一種cyp2c19基因多態性檢測試劑盒及其檢測方法

2023-07-13 05:11:41

專利名稱：一種cyp2c19基因多態性檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種CYP2C19基因多態性檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
細胞色素P450 (CYP)酶系在藥物代謝中佔有極其重要地位。CYP2C19 (S-美芬妥英羥化酶)是CYP酶系中佔主導地位的酶之一，其遺傳多態性影響著許多臨床藥物的代謝，其活性存在明顯的個體差異，對不同個體的藥物治療作用和不良反應及藥物的毒性產生重要影響。FDA已將17種藥物列入醫生需要參考病人的CYP2C19的基因多態性信息用藥。臨床上CYP2C19基因多態性檢測可以為個體化用藥提供依據。目前，國內外已有多個CYP2C19基因型檢測試劑盒，其主導方法為DNA微陣列晶片法。基因晶片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定於矽片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類晶片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。DNA晶片:由於高通量等優點在SNP檢測中得到大量應用，依靠野生型與突變型基因雜交動力學的差異對突變位點進行檢測。其優點是I)高通量並行檢測；2)操作簡便快速:整個檢測只需4-8小時基本可以出結果。但也存在如下缺點:1)不同SNP位點之間的雜交動力學差異不同，在進行多位點同時檢測時條件難以控制；2)技術成本昂貴、複雜:每個樣品需要一個晶片，成本大於Y1000/樣品，不利於大規模推廣；探針的合成與固定比較複雜，特別是製作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3)重複性差，準確性低，易出現假陽性、假陰性結果；4)靈敏度較低:晶片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由於引物較多，容易自身產生二聚體，髮夾結構，或由於Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；5)由於晶片的種類較多，難以制定一個統一的質量控制標準。Gen0meLabTMGeXP多重基因表達遺傳分析系統基於貝克曼公司成熟的毛細管電泳分離技術及高靈敏度的雷射誘導螢光技術研發而成，一束8道的毛細管陳列設計充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費和複雜性。採用多重PCR方法，通過Beckman Coulter染色標記,在同一個EP管中同時分析多個基因的的等位基因型,能快速有效地檢測基因的表達狀況，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下優點:1、高通量:本系統採用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測30-40個位點，可同時做192個反應(如192個患者樣品，每個樣品檢測30種腹瀉病毒，30個位點)，一天出結果；對於交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。2、準確性強=GeXP系統採用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；3、敏感性高，結果重複性好:GeXP系統克服了傳統PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目 的基因進行定量的速度和敏感性，採用雷射誘導螢光-PMT，具有超聞靈敏度；
4、方法簡便，使用經濟=GeXP提供從試劑、多重PCR引物設計、結果及定量表達譜分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少於￥50，利於大規模推廣；5、精確定量、靈活性強:可精確定量病原體基因拷貝數，可隨時根據需求調整檢測的靶基因。6、易於實現自動化:就樣品製備而言，Biomek系列自動液體處理儀可以與GeXP分析儀和Ampligrid擴增儀完全匹配，集成的條形碼閱讀器保證了準確的樣品追蹤和結果報目前，國內外還沒有關於基於GeXP多重基因表達遺傳分析系統的CYP2C19基因多態性檢測試劑盒及其檢測方法的相關研究報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果的基於GeXP多重基因表達遺傳分析系統的CYP2C19基因多態性檢測試劑盒及其檢測方法。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為:一種CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，包括超純水、X溶液、10XPCR緩衝液，PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，其特徵在於所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其基因序列如下表I所示:表I
權利要求
1.一種CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，包括超純水、X溶液、IOXPCR緩衝液，PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，其特徵在於所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其基因序列如下表所示:
2.根據權利要求1所述的一種CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，其特徵在於:包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增弓I物序列為AGGTGACACTATAGAATA ；反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增弓I物帶螢光標記。
3.根據權利要求1所述的一種CYP2C19基因多態性檢測試劑盒，其特徵在於:所述的陽性對照品為克隆到載體PMD18-T上的7個DNA片段和I個質粒pcDNA3.1 (+)，所述的7個DNA片段分別為包含有SNP位點上rs4244285的G型基因和A型基因、rs4986893的G型基因和A型基因、rsl2248560的C型基因和T型基因及人類基因beta-globin的片段。
4.一種利用權利要求1-3中任一項所述的CYP2C19基因多態性檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於具體包括以下步驟: (1)DNA樣品的收集和提取 將刮取到口腔上皮細胞的口腔拭子放入300y L DNA裂解緩衝液中，在恆溫混勻儀中於95° C，IOOOrpm的條件下，處理5分鐘後取出，室溫放置至冷卻，然後在樣品中加入30 y L提取緩衝液，混勻，12000g離心5分鐘，得到的上清液即為PCR的DNA樣品模板； (2)以提取的核酸為模板進行PCR反應 取DNA樣品9.3 ii L，10 X PCR緩衝液2 y L，25mM的氯化鎂4 y L，PCR弓丨物溶液2 y L，DNA聚合酶0.7 ii L，X溶液2 ii L混勻後加入到96孔樣品板上進行PCR反應，反應條件:94° Cl分鐘；94° C30秒鐘，60° C30秒鐘，70° Cl分鐘，循環35次；70° Cl分鐘；4° C直至收取PCR產物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶螢光標記，PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM ;所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其基因序列如序列表中SEQ IDN0.1 N0.13 所示； (4)GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品 取PCR產物0.1-1 u L，，GeXP遺傳分析儀配套的上樣緩衝液30 u L，DNA標準品0.2 y L，礦物油一滴混合均勻後加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品，將GeXP遺傳分析儀的軟體獲得的圖譜與標準圖譜對比，獲得CYP2C19基因的SNP位點的等位基因型。
全文摘要
本發明公開了一種CYP2C19基因多態性檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括超純水、X溶液、10×PCR緩衝液，PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，特點是PCR引物包括CYP2C19基因上的3個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其基因序列如SEQ IDNO.1～NO.13所示，其檢測包括採集樣本並提取核酸的步驟；以患者核酸為模板進行PCR反應的步驟；最後GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品的步驟，優點是特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果。
文檔編號C12Q1/68GK103074434SQ20131003321
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者南麗, 孫婷婷, 吳勇 申請人:海爾施生物醫藥股份有限公司