一種複合檢測多種類病原體的蛋白質懸浮晶片及其製備方法和檢測方法

2023-07-13 10:46:21 1

專利名稱：：一種複合檢測多種類病原體的蛋白質懸浮晶片及其製備方法和檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種複合檢測多種類病原體的蛋白質懸浮晶片製備及其才企測方法，所述的病原體包括細菌、細菌芽；包、細菌毒素、才直物毒素和病毒，分別選以鼠疫耶爾森菌(fem'//a/e^/s)、炭疽芽胞桿菌(勘"7/iA^a/2^rac/力、葡萄球菌腸毒素B(staphylococcalenterotoxinB,SEB)、蓖麻毒素(ricin)和重症急性呼吸道綜合症冠狀病毒(SARS-CoV)為代表。
背景技術：
：進入20世紀以後，生物威脅有增無減。1996年日本EHEC0157:H7疫情、2003年全球SARS疫情、2001年美國炭疽郵包事件、1995年美國明尼蘇達州蓖麻毒素事件等，人類面臨生物威脅的事例多不勝數。人為生物恐怖事件隨時有發生的可能，更引起人們對生物威脅的恐懼。而新發傳染病種類繁多，生物恐怖因子多種多樣，包含細菌、病毒、毒素等，威脅人類健康的生物因子至少有30多種。由於針對不同病原體襲擊的防護和處理各不相同，一線工作者既要保護自身安全，也要做到科學處置，因此病原體的快速鑑定識別是應對生物威脅的首要任務。目前，基於微生物學、化學、分子生物學和免疫學理論發展起來的病原體快速檢驗方法可以分別對環境樣本中的生物威脅因子進行定性和定量檢測。定性檢測技術有常規的分離培養、血清學方法等，鑑定結果雖然準確可靠，但耗時長，每次只能確定或排除一種病原;徵生物，往往延誤緊急突發公共衛生事件的處置。快速檢測技術主要是以病原體遺傳物質核酸為基礎的檢測方法如核酸分子雜交、PCR、多重PCR等，和基於病原體核酸或抗原檢測的生物傳感器技術，如光纖傳感器、電化學傳感器、上轉換磷光生物傳感器、納米傳感器等。其中，利用多重PCR方法進行單一或多種致病菌的試驗屢有報導。微生物定量檢測方法包括常規的平板法、最大可能數(MPN)法、細胞計數法和阻抗計法等，也存在耗時長，每次只能對一種病原體進行定量檢測的缺陷；微生物定量檢測的新技術主要是實時定量PCR,近年來在多種病原微生物的定量檢測中得到廣泛應用，但缺陷是只能檢測病原菌的核酸，不能檢測毒素蛋白。炭疽芽孢桿菌a/^力rac/力是引起人獸共患病-炭疽的病原菌，為革蘭氏陽性可形成芽孢的需氧菌，芽孢可以通過呼吸道、消化道、皮膚接觸感染人類，一般在接觸後7天出現感染症狀，以皮膚型炭疽最常見。吸入大量炭疽芽孢(大於8000個)可引起吸入型炭疽，也稱肺炭疽。由於炭疽芽孢具有對外界環境極強的抵抗力，致汙染可持續存在，在軍事上一直被列為是頭號生物戰劑之一。在一些國家曾生產並作為武器儲存，而今又成為恐怖襲擊選用劑，對人類造成新的更大的威脅。炭疽芽孢桿菌的抗原包括菌體抗原和芽孢抗原。炭疽芽孢桿菌的生存、增殖不需特殊條件設備及環境，在土壤中就可增殖，人工大量培養及使之變為芽孢十分容易。由於芽孢獨特的生物學性狀和危害，對炭疽芽孢的快速定量檢測意義重大。本發明選擇炭疽芽孢作為產芽孢的細菌及其芽孢的代表建立懸浮晶片檢測模型。鼠疫耶爾森菌(/e"/z7/a/es"s)可引起動物疫源性烈性傳染病-鼠疫，其天然宿主是嚙齒類動物。鼠疫往往是由於接觸帶菌的嚙齒類動物或被染菌的蚤類嚇咬而發病。歷史上記載過三次鼠疫的世界性大流行，造成人類生命和財產的巨大損失。在我國鼠疫被列為曱類傳染病。作為一種烈性傳染病，鼠疫具有傳播快、病死率高等特點，是經典的生物戰劑。目前，以生物武器形式出現的鼠疫最有可能發生的是肺鼠疫，該病人間傳播更為迅速。鼠疫菌的快速檢測對控制鼠疫的擴散蔓延至關重要。本發明選擇鼠疫菌作為細菌的代表建立檢測模型。蓖麻毒素(ricintoxin，以下簡稱ricin)是蓖麻籽中含有的一種高毒性的糖蛋白，蓖麻毒素經呼吸道吸入、消化道攝入和肌肉注射均可致人中毒。人經口致死量0.15-0.2g，靜脈注射致死量20mg，小鼠腹腔LD50約為3.Opg/kg。