在培養物中複製流感病毒的方法

2023-07-13 16:39:06 2

專利名稱：在培養物中複製流感病毒的方法
在培養物中複製流感病毒的方法本申請是申請日為2007年12月14日，申請號為200780051376. 3的、發明名稱和本發明相同的發明專利申請的分案申請。相關申請的交叉引用本申請要求2006年12月15日申請的美國申請60/875287和2006年12月28日申請的美國申請60/882412的優先權，二者均納入本文作為參考。
背景技術：
人們已認識流感流行和大流行達數個世紀，並且它已經導致了相當多的生命喪失。流感病毒是一種分段的含有RNA的病毒，屬於正黏病毒科。流行和大流行是由具有在人群中很少有免疫性的新包膜成分的病毒引起的。這些新成分通常為人類和動物流感病毒突變和/或混合的結果。然而，流感病毒的衣殼為略微多晶的，其外表面與所有病毒一致，由脂質包膜組成，從脂質包膜上伸出兩種突出的糖蛋白棘血細胞凝集素(HA或H)和神經氨酸酶(NA或N)。有三種類型的流感病毒A、B和C型。僅A型流感病毒基於兩種主要的表面糖蛋白HA和NA進一步分類為亞型。A型流感亞型根據病毒株進一步分類。B型流感病毒僅感染哺乳動物並在人中致病，但一般不如A型嚴重。C型流感病毒也僅僅感染哺乳動物，但僅在兒童引起非常輕的呼吸道疾病。它們在遺傳學上和形態學上與A和B型不同。A型流感病毒感染很多種動物，包括哺乳動物，如，人、馬、狗、豬、白鼬、鳥類，如鴨、雞和火雞。有16種已知HA血清型和9種已知NA血清型。鳥類為特別重要的儲存庫，其生成遺傳學上/抗原學上不同的病毒的庫，所述病毒通過人和動物之間的近距離接觸轉移到人群中。豬可感染人類和鳥類流感株。因為這種不尋常的特徵，當同一細胞感染兩種類型的病毒時，豬被認為是允許鳥類和人類病毒之間基因交換的「混合容器」。流感病毒基因組由分成8段的單鏈(_)有義RNA組成(C型流感為7段)。因為已經作出了大量遺傳學研究(傳統和分子)基因組結構是詳知的。每段編碼一種或兩種病毒蛋白。人們相信流行和大流行是因為流感病毒HA和NA蛋白的兩種不同的方式的遺傳改變而引起抗原漂移和抗原轉變。抗原漂移經常發生，而抗原轉變僅僅偶爾發生。A型流感病毒進行兩種變化，B型流感病毒僅通過更漸進性的過程抗原漂移而變化。抗原漂移是指通過兩個基因中的點突變發生的小而漸進的變化，所述兩個基因包含產生主要表面蛋白HA和NA的遺傳物質。抗原轉變是指在人中產生目前不在人群中流行的新的A型流感病毒亞型的突然而大的變化。抗原轉變可通過動物(家禽)與人的直接傳播發生，或通過A型人流感和A型動物流感病毒基因混合而通過被稱為遺傳重配的過程產生新的A型人流感病毒亞型。抗原轉變產生新的A型人流感亞型。當兩種不同的流感病毒感染相同細胞並平分或交換一個或多個RNA片段時發生遺傳重配。例如，如果轉移的片段是HA，則可導致新的病毒株出現，所述病毒株在抗原上為新型，並且進入人群時具有很少或沒有免疫性。這個結果可導致流行和/或大流行。流感病毒進入細胞能通過HA棘與含有N-乙醯神經氨酸(NANA =唾液酸)端基的粘蛋白結合而變容易。結合後，顆粒通過內吞作用經包被的凹陷捲入形成內吞囊泡，最後形成核內體。這些被細胞酸化並且在約pH 5. O下，HA單體在核內體中被類胰蛋白酶裂解以激活它們內化。一旦內化，則發生病毒複製並產生流感症狀。人們對最近的流感爆發相當關注。業已在狗中鑑別出因犬流感病毒(CIV)所致的一種嚴重呼吸道疾病。這種呼吸道疾病已被證實有高度傳染性。而且，CIV可引起100%的感染率和80%的發病率，以及在嚴重感染中高達5-8%的死亡率。自從2004年在靈提賽犬中首次檢出(Crawford等人,Science 310(5747) :482-485 (2005)), CIV已經很快蔓延至全美國，其中至少25個州報導CIV爆發，並且二十七個州報導CIV血清陽性。引起最近爆發的CIV血清型是H3N8。這種CIV血清型最初在馬中發現，認為它是越過種屬障礙進入犬類。可能抗犬流感病毒有效疫苗的缺乏在這種 病毒在狗中快速而廣泛的傳播中起重要作用。A型流感(H5N1，禽流感)病毒也稱為「H5N1病毒」是一種A型流感病毒亞型，主要在鳥類中發生，在鳥類中有高度傳染性，對鳥類可致死。H5N1病毒不經常感染人類，但這些病毒感染在人類中發生過。迄今為止，已在10個國家(主要在亞洲)報導了超過200例的人類確診病例，這些病例導致了 150餘人死亡。