；網狀板增厚，更為完整，局部與羊膜的膠原纖維融合。(附圖5)
權利要求
1.一種人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品，其特徵在於在組織學形態上接近人角膜上皮形態，在免疫學表型上與人角膜緣上皮類似，其超微結構顯示細胞與細胞之間的連接發育成熟，上皮細胞與羊膜載體之間為緊密的粘連。
2.根據權利要求1所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品，其特徵在於上述人角膜緣幹細胞組織工程產品的組織學形態為在羊膜載體上生長的復層人角膜緣上皮細胞分化為4～6層細胞的復層結構，基底細胞呈柱狀。
3.根據權利要求1所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品，其特徵在於上述人角膜緣幹細胞組織產品的表型為在羊膜上生長的復層角膜緣上皮細胞表層細胞細胞角質蛋白(CK3)陽性，基底層細胞陰性，大部分表層細胞ΔNp63陽性，基底層細胞ΔNp63為陰性；基底層細胞很少表達縫隙連接蛋白(Cx43)，僅在表層細胞有少量表達。
4.根據權利要求1所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品，其特徵在於上述人角膜緣幹細胞組織工程產品的超微結構為角膜緣上皮細胞長勢良好，易見上皮有絲分裂相，細胞核大；細胞之間有豐富的橋粒連接；基底部細胞的基底部胞漿有大量的突起深入基底板和網狀板，細胞與基底膜之間沒有空隙，由細胞分泌產生的基底板發育比較完整，網狀板增厚；並與膠原纖維融合。
5.一種根據權利要求1所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備方法，其特徵在於依照下列步驟完成①人角膜緣幹細胞的體外培養載體—羊膜的製備分離和保存羊膜，使用時取出凍存的羊膜，0.1％的EDTA和0.1％的胰蛋白酶先後作用去除羊膜上皮細胞；②人角膜緣成纖維細胞滋養層的製備分離胎兒角膜緣間質組織，培養人角膜緣成纖維細胞，用4μg/ml絲裂黴素C處理人角膜緣成纖維細胞；③人角膜緣上皮細胞懸液的製備包括以下步驟分離人角膜緣組織，用1.2U/ml的DispaseII分離人角膜緣上皮細胞，用0.1％的胰蛋白酶和機械抽吸製備單細胞懸液；④人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的培養將上述經過處理的羊膜放入鋪有絲裂黴素C處理過的人角膜緣成纖維細胞的培養板內，並將人角膜緣上皮細胞懸液以5×103/cm2的密度接種於羊膜上，經過培養液的培養14-21天後採用air-lifting技術，把細胞置於氣液交界面7天。
6.根據權利要求5所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備方法，其特徵在於上述羊膜來自健康孕婦剖宮產的胎膜。
7.根據權利要求5所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備方法，其特徵在於上述角膜緣間質組織來自胎兒的眼球。
8.根據權利要求5所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備方法，其特徵在於上述人角膜緣上皮細胞來自新鮮屍體眼、患者自身眼球或親屬健康眼球。
9.根據權利要求5所述的人成纖維細胞滋養的人角膜緣幹細胞組織工程產品的製備方法，其特徵在於上述培養液採用60％DMEM和30％Ham’s F12培養液，內加10％胎牛血清、5μg/ml胰島素、0.18mM腺嘌呤、0.1nM霍亂毒素、0.4μg/ml氫化考的松、2nM三碘甲腺原氨酸、4mM穀氨醯胺、50IU/ml氫鏈黴素和10ng/ml表皮生長因子。
全文摘要
一種以人角膜緣成纖維細胞為滋養層的人角膜緣幹細胞—羊膜組織工程複合體，其特徵在於在組織學形態上接近人角膜上皮形態，在免疫學表型上與人角膜緣上皮類似，其超微結構顯示細胞與細胞之間的連接發育成熟，上皮細胞與羊膜載體之間為緊密的粘連。其培養方法依照下列步驟完成①人角膜緣幹細胞的體外培養載體—羊膜的製備；②人角膜緣成纖維細胞滋養層的製備；③人角膜緣上皮細胞懸液的製備；④人角膜緣幹細胞—羊膜複合體的培養。本人角膜緣幹細胞—羊膜複合體優點是具有和人角膜緣上皮相似的表型，為治療角膜緣幹細胞缺陷性眼表疾病提供了安全而有效的生物組織工程產品。
文檔編號C12N5/08GK1635115SQ20041001934
公開日2005年7月6日 申請日期2004年5月27日 優先權日2004年5月27日
發明者張曉敏, 孫慧敏, 李筱榮 申請人:天津醫科大學眼科中心