ricin毒性大，性質穩定，來源較廣，提取成本低廉。隨著多個恐怖組織和極端分子研製和使用蓖麻毒素的消息接連進入媒體，這種致命的、毒性極強的生物毒素被美國等國列為最有可能被用做恐怖襲擊的生物恐怖因子。在蓖麻毒素的快速偵檢方面，美國、歐盟等國家一直十分重視，已建立了供實驗室和現場使用的方法如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、化學分析技術、生物傳感器技術以及膠體金免疫層析方法等；我國臺灣地區也建立了檢測蓖麻毒素的ELISA和膠體金免疫層析方法及其配套診斷試劑。建立蓖麻毒素的快速定量試劑具有重要現實意義。同時，本發明選擇ricin作為植物毒素的代表建立檢測模型。金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcalenterotoxinBSEB)是引起食物中毒的主要致病因素，也是重要的生物恐怖戰劑。SEB的檢測研究在平時和戰時都有重要意義。本發明選擇SEB作為細菌毒素的代表建立檢測模型。重症急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV)引起本世紀第一種在全球^暴發的烈性傳染病，SARS引起的恐慌至今人們仍記憶猶新。SARS-CoV為單股正鏈RNA病毒，屬巢狀病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬。根據血清型，冠狀病毒屬主要分為3個型，包括多種哺乳動物冠狀病毒和鳥感染性支氣管炎病毒。雖然2002年爆發的SARS已被成功控制，但由於病毒的變異及其高度的傳染性，SARS存在著再度復發的可能，因此對SARS的研究不容忽視。發明選擇SARS-CoV作為病毒的代表建立檢測模型。懸浮晶片(suspensionarray)也稱液相晶片(1iquidarray,liquidchip),是20世紀70年代美國Luminex公司研製出的新一代生物晶片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。目前，該技術已廣泛應用於免疫分析、核酸研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領域。懸浮晶片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所製作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5jam，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，並根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應。反應後，利用機器自動將反應液吸起並通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設有兩道雷射，一道為紅色，激發微球基質中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道雷射所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統計分析兩道雷射所激發的微球種類與數量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至^:十種病原。懸浮晶片技術由於利用微球在溶液中反應，克服了片膜晶片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用雷射檢測技術，大大提高了樣品檢測的準確性和重複性，具有優於片膜晶片的操作簡便、重複性好等特點。目前發展的懸浮晶片技術應用於病原微生物和毒素的檢測研究主要是基於實驗室檢測方法的建立和方法評價及優化，以縮短4企測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮晶片是否能夠同時檢測多種類病原體，是否適合從粉末、液體等環境樣品中快速直接檢測，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。本發明選擇鼠疫菌、炭疽芽胞桿菌、SEB、ricin、SARS-CoV為代表病原體和生物威脅因子，建立包括細菌、細菌芽月包、病毒、細菌毒素、植物毒素在內的幾種重要生物恐怖因子的多病原體蛋白懸浮晶片的複合檢測方法，評價其敏感性與特異性；並應用於人工汙染的包括如奶粉、麵粉、澱粉、果珍等粉末樣品中的直接檢測，評價其在實際檢測中的適用性。