幸運的是，這種病毒還不容易從鳥類傳播至人類或在人類之間互相傳播。然而，這有可能發生，導致流行或大流行。防止與流行或大流行相關的發病率和致死率的最佳策略是疫苗接種。目前給予人類的流感疫苗在預防住院治療和死亡方面有很高的性價比，然而，季節性疫苗的世界年產量有限，並且不能實際地覆蓋全球高風險人群。現有疫苗是用自世界衛生組織(WHO)或疾病控制中心(⑶C)獲得的病毒在蛋中製成，WHO和⑶C每年為疫苗生產提供病毒種子。流行病毒的HA變化(抗原漂移)需要在流感兩次爆發期間周期性置換疫苗株。WHO發表了包括南半球和北半球所包括的半年推薦株。為允許有足夠的時間生產，WHO在二月測定哪個疫苗株應包括在下個冬天的疫苗內。一般來說，成人一個劑量含有45 u g HA(15ii g每種，3種病毒)的等同物。這個劑量大約為從為一個感染的含胚雞蛋的尿囊液中得到的純化的病毒的量。如果製備I億劑量的滅活的流感病毒疫苗，製造商必須獲得I億個含胚雞蛋。這使得疫苗生產依賴於高質量含胚雞蛋的時閘可行性和WH0/CDC提供的種子株。大部分原型種子株甚至在含胚雞蛋中也不容易生長至高效價。要克服這個困難問題，政府機關首先要通過與高產率的實驗室株A/PR/8/34經典重配(以6 2重配從A/PR/8/34株中得到6個片段)創造出高產率的實驗室株。遺憾的是，這個方法可能很難做至IJ，並且可能影響所得到的疫苗的抗原性。因此，需要提供生產疫苗的替代方法以預防由流感、特別是高度致病株如H5N1引起的臨床疾病。還有，仍然需要提供在快得足以有效預防可能的流行和/或大流行的時間內生產大量救生流感疫苗的方法。本發明解決這些和其他需求。本文所引用的任何參考不應被理解為允許這種參考作為本申請的「現有技術」。發明簡述本發明涉及預防A型和B型流感感染的疫苗。相對於現有技術的疫苗和方法，本發明的疫苗和相關方法提供大量優點。例如，本發明的疫苗用組織培養細胞代替含胚雞蛋生產。所述創造性生產方法通過省略傳統疫苗生產步驟而節約了關鍵時間。另外，本發明的疫苗可用於那些對蛋物質過敏者。本發明還提供可在疫苗中應用的新型免疫原性組合物。這些新型免疫原性組合物可用於免疫動物，包括鳥類，以抵抗流感。在本法明的具體實施方式
中，疫苗接受者為哺乳動物。在一個方面，本發明提供保護犬類抵抗犬流感病毒(CIV)所致的犬呼吸道疾病的疫苗。在另一方面，本發明提供保護人類抵抗通過遺傳重配自然產生的流感病毒株的疫苗。本發明提供流感病毒分離物，其特別適於在組織培養細胞中生長。在一個具體實施方式
中，改造的流感病毒分離物根據其在所選擇的組織培養細胞系中生長的能力，用有限稀釋克隆(limit dilution cloning)選擇。在一個具體實施方式
中，通過將包含大量流感亞群的一些流感病毒通過系列稀釋為大量等分試樣，來選擇適於在培養細胞系中生長的流感病毒亞群。然後大量等分試樣與培養的細胞系接觸，和/或在培養的細胞系中生長。大量流感病毒亞群中的一個流感病毒亞群經檢測被鑑別為以低感染複數(MOI)在培養細胞中生長的流感病毒亞群，並被選為適於在培養細胞系中生長的流感病毒亞群。在相關實施方式中，本發明提供如下方法，其包括使所述適於組織培養的分離物 與組織培養細胞接觸，使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間。此方法也可包括收穫流感病毒。在一些這樣的實施方式中，所述有限稀釋克隆方法包括系列稀釋流感病毒分離物，並使每種稀釋物與培養細胞接觸，使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間，從致CPE的最高倍稀釋物中收穫病毒，並用收穫的病毒重複所述方法。在一些實施方式中，所述方法也包括使所述流感病毒分離物與有效量的胰蛋白酶混合，然後與所述培養細胞接觸。在一些實施方式中，孵育所述混合物一段足以允許胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細胞從基底脫離的時間。用於裂解病毒蛋白的胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。在某些情況下，使適於組織培養的分離物與組織培養細胞接觸的步驟在感染複數(MOI)小於約0.01，包括小於約0. 001和/或小於約0. 0001的情況下進行。在其他情況下，所述流感病毒分離物首先在組織培養細胞中檢測，以測定最適M0I。所述組織培養細胞可為哺乳動物胚胎腎細胞，如，人胚胎腎細胞。所述流感病毒可為A、B和C型流感病毒。在一個具體實施方式