發明內容本發明提供一種複合檢測不同種類病原體的蛋白質懸浮晶片。本發明還提供一種複合檢測鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌芽孢、葡萄球菌腸毒素B(SEB)、蓖麻毒素(ricin)、重症急性呼吸道綜合症冠狀病毒(SARS-CoV)中的一種或多種病原體或生物恐怖因子的蛋白懸浮晶片-險測方法。本發明提供一種製備上述複合檢測鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞、SEB、ricin、SARS-CoV中的一種或多種病原體或生物恐怖因子的蛋白懸浮晶片的製備方法，包括不同編號的編碼微球、不同病原體的特異性捕獲抗體、生物素標記的不同病原體的特異性檢測抗體、螢光染料鏈親和素—藻紅蛋白(SA-PE)及相關緩沖溶液。本發明還提供一種複合檢測不同種類病原體的蛋白質懸浮晶片檢測方法，其特徵在於，該方法採用雙抗體夾心免疫學檢測才莫式，檢測過程中全部反應可在96孔濾板上進行也可在微量離心管中進行。包括下列步驟(1)每孔加入含已包被目標病原體捕獲抗體的編石馬孩i球工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入檢測樣品，孵育後清洗；(3)加入生物素化目標病原體檢測抗體，孵育後清洗；(4)加入SA-PE,孵育後清洗，(5)加入檢測緩沖液後混勻，(6)用懸浮晶片系統讀取FMI數值(平均螢光強度)並分析數據判定檢測結果。本發明人通過大量和深入的研究，開創性開發出本發明的一種複合檢測不同種類病原體的蛋白質懸浮晶片及其檢測方法，具有以下優點(1)高通量、多種類病原體檢測；(2)蛋白質懸浮晶片製備方法筒單、快速；(3)具有高敏感度和寬動態範圍；(4)對粉末狀環境樣品中目標病原體的檢測具有很好的適用性；(5)具有高特異性；(6)為進一步將所述蛋白懸浮晶片應用於其他細菌、細菌芽孢、細菌毒素、植物毒素、病毒等建立技術模型。圖1:複合檢測方法的特異性測試結果1;X軸表示樣品編號，Y軸表示檢測項目，Z軸表示檢測萸光信號MFI。白色代表鼠疫菌檢測，斜紋代表炭疽芽孢檢測，橫紋代表蓖麻毒素檢測，灰色代表SEB檢測，網點代表SARS-CoV檢測。XI:空白(PB)，X2:ltfcfu/mL鼠疫菌，X3:105cfu/mL炭疽芽孢，X4:50ng/mLSEB,X5:蓖麻毒素100ng/mL，X6:200ng/mLSARS-CoV。為了圖示的視覺平衡，SARS-CoV的表示信號為實測MFI的1/5。圖2:複合檢測方法的特異性測試結果2示意圖；X軸表示樣品編號，Y軸表示檢測項目，Z軸表示檢測螢光信號MFI。系列圖案代表項目見圖注。X1:空白(PB)，X2:ltfcfu/mL炭疽芽孑包+50ng/mLSEB+100ng/mL蓖麻毒素+200ng/mLSARS"CoV,X3:105cfu/mL鼠疫菌+105cfu/ml^疽芽孢50ng/mLSEB+100ng/mL蓖麻毒素，X4:105cfu/mL鼠疫菌+105cfu/mL炭疽芽孢+50ng/mLSEB+200ng/mLSARS"CoV,X5:105cfu/mL鼠疫菌+50ng/mLSEB+100ng/mL蓖麻毒素+200ng/mLSARS-CoV，X6:105cfu/mL鼠疫菌+l5cfu/mL炭疽芽孑包+100ng/mL荒8麻毒素+200ng/mLSARS"CoV。為了圖示的視覺平衡，SARS-CoV的表示信號為實測MFI的1/3。具體實施例方式本發明對涉及的複合檢測鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞、SEB、ricin、SARS-CoV的蛋白質懸浮晶片、其製備方法、4企測方法通過下面的具體實施方式並模擬環境樣品檢測作進一步說明，但本發明不以任何方式受這些具體實施方式的限定。一、材料1.抗原抗體表1蛋白質懸浮晶片多元複合檢測體系中目標分析物所涉及抗原抗體目標分析物捕獲抗體檢測抗體鼠疫菌兔抗鼠疫F1抗原的抗體兔抗鼠疫F1抗原單抗炭疽芽孢羊抗炭疽芽孢兔抗炭疽芽孢SEB鼠抗SEB兔抗SEB蓖麻毒素兔抗蓖麻毒素A鼠抗蓖麻毒素SARS-CoV兔抗SARS-CoVN32兔抗SARS-CoVN132.相關緩衝液(1)0.03MPB緩衝液(pH7.2):2.83gNa2HP04,1.36g〖1^04定容至1L。(2)0.01MPB緩沖液(pH7.2):由0.03MPB緩沖液稀釋而成。(3)PBS緩衝液(pH7.4):NaCl137mmol/L;KC12.7mmol/L;Na2HP04lOmmol/L;KH2P042mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04。用HC1調節溶液的pH值至7.4，加水至1L。分裝後在15psi(1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過濾除菌，保存於室溫o(4)微球清洗液PBS(pH7.4)，0.05%TWEEN-20。(5)微球活化緩衝液IOOmMNaH2PO".3gNaH2P04，5NNaOH1.5mL，定容於250mL，pH6.2。(6)微球包被緩沖液0.05MMES，pH5.0:2.44gMES,5NNaOH0.15mL，定容於250mL。9(7)微球保存液PBS-TBN:PBS，0.1%BSA，0.02%TWEEN，0.05%疊氮化物，pH7.4。(8)孩t球封閉液PBS-BN:PBS，1%BSA，0.05%疊氮化物，pH7.4。(9)檢測緩沖液PBS,1°/。BSA,pH7.4。(10)抗體稀釋液0.01mmol/LPB(pH7.2)。(11)微球稀釋液:PBS，簡A,pH7.4。(12)樣品稀釋液0.01MPB，pH7.2。(13)生物素化抗體稀釋液PBS-TBN(PBS，0.1%BSA，0.02%TWEEN-20,0.05%NaN3,pH7.4)。(14)SA-PE稀釋液PBS(pH7.4),1%BSA。二、待測樣品的製備1.單組分分析樣品的製備鼠疫菌儲備液濃度為108cfu/mL，炭疽芽孢儲備液濃度為107cfu/mL,蓖麻毒素、SEB、SARS-CoVN蛋白的儲備液濃度均為lmg/mL。毒素和蛋白質樣品在臨用前稀釋。菌懸液的濃度範圍為10LlScfu/mL，芽孢的濃度範圍為102-107cfu/mL，毒素和蛋白質的濃度範圍為lOpg/mL-5|ig/mL。待分析的細菌用PB稀釋成IO倍不同梯度，毒素及蛋白質用PB稀釋成4倍不同梯度，其中幾個樣品濃度低於檢測的敏感度，高濃度樣品應使編碼微球的結合位點處於飽和狀態。2.混合樣品的製備混合樣品包含炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB其中的兩種到五種，分別自相應的儲備液用樣品稀釋液稀釋、混合配製。混合樣品包括病原體多重測試的樣品，各種組分含量不同、比例不同，隨4幾組合。3.模擬汙染樣品的製備分別將0.5g奶粉、玉米澱粉、小麥麵粉、速溶果珍等粉末加入到5mL樣品稀釋液(PB緩衝液)中，將不同濃度的炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB的其中一種或幾種，摻入到粉末樣品中，經充分振搖混勻，靜置2h以上，使目標分析物與模擬白色粉末充分吸附。再用脫脂棉、薄濾紙、厚濾紙、0.45pm濾膜濾紙過濾或4氐速離心(1000rpm，lmin)後，上清液作為待檢樣品進行懸浮晶片方法的檢測。