中，所述流感A病毒為H5N1株。所述流感病毒分離物可從任何來源得到，包括如鼻拭子、肺組織，和/或可由第三方提供，如WHO。在一些實施方式中，所述流感病毒分離物起初在含胚雞蛋中生長，以得到大量適於組織培養的接種物。一些方法包括純化所收穫的病毒。在一個這樣的方法中，所述純化步驟用尺寸排阻層析進行。本發明的方法也可包括在純化之前、之中或之後將流感病毒第二分離物與第一分離物混合，這種第二分離物是與第一分離物不同的株。在一些方法中，劑量效價研究在混合兩種病毒分離物之前進行以測定病毒蛋白具有相等免疫原性的混合物。在一些實施方式中，流感被滅活。在這種類型的一些實施方式中，流感病毒用能有效滅活病毒的量的二乙烯亞胺(binary ethyleneimine)處理。在一些方法中，當血細胞凝集素蛋白含量最高時進行收穫。其他實施方式包括通過收穫由以下方法製備的病毒分離物來製備的疫苗選擇在組織培養細胞中生長的流感病毒，其通過用有限稀釋克隆滴定流感病毒分離物以便選擇適應於組織培養細胞的流感病毒分離物。在一些實施方式中，所述病毒通過絨膜尿囊(也稱為尿囊腔)或羊膜接種途徑，由特異性無病原含胚雞蛋接種製備，然後進行有限稀釋克隆。在一個實施方式中，所述流感病毒首先通過含胚雞蛋的羊膜接種複製以得到適於組織培養細胞的接種物。另外，本發明提供選擇在人胚胎腎細胞生長的流感病毒的方法。在一個這樣的方法中，流感病毒分離物用有限稀釋克隆滴定以便選擇適於ffiK細胞的流感病毒分離物。這種方法可包括適於HEK的分離物與HEK細胞接觸，以及使所述細胞生長一段足以產生致細胞病變效應(CPE)的時間。在這種類型的具體實施方式
中，收穫所得到的流感病毒。本發明也提供疫苗，所述疫苗包括通過這些方法得到的流感病毒分離物。所述方法也包括使所述流感病毒分離物與有效量的IX型胰蛋白酶混合，然後與所述培養細胞接觸一段足以使胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細胞脫離基底的時間。在一個實施方式中，使適於HEK的分離物與HEK細胞接觸的步驟在MOI小於約0. 001的條件下進行。在一些實施方式中，本發明進一步提供疫苗，所述 疫苗包括以每劑量小於4iig人流感HA配製的人流感病毒。在一個相關的實施方式中，本發明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小於3 yg人流感HA配製的人流感病毒。在另一個實施方式中，本發明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小於2 u g人流感HA配製的人流感病毒。在又一個實施方式中，本發明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量I. 5-3. 5 u g人流感HA配製的人流感病毒。在具體的疫苗實施方式中，佐劑為ISC0M。在其他疫苗實施方式中，至少70%的病毒包括具有相同胺基酸序列的HA。在另外的實施方式中，至少80%的病毒包括具有相同胺基酸序列的HA。在另外的實施方式中，至少90%的病毒包括具有相同胺基酸序列的HA。在另外的實施方式中，多於95 %的病毒包括具有相同胺基酸序列的HA。本發明還提供組合疫苗，以產生保護性免疫來抵抗流感病毒，如犬流感病毒(CIV)和其他疾病，如其他犬類傳染病。本發明還提供免疫哺乳動物例如，狗、貓或馬抵抗流感的方法。也提供製備和使用傳染病(如犬類傳染病)的疫苗的方法。在一個具體實施方式
中，本發明的免疫原性組合物包括含有滅活CIVH3N8和佐劑的免疫原性組合物。所述佐劑通常包含水包油乳液。在一個這樣的實施方式中，所述佐劑還包含氫氧化鋁。在這種類型的一個具體實施方式
中，所述佐劑是Emunade .在另一個實施方式中，所述免疫原性組合物是疫苗。疫苗組合物可包括每劑量約100血細胞凝集單位(HAU)至1500HAU。這可根據接受治療的個體大小和其他健康因素而變化。所述組合物通常在每劑量250和750HAU之間。在一個實施方式中，所述疫苗組合物包括每劑量約500HAU。本發明的疫苗可任選包括藥學上可接受的免疫刺激劑，如細胞固子；生長因子；趨化因子；來自淋巴細胞、單核細胞或來自淋巴器官的細胞的細胞培養物的上清液；植物、細菌或寄生蟲的細胞製劑和/或提取液；或促細胞分裂劑。本發明的疫苗可通過如下途徑給藥胃腸外給藥、肌肉注射、皮下注射、腹膜注射、皮內注射、口服、鼻內給藥、劃痕及上述的組合。在本發明的優選實施方式中，疫苗通過肌肉注射給藥。本發明還提供含有與CIV H3N8結合的抗體的來自接種動物的血清，以及純化抗體本身。在本發明的一個具體實施方式
中，與CIV H3N8結合的純化抗體是嵌合抗體。本發明還提供組合疫苗，所述組合疫苗包括一種或多種滅活CIV株(如CIV H3N8)與一種或多種包括下列的其他犬病原體和/或免疫原相組合，如對以下產生免疫的免疫原犬瘟病毒；犬腺病毒；犬腺病毒2型；犬細小病毒；犬副流感病毒；犬冠狀病毒；犬流感病毒；和/或鉤端螺旋體(Leptospira)血清型,如感冒傷寒型kirschneri血清型鉤端螺旋體(Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa)、犬型問號血清型鉤端螺旋體(Leptospira interrogans serovar canicola)、出血性黃痕問號鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans icterohaemorrhagiae)和/或波蒙納問號血清型鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans serovar pomona)。可加入本發明的聯合疫苗的其他犬病原體包括支氣管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica);利什曼(Leishmania)生物，如成人利什曼蟲(Leishmania major)和嬰兒利什曼蟲(Leishmania infantum);包柔氏螺旋體(Borrelia)屬螺旋體，包括狹義上的(Ss)博氏疏螺旋體(B. burgdorferi)、博氏疏螺旋體ss、博氏疏螺旋體加利尼(B.garinii)和博氏疏螺旋體阿滋利(B. afzelii);支原體屬(如犬支原體)；狂犬病病毒和犬艾希體(Ehrlichia canis)。
本發明提供在培養細胞中生長CIV H3N8的方法。在一些實施方式中，所述培養細胞是非犬的哺乳動物腎細胞。在一個實施方式中，所述細胞為馬-達氏(Madin-Darby)牛腎(MDBK)細胞。在另一個實施方式中，所述細胞為Veix)細胞。在一些實施方式中，本發明還提供包含以小於每劑量500HAU配製的CIV H3N8的疫苗。在這些實施方式中，佐劑通常為氫氧化鋁，並且至少70 %，通常至少90 %的HA具有相同胺基酸序列。在其他疫苗實施方式中，至少80%的病毒包含具有相同胺基酸序列的HA。在另外的疫苗實施方式中，多於95%的病毒包含具有相同胺基酸序列的HA。本發明的這些和其他方面將通過參考以下附圖和實施方式得到更好的理解。


圖I顯示CIV感染狗之後的平均臨床評分。用CIV感染非接種對照和接種的狗，並從感染後-2天至10天每日監測臨床徵象，如眼和鼻排出物、噴嚏、咳嗽、抑鬱和呼吸困難。所述臨床徵象根據實施例I所述的指南評分，並將每個處理組的臨床評分對天數作圖。圖2證明感染後狗的鼻CIV釋出。用CIV感染非接種對照和接種狗。在感染前一天(-1天)收集鼻拭子以證實狗沒有感染CIV。通過每天收集鼻拭子10天(感染後I天至10天)在感染狗中監測鼻病毒釋出，並在單層MDCK上進行滴定。每個處理組的平均病毒效價以Log1 JCID5tlAiL表示，計算並對感染後天數作圖。發明詳述生產流感疫苗的傳統方法包括在含胚母雞蛋中分離株的生長，這至少部分是因為雞蛋廉價且有效，並且因為沒有大量生長流感的明顯替代選擇。在人流感的情況下這尤其確切，因為很多可用於繁殖流感病毒的細胞系還沒有經FDA認證用於人類疫苗生產，並且在組織培養中僅得到了很低的效價。當疫苗在雞蛋中生產時，一般如下製備。最初，從咽拭子或相似的來源回收病毒，在雞蛋中分離。最初在雞蛋中的分離很困難，但病毒適應雞蛋宿主並且其後在雞蛋中的繁殖相對較容易。在雞蛋中生長後，純化病毒，並用福馬林或￠-丙內酯滅活。