104、盲樣的製備抽取製備的單分析物樣品、混合樣品和不同介質中模擬汙染樣品共46份，打亂順序和編號，作為盲樣進行檢測。盲樣包括空白或其它幹擾樣品8份，含測試物的樣品38份，其中樣品處理液中單因子分析物11份，混合樣品13份；模擬汙染樣品14份(含5份混合樣品)。實施例l、蛋白質懸浮晶片的製備A、編碼微球的活4匕選取5種微球分別標記鼠疫菌抗體(028號)、炭疽芽孢抗體(025號)、SEB抗體(043)、蓖麻毒素抗體(027)、SARS-CoVN蛋白抗體(044號)，取100juL(1.25x106個)編碼微球到1.5mL離心管中，14000g離心，小心吸出並棄去上清液。加入100pL的微球清洗緩衝液懸浮，震蕩並超聲後14000g離心，小心吸出並棄去上清液。加入100jaL的孩U求活化緩沖液，接著先加入10iaL新鮮配置的EDC(50mg/mL)，再加入10juL新鮮配置的50mg/mL的羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)，在室溫震搖20分鐘。加入150pL的PBS(pH7.4)，震蕩後，14000g離心，小心吸出並棄去上清液。加入100"的PBS(pH7.4)懸浮編碼微球。B、抗體包被編碼微球分別取各目標檢測物捕獲抗體(如表1所示)各10jag加入到活化後的編碼微球中，用PBS緩沖液定容至500/aL，室溫震搖2小時。14000g離心，小心吸出並棄去上清液。用500|aL的PBS緩沖液洗一次，14000g離心，小心吸出並棄去上清液。加入250|aL的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000g離心，小心吸出並棄去上清液。加入500jaL的孩t球保存液洗滌編碼微球，16000g離心，小心吸出並棄去上清液。最後用150jaL的微球保存液懸浮編碼微球，於4。C避光保存備用。C、包被微球的計數分別取適量微球，稀釋後，用血球計數板(O.10mm;1/400mm"在普通顯微鏡下計數。根據公式(每個大格數x104x稀釋倍數x體積(mL))計算微球數量。D、檢測抗體的生物素化配製濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標記各目標檢測物檢測抗體溶液(如表1所示)，將計算好體積的生物素加入到待標記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽後分裝，-2(TC凍存備用。抗體用量計算過程如下以標記2mg/mL的IgG(分子量150，000)1mL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27ial。_2mgIgG1mmolIgG20mmoSBbtin,..1mlIgGx~-^——x-=0000266mmolBiot，n1mlIgG150,000mgIgG1mmolIgG1000■yl1_0.000266mmolBiotinx~^——^——^~x-=26.6BiotinReagentL10mmol其中，biotin為生物素。實施例2、目標病原體的靈敏度與動態檢測範圍的改進A.待測樣本製備分別將鼠疫菌儲備液(108cfU/mL)和炭疽芽孢儲備液(107cfU/mL)用PBIO倍倍比稀釋為系列濃度梯度樣品，蓖麻毒素、SEB、SARS-CoVN蛋白(儲備液lmg/mL)用PB4倍倍比稀釋為系列濃度梯度樣品。使鼠疫菌懸液的濃度範圍為1(y10ScfU/mL，炭疽芽孢的濃度範圍為102~107cfU/mL，蓖麻毒素、SEB、和SARS-CoVN蛋白質的濃度範圍為1Opg/mL~5pg/mL。B.