生長跡象表明雞蛋不是最適於病毒繁殖的。例如，用於基於雞蛋的生產的常規產蛋雞群具有使病毒製劑受到在這些裝置中常見的內生病毒汙染的較高風險。而且，成千上萬的雞蛋的分離接種和收集以及複雜的下遊加工步驟導致大量時機能將環境汙染物引入病毒製劑，這很有可能是2004年某次疫苗召回的原因。如前所述，很難完全移除雞蛋物質，而這可能導致對疫苗的敏感性。此外，所述加工完全缺乏在需要突然增加時的靈活性，這是因為沒有大量適合的雞蛋可用而造成的物流問題。也有證據表明在雞蛋中生長可降低病毒的抗原性。一致的，在雞蛋中生長A或B型流感病毒會生成具有HA突變譜的異源病毒產物。相反，在哺乳動物宿主細胞中相應生長的病毒則生成結構與最初分離的那些相同的流感病毒(Rocha，等人，J. Gen. Virol 1993 ；74 =2513-2518)。而且，在哺乳動物細胞中生長的流感病毒更容易得到在人血清中中和並且HA抑制的抗體，且抗體效價高於雞蛋中生長的對照(Oxford，等人，Bull WHO 1987 ；65 :181-187)。遺憾的是，所有流感病毒株看來均在雞蛋中生長，而迄今很多流感病毒株在組織培養細胞中生長不佳，且其中在組織培養細胞中生長的那些經常不能以產生有效疫苗所需的量生長。本發明人現在公開了當用有限稀釋克隆(limiting dilution cloning)使病毒在組織培養細胞中生長時，可產生適於組織培養的分離物。令人驚奇的是，本發明人發現在組織培養細胞(如，Vero細胞)中繁殖時，由通過含胚雞 蛋的羊膜接種得到的病毒的複製能產生可以複製並產生高水平HA的病毒群。所得到的病毒分離物產生的HA效價幾乎與用含胚雞蛋得到的效價相等，而HA效價為疫苗效力的一個重要量度。因此，本發明的一個重要方面涉及生產適於組織培養和適用於流感疫苗(尤其是哺乳動物疫苗)生產的流感病毒分離物的方法。所述方法涉及使用有限稀釋克隆來分離和鑑定適於組織培養的病毒。所得到的分離物可經處理以生產疫苗。因此，本發明也涉及生產改進的流感病毒疫苗的方法。為此，本發明提供選擇適於組織培養的流感病毒的方法，該方法通過用有限稀釋克隆滴定病毒並重複該過程2次或更多次來達成。在一些方法中，所用組織培養細胞是HEK細胞。可用胰蛋白酶或等同蛋白酶增加病毒進入細胞的效率。其他方法包括滴定胰蛋白酶以確定所使用的胰蛋白酶批次和所用細胞的最佳濃度。對所用的每一種流感病毒以及對具體細胞最佳感染複數(MOI)的測定也有助於組織培養繁殖成功。分離的適於組織培養的病毒可用來根據標準方法生產疫苗。在一些實施方式中，所述疫苗包括佐劑ISCOM的使用。在一些實施方式中，所述疫苗包括佐劑氫氧化鋁的使用。當疫苗中包括超過一種的病毒株或分離物時，所述方法可包括以免疫學等量混合兩種物質。本發明提供適於組織培養的病毒分離物和由此製成的疫苗的方法和組合物。I.選擇適於組織培養的病毒的方法用於本發明方法的病毒來源對本發明不重要。例如，病毒可從感染的動物或患者分離得到；作為WHO的種子病毒原液，可從適當的組織(如，ATCC)購買得到；或從科研實驗室得到。具體來說，已知CIV引起包括肺炎的嚴重呼吸道疾病。因此，顯示這些症狀的狗是可用的來源。分離病毒的適合標本包括鼻洗滌物/抽出物、鼻咽拭子、咽喉拭子、支氣管肺清洗物、氣管抽出物、胸膜穿刺液、唾液、洩殖腔塗片和屍體解剖標本。來自活體動物的標本優選早期收集，且在某些情況下，在發病後4天內收集。標本可用適合的運輸介質收集，並貯存在該介質中直至使用，或者立即使用。如果貯存，則病毒可在較低溫下保存，如在4°C下，以保證其存活力。要從標本中分離流感病毒，可以移除大量汙染物(如，通過離心)並將上清液接種到各種稀釋倍數的各種細胞。或者，來自動物的病毒最初可在母雞雞蛋中生長。可用方法證實在過程中的任何時間點的病毒分離物確實是流感。可用各種篩選方法證實所需流感病毒存在於製備適於組織培養的分離物的過程中的任何時間。可通過使用任何已知和/或適合的測定流感病毒的測定來篩選病毒。這種測定包括(單獨或組合)用如逆遺傳學、重配、互補和/或感染的方法進行的病毒複製、定量和/或定性滅活測量(如，通過抗血清)、轉錄、複製、翻譯、病毒體合併、病毒力、HA或NA活性、病毒產率和/或形態發生。A.組織培養細胞允許流感病毒生長的任何哺乳動物宿主細胞可用於本發明的方法。通常，所述宿主細胞適合排除外源因子，具有可根據WHO對疫苗生產的要求確認的傳代數。很多細胞系可用於分離和繁殖流感病毒。已使用的一些細胞系包括=Vero細胞(猴腎細胞)、MDCK細胞(馬-達氏犬腎細胞))、BHK-21細胞(幼倉鼠腎)和BSC(猴腎細胞)和HEK細胞(人胚胎腎細胞)。因此，可用允許流感病毒生長的任何組織培養 細胞。適合的細胞包括但不限於Vero、MDBK、BK21、CV-l和任何哺乳動物胚胎腎細胞(如，HEK)。在一些實施方式中，使用Vero細胞或哺乳動物胚胎腎細胞。在一些實施方式中，使用人胚胎腎細胞(HEK細胞)。本領域的技術人員熟知用於上述細胞系繁殖的適合組織培養基。這些培養基可含有濃度高達20% v/v的適合血清(如，胎牛血清)。本領域的技術人員應理解,可以使用含有少於20% v/v血清(2-5% v/v)的培養基來繁殖上述細胞系。B.優化用於細胞的胰蛋白酶為了在細胞培養物中生長出高效價的病毒原液，可用適量的蛋白酶活化血細胞凝集素，使之內化至細胞內。含有蛋白酶的溶液可直接加入到分離物中，或分離物可稀釋至用於疫苗生產的分離物生長的蛋白酶中。所述蛋白酶可用來將病毒稀釋至適合生長的M0I。蛋白酶可為能激活HA內化而不破壞病毒蛋白使其不能生長和/或感染細胞的任何蛋白酶。這些蛋白酶包括但不限於原核生物蛋白酶、鏈黴蛋白酶、胰蛋白酶和枯草菌蛋白酶(A)，例如，IX型胰蛋白酶。所用的蛋白酶的量應足以激活病毒，並且對細胞的毒效非常小。毒效可通過鑑定對細胞的損傷特徵來分析，如脫離平板或基底、存在細胞碎片、出現死細胞和缺乏活力的細胞。因此，「有效量的胰蛋白酶」是指，當其使用足夠時間時，允許胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細胞從基底分離或引起其他毒效者。也可使用蛋白酶滴定來增加組織培養中活性病毒的產量。滴定包括確定引起細胞最小損傷程度的胰蛋白酶的最大量。這個量可隨所用的組織培養細胞以及蛋白酶批次而變化。因此，可在使用之前滴定新的蛋白酶批次以建立最適水平，且每個蛋白酶可對每種組織培養細胞滴定。滴定涉及用所述蛋白酶分步稀釋接種組織培養細胞並將其孵育一段合適的時間。例如，可用蛋白酶半步稀釋(10_°_5)。孵育時間隨細胞系變化，但通常在約2天和7天之間。蛋白酶水平可用所用細胞的通常孵育時間測定。例如，如果4天孵育對流感病毒最好，則蛋白酶可通過在蛋白酶單獨存在下孵育約4天測試。然後可用對細胞沒有毒性或毒性非常低的蛋白酶最低倍稀釋物。可用於哺乳動物組織培養細胞(如Veix)細胞)的胰蛋白酶濃度範圍為約0. 5 u g/mL至約10 u g/mL,但更常用約2. 5 ii g/mL培養基。一旦蛋白酶的最適水平確定,病毒可在含有適量蛋白酶(如,胰蛋白酶)的感染培養基中稀釋，以便當病毒加入到細胞培養基時達到最適水平。最適量的胰蛋白酶可用於有限稀釋克隆以產生適於組織培養的分離物以及用於所述分離物的生長和收穫。C。有限稀釋克隆典型的病毒培養物是異源的。因此，例如在微滴定板的孔中的單個病毒顆粒在傳染性、複製等方面可以變化。系列稀釋用於選擇培養中的病毒亞群，例如，最適於細胞的亞群。系列稀釋涉及系列地稀釋病毒培養物直至不含病毒，例如，用來測定最佳MOI。這通常涉及一系列10倍稀釋，但可根據病毒效價變化。有限稀釋通常用於鑑定對細胞產生病毒效應的最高稀釋倍數。所述病毒效應可為致細胞病變效應(CPE)。致細胞病變效應為流感病毒感染引起的對細胞的任何效應。這些效應包括但不限於細胞變圓(cell rounding)、退化、脫落、凋亡、活性氧物質(ROS)誘導、細胞變成顆粒狀然後成片段化，以及細胞脫離支持物(如組織培養皿)。收穫最高倍稀釋物的孔。然後將所收穫的病毒稀釋至不含病毒，並且重複該過程。系列10倍稀釋液通常用適合的培養基配製(含或不含胰蛋白酶)，且將0. 2mL的每種稀釋液加入含有組織培養細胞的平板或微滴定板的孔中，並孵育一段足以鑑定細胞的CPE的時間。因為血清滅活胰蛋白酶，所以培養基通常不含血清。收穫含有引起CPE的最高倍稀釋物的孔 或平板，然後稀釋，並且重複該過程。該過程通常重複至少兩次，但可重複多達5次。在一些情況下，該過程重複3次。通過本發明的方法生產的病毒培養物特徵在於病毒中HA蛋白序列的同質性。有很多方法可用於測量序列同質性程度。例如，對HA蛋白本身測序或通過對編碼這種蛋白的RNA測序。