才羊品的檢測檢測過程全部反應均在96孔濾板上進行，檢測過程如下(l傳孔加入50pL含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌並用真空泵抽濾；(2)加入50pL檢測樣品，混勻後室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌並抽濾；(3)加入50^L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋後的生物素化抗體，混勻後室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌並真空泵抽濾；12(4)加入50pL的SA-PE，混勻後室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌並真空泵抽濾；(5)加入125pL的檢測緩沖液，經振搖重懸混勻；(6)用懸浮晶片系統讀取FMI數值並分析數據。3、目標病原體岸企測靈敏度與檢測範圍的確定蛋白質懸浮晶片檢測方法的最低檢出限(LOD值)為檢測螢光強度臨界值(Cutoff)對應的檢測物濃度。其中，Cutoff的定義是釆用空白對照樣品(Blank)焚光檢測信號MFI均值加3倍標準差(SD)，即Cutoff值為=MFIBlank+3xSD。若檢測結果高於LOD對應螢光強度值則判定為目標檢測物檢測結果陽性；若檢測結果低於LOD對應螢光強度值則判定為目標檢測物檢測結果陰性。最高檢出限為使編碼微球的結合位點處於飽和狀態的檢測物濃度，即隨樣品濃度增加檢測所得MFI值開始進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋後再檢測。因此，根據最低檢出限與最高檢出限可以判定蛋白質懸浮晶片檢測目標病原體的靈敏度與動態檢測範圍，檢測結果如表3所示。表3蛋白質懸浮晶片方法檢測五種病原體的靈敏度分析物最低檢出限-險測範圍鼠疫67.5cfu/mL67.5-108cfu/mL炭疽芽孢4210cfu/mL4210-107cfu/mLSEB0.203ng/mL0.203-100852.Ing/mL蓖麻毒素29.Ing/mL29.1-1653.4ng/mLSARS-CoV4.86ng/mL4.86-25600ng/mL結論，本發明所述的蛋白質懸浮晶片對上述五種病原體的檢測靈敏度和檢測範圍相對於ELISA方法有顯著改進。實施例3、複合檢測目標病原體的特異性測試在懸浮晶片多重檢測方法特異性實驗中，選用與目標待測菌近緣的或環境常見的假結核菌、臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、覃狀芽孢桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、陰溝腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌等菌抹，以及BONT、fflVP24蛋白、BSA、酪蛋白、胰蛋白腖、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等13毒素、病毒和蛋白質，考核所述的蛋白質懸浮晶片方法對樣品檢測的特異性。捕獲抗體工作液為五種編碼微球按工作濃度混合均勻的混合物；陽性檢測樣品分別為鼠疫菌1.6xl04cfU/mL、炭疽芽孢1.36xl04cfWmL、SEB75ng/mL、蓖麻毒素75ng/mL、SARS-CoVN蛋白256ng/mL。生物素化檢測抗體分別為①生物素化抗體稀釋液(blank),②Biotin-兔抗F1Ag2F6/1:1000稀釋，③Biotin-羊抗BA+170044/1:200稀釋，Biotin-RCA2/l:200稀釋，⑤Biotin-SEBpAb/1:200稀釋，⑥Biotin國兔抗SARS-COVN蛋白/1:200稀釋。表4蛋白質懸浮晶片方法對不同菌和蛋白質的測試結果tableseeoriginaldocumentpage1424胰蛋白腖通過特異性測試(檢測方法同實施例2),結果顯示(如表4所示)，在檢測鼠疫菌、炭疽芽孢、SEB、蓖麻毒素、SARS-CoV的系統中，假結核耶爾森菌、蠟樣芽胞桿菌及其芽孢、覃狀芽孢桿菌及其芽孢、枯草芽孢桿菌及其芽孢、巨大芽孢桿菌及其芽孢、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門菌、陰溝腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、禽流感病毒HA、禽流感病毒NH、AIDS病毒、酪蛋白、BSA、BONT、胰蛋白腖等MFI值與空白對照的MFI值均低於最低檢出限對應MFI值，說明以上細菌、病毒、毒素及其它蛋白質均不與目標4企測物發生交叉反應或非特異性反應。