本發明的方法生產的病毒製劑通常含有其中至少70%的HA蛋白具有相同胺基酸序列的病毒。在一些實施方式中為80%，或至少90%的HA蛋白具有相同胺基酸序列。D.檢測流感病毒的方法可進行檢測以證實在本法明方法的過程中任何時間流感病毒的活性和存在。例如，可如下鑑定血細胞凝集。如果病毒具有表面HA蛋白，其可附著在RBC上並使其凝集。如果樣品中病毒濃度很高，則當樣品與RBC混合時，將形成病毒和RBC晶格。這種現象稱為血細胞凝集。這是一種檢測使血細胞凝集的病毒(如流感病毒)的存在和效價的簡單方法。如果樣品中沒有足夠病毒使RBC血細胞凝集，則它們在孔的底部形成小球。以顯示完全血細胞凝集的最高稀釋倍數作為終點。病毒效價表達為HA單位(HAU)，為每毫升稀釋倍數的倒數。例如，在50 y L中1/32倍稀釋時孔中有完全血細胞凝集，但在下一個最高稀釋倍數的孔中沒有，則所述病毒效價為每50 u L32HAU或每mL 640 HAU。可用於鑑別和定量流感病毒的其他測定包括CPE測定(如本文所討論)，Western印跡(Western blot)、ELISA、PCR和用對病毒某些部分(具體來說，為HA抗原)有特異性的抗體和/或探針鑑別流感病毒的其他方法。II.生長和收穫方法在生產病毒分離物之後，收穫所述分離物。可用標準方法。所收穫的分離物可儲存供以後使用，或可用於用標準方法生產疫苗。當產生最大量病毒時；當產生最大量血細胞凝集素時，如用HA測定方法測量；和/或當細胞裂解時，可收穫病毒。在得到適於組織培養的分離物後，所述分離物可生長並收穫。生長和收穫適於組織培養的病毒的方法對本發明不重要，並且可用標準方法。然而，在一些實施方式中，病毒在其最適的組織培養細胞中生長。所收穫的病毒分離物可儲存供以後使用，或可用於用標準方法生產疫苗。可通過在適量的蛋白酶(如胰蛋白酶)中以適合的MOI將病毒加入細胞中，使病毒在適合的組織培養細胞中生長一段足以產生高效價的病毒和/或直至細胞裂解的時間。當產生最大量病毒時；當產生最大量血細胞凝集素時；和/或當細胞裂解時，可收穫病毒。本文業已發現，病毒在雞蛋中(在尿囊腔或通過羊膜接種)的最適預生長可增強病毒在組織培養細胞中的適應性。
A.在雞蛋中的預生長雞蛋培養物的傳代顯示能促進病毒在組織培養細胞中的適應性。因此，使病毒分離物在含胚母雞雞蛋中根據標準技術預生長是可取的。例如，所述病毒注射入尿囊腔或通過9-12天齡的含胚雞蛋的羊膜，並且使其擴增約三天。然後收集尿囊液或羊膜液，收集的材料可以適合的MOI在組織培養中生長，用於疫苗生產。或者，收集的材料可直接用於有限稀釋克隆。已發現，通過羊膜的雞蛋接種能濃集可複製的病毒，並且在Veix)細胞中生長時可以產生高水平的HA蛋白。B.M0I本文鑑定出低MOI產生較好和/或較高效價病毒分離物。不受具體理論的限制，人們相信低的MOI減少缺陷病毒顆粒的量，並且產生更有效的感 染過程。在一些實施方式中，所用的MOI小於0.01(每100個細胞I個病毒)。在其他實施方式中，MOI小於0.003。在一些實施方式中，MOI小於0. 001。MOI可選擇在約3至4天中產生高效價病毒和/或裂解細胞的最低MOI。III.疫苗生產一旦從適於組織培養的病毒得到所需的分離物，則病毒可用於生產疫苗。已知很多類型的病毒疫苗，包括但不限於減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和片段疫苗。A.減毒病毒生產方法減毒疫苗是已經減毒或改變而不再引起疾病的活的病毒疫苗。這些可通過多種方法生產，例如，在組織培養中生長，重複傳代，並且遺傳操作突變或去除涉及致病的基因。適於組織培養的分離物可用於用標準方法生產減毒病毒。例如，一個病毒基因和/或蛋白經鑑定涉及致病或涉及疾病表現，則其可被突變或改變以便所述病毒仍能在細胞內感染和複製，但不引起疾病。一個這樣的實例是誘變HA1/HA2切割位點。所述適於組織培養的病毒可用任何標準方法減毒，例如，冷適應病毒。減毒病毒生產之後，可用標準方法製備疫苗(如，本文的方法)。可用標準方法純化病毒，例如，用尺寸排阻層析。可用標準佐劑和疫苗製劑製備疫苗，如ISC0M、納米珠、礦物油、植物油、氫氧化鋁、皂甙、非離子去汙劑、角鯊烯和嵌段共聚物，可單獨使用或作為輔助劑組合使用。目前美國和歐洲市售的疫苗不含任何佐劑(活疫苗和死疫苗)，這是疫苗中需要如此高濃度的HA (每病毒株15 ii g的HA，三價配方含45 ii g的HA)的部分原因。