實驗僅發現檢測SEB時，與高濃度的金黃色葡萄球菌中毒性休克毒素(SEF或TSST-1)略有交叉反應，但與其他病原體沒有交叉反應和非特異性反應。圖1實驗結果顯示，在多重衝企測體系中，加入目標分析物所對應的微球檢測信號明顯增高，其它微球螢光檢測信號沒有顯著增強，或者相對於自身的本底螢光信號而言沒有明顯增高。圖2實驗結果顯示，在多重檢測體系中，加入多種目標分析物所對應的相應微球檢測信號均明顯增高，未加入目標分析物對應微球螢光4企測信號沒有顯著增強，或者相對於自身的本底螢光信號而言沒有明顯增高，說明捕獲抗體、檢測抗體與目標檢測物特異性結合，捕獲抗體、檢測抗體與非目標檢測物之間不存在非特異性結合、無交叉反應。綜上特異性測試，證明各捕獲抗體與其它檢測抗體、各捕獲抗體與其它檢測物、各檢測抗體與其它檢測物之間均不存在交叉反應，檢測具有很好的特異性。實施例4、"白色粉末"盲樣的檢測A.模擬汙染"白色粉末"樣品的製備分別將0.5g奶粉、玉米澱粉、小麥麵粉、速溶果珍等粉末加入到5mL樣品稀釋液(PB緩沖液)中，將不同濃度的炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB的其中一種或幾種及空白樣品(樣品稀釋液)，摻入到粉末樣品中，經充分振搖恩勻，靜置2h以上，使目標分析物與模15擬白色粉末充分吸附。B.盲樣的製備抽取製備的單分析物樣品、混合樣品和不同介質中模擬汙染樣品共46份，打亂順序和編號，作為盲樣進行檢測。盲樣包括空白或其它幹擾樣品8份，含測試物的樣品38份，其中樣品處理液中單因子分析物11份，混合樣品13份；模擬汙染樣品14份(含5份混合樣品)。C.盲樣的處理與檢測將待測樣品按0.1g/mL溶解粉末樣品，再用脫脂棉、薄濾紙、厚濾紙、0.45nm濾膜濾紙過濾或低速離心(1000rpm，lmin)後，上清液作為待檢樣品按照實施例2中方法進行懸浮晶片方法的檢測。表5蛋白質懸浮晶片盲樣檢測結果編號盲樣樣本檢測結果鼠疫炭疽芽孢SEB蓖麻毒素SARS-CoV1BSA4mg/mL-----2奶粉添加SARS-CoVN蛋白320ng/mL----3炭疽芽孢1.36xl06dWmL-+--一4SEB25ng/mL--+-麵粉添加SARS-CoVN蛋白320ng/mL----+6鼠疫菌1.36xl04cfti/mL+----速溶果珍添加鼠疫1.6xlScfU/mL+炭疽芽孢1.36xl05cfWmL+SEB150ng/mL+荒麻毒素100ng/mL+SARS-CoVN蛋白256ng/mL+++++8SARS-CoVN蛋白256ng/mL---—+9澱粉添加鼠疫1.6xlScfti/mL+炭疽芽孢1.36xl05cfWmL+SEB150ng/mL+荒麻毒素100ng/mL+SARS-CoVN蛋白256ng/mL+++++10SEB75ng/mL--+-一11PBS-----12蓖麻毒素75ng/mL---+-13鼠疫1.6xl(^cfli/mL+炭疽芽孢2.18xl6cfti/mL+荒麻毒素75ng/mL+SARS-CoVN蛋白256ng/mL++-++16tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18*+:陽'性，-:陰'性檢測結果如表5所示，46個盲樣中的結果全部正確，充分證明了本發明所提供的蛋白質懸浮晶片多元目標檢測物的複合檢測方法可以快速、準確、高效檢測出吸附於白色粉末樣品中的目標檢測物，本方法對於炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB等病原體汙染的"白色粉末"樣品的實際檢測工作具有很好的適用性。權利要求1、一種利用微球懸浮晶片複合檢測炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB多種類病原體中的一種或多種的檢測方法，其特徵在於，檢測過程中全部反應可在96孔濾板或者微量離心管中進行，該方法包括下列步驟(1)向孔加入含已包被捕獲抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入待測樣品，孵育後清洗；(3)加入用生物素化的檢測抗體，孵育後清洗；(4)加入SA-PE，孵育後清洗；(5)加入檢測緩衝液後混勻；(6)用懸浮晶片系統讀取平均螢光強度(FMI)數值並分析數據判定檢測結果。2、如權利要求l所述的方法，其特徵在於用於包被微球的捕獲抗體分別為鼠疫菌的捕獲抗體為抗鼠疫菌抗體；炭疽芽孢的捕獲抗體一抗炭疽芽孢抗體；SEB的捕獲抗體為抗SEB抗體抗；蓖麻毒素的捕獲抗體為抗蓖麻毒素A抗體；SARS-CoVN蛋白的捕獲抗體為抗SARS-CoVN32抗體。3、如權利要求l所述的方法，其特徵在於採用生物素標記的檢測抗體分別為鼠疫菌的檢測抗體為抗鼠疫菌抗體；炭疽芽孢的檢測抗體為兔抗炭疽芽孢抗體；SEB的檢測抗體為抗SEB抗體；蓖麻毒素的檢測抗體為抗蓖麻毒素抗體；SARS-CoV的檢測抗體為抗SARS-CoVN13抗體。4、如權利要求l所述的方法，其特徵在於捕獲抗體與生物素標記的檢測抗體組成雙抗夾心檢測體系進行病原體4企測。5、如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述的包被微球的捕獲抗體用量為10pg/1.25x106個編碼微球或20-40ng/250O5000個微球/測試。6、如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法中的標記檢測抗體的生物素為羧基活性的生物素。7、如權利要求1所述的方法，其特徵在於，2mg/mL生物素化的檢測抗體工作液稀釋倍數為1:50-1:5000稀釋。8、一種複合檢測炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB多種類病原體中的一種或多種的蛋白質微球懸浮晶片，其特徵在於包括編碼微球、包被的捕獲抗體、生物素標記的編碼微球、鏈親和素-藻紅蛋白；用於包被微球的捕獲抗體分別為鼠疫菌的捕獲抗體為兔抗鼠疫F1抗原抗體；炭疽芽孢的捕獲抗體一羊抗炭疽芽孢抗體；SEB的捕獲抗體為兔抗SEB單抗；蓖麻毒素的捕獲抗體為兔抗蓖麻毒素A抗體；SARS-CoVN蛋白的捕獲抗體為兔抗SARS-CoVN32抗體。9、權利要求8的蛋白質微球懸浮晶片，其特徵在於用生物素標記的檢測抗體分別為鼠疫菌的檢測抗體為兔抗鼠疫F1抗原單抗2F6;炭疽芽孢的檢測抗體為兔抗炭疽芽孢抗體；SEB的檢測抗體為兔抗SEB多抗；蓖麻毒素的檢測抗體為蓖麻毒素單抗RCA;SARS-CoV的檢測抗體為SARS-CoVN13抗體。全文摘要本發明涉及一種複合檢測多種類病原體的蛋白質懸浮晶片製備及其檢測方法，所述的病原體包括鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)、炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)、葡萄球菌腸毒素B(staphylococcalenterotoxinB，SEB)、蓖麻毒素(ricin)和重症急性呼吸道綜合症冠狀病毒(SARS-CoV)。通過大量試驗證明蛋白質懸浮晶片製備方法簡便、快捷；檢測效果快速、準確、靈敏度高、檢測範圍寬、特異性強；對於實際環境樣品適用性好。同時本發明為建立多功能、多指標、高通量、標準化的病原體複合檢測要求奠定了基礎。文檔編號G01N21/76GK101498733SQ200910080258公開日2009年8月5日申請日期2009年3月17日優先權日2009年3月17日發明者孫肖紅,張曉龍,宇楊,楊瑞馥,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學研究院