B.滅活、亞單位和片段病毒疫苗生產方法一旦得到所需病毒，可將其用於生產免疫原性組合物，例如，疫苗。「死」疫苗的實例是滅活、片段和亞單位疫苗。這些可用標準方法製備以治療流感。例如，亞單位疫苗一般涉及僅分離激活免疫系統的病毒部分。在有流感的情況下，用純化HA和NA製備亞單位疫苗，但病毒蛋白的任何混合物可用於生產亞單位疫苗。一般來說，病毒蛋白(如HA)從重組病毒形式中提取，並且亞單位疫苗經配製含有來自WHO推薦的病毒株的這些病毒蛋白的混合物。例如，1995-1996年的疫苗含有來自兩種A株和一種B株(A/Singapore/6/86 (HlNl) ；A/Johannesburg/33/94(H3N2);和 B/Beijing/84/93)的 HA和NA。對於H3N8CIV來說，可用H3和/或N8抗原。一般來說，病毒蛋白從病毒中提取，並且亞單位疫苗經配製含有這些病毒蛋白的混合物。蛋白可用標準方法從適於組織培養的分離物中分離用於亞單位疫苗。或者，蛋白可用重組技術生產。本領域已知生產具體蛋白的技術。片段疫苗一般涉及用去汙劑處理包膜病毒，以使其中的蛋白溶解。在流感病毒的情況下，HA和NA溶解。例如，可用非離子去汙劑如Triton X-100生產片段疫苗。滅活病毒疫苗通過滅活收穫的病毒並用已知方法配製來製備，以用作誘發哺乳動物免疫反應的疫苗。滅活步驟、亞單位純化和/或片段可在尺寸排阻純化病毒之前或之後進行。例如，滅活疫苗的生產可涉及去除細胞材料、滅活病毒、純化和溶解病毒包膜。其他實施方式可涉及病毒純化，然後滅活，例如，用甲醛。一旦製備，任何疫苗(如，減毒、片段或滅活)可被檢測以確定所述病毒和/或疫苗保持相似的抗原性，在哺乳動物中產生血清學反應，和/或提供對抗 哺乳動物疾病的保護。C.收穫病毒的進一步加工I.收穫病毒的淨化收穫後和/或滅活收穫的病毒後，可以通過例如，沉澱去除微載體並通過滲濾濃縮上清液去除細胞材料和其他幹擾材料。在組織培養細胞中生長的流感將含有宿主細胞蛋白。可能需要上清液的一些進一步淨化。細胞DNA可通過酶處理(如，Benzonase)去除。在最初去除幹擾材料之後，病毒可用標準方法滅活。或者，可在通過，如尺寸排阻層析進一步純化後進行滅活。2.病毒滅活流感病毒可以任何方法和用任何試劑滅活。滅活方法對本發明不重要。滅活可發生在汙染或幹擾材料去除之後。滅活可包括使用任何已知滅活劑。這些滅活劑包括但不限於UV照射、甲醛、戊二醛、二乙烯亞胺(BEI)和￠-丙內酯。在一些實施方式中，用BEI是因為已知其破壞病毒核酸而不破壞病毒蛋白。此外，BEI不受蛋白含量和溫度的影響。滅活劑以高至足以滅活溶液中每個病毒顆粒的濃度使用。例如，BEI可以約0. 5和IOmM之間的終濃度使用，包括但不限於1. 5、3、4、5和6mM，並且包括約I至6和I至3mM的範圍。在一實施方式中，BEI以約6mM的濃度使用。BEI通常以約I. 5mM的濃度使用並且在37°C下孵育48小時。在CIV的疫苗製備中，BEI可以約0. 5和IOmM之間，通常為4至8mM，經常為5和7mM之間的終濃度使用。在一個實施方式中，BEI以約6mM的濃度使用。在一些實施方式中，滅活在對滅活劑適合的PH和溫度下發生。可選擇pH和溫度以保證得到的滅活病毒仍然有免疫原性。滅活可在適當的攪拌下進行以保證所述試劑與溶液中所有的病毒顆粒相接觸。滅活後，可用以下方法去除滅活劑，該方法包括但不限於，滅活劑的滅活、滅活劑的沉澱、滅活劑的過濾，以及層析，或這些方法的混合。例如，BEI可通過加入硫代硫酸鈉滅活。殘留的BEI也可通過尺寸排阻方法從病毒/病毒蛋白分離。一旦確定無害(缺乏活病毒)，病毒溶液可進一步加工以生產疫苗。3.進一步加工可進一步加工病毒溶液，例如，以去除汙染物，進一步濃縮病毒，以提供較強的免疫反應。進一步加工的一些實例包括用標準方法最初去除細胞材料、去除細胞DNA、濃縮和在佐劑中配製。在組織培養細胞中生長的流感含有宿主細胞蛋白。例如，在人胚胎腎細胞(HEK)中繁殖的流感將含有HEK蛋白，或如果在MDBK或VERO細胞中生長，則分別含有牛或猴蛋白。這些蛋白可用本領域的技術人員已知的方法檢測。已知很多去除DNA的方法，包括加入各種已知降解細胞DNA的DNA酶,例如，Benzonase。可進行起始濃縮步驟以提供最適於進一步層析純化的濃度的病毒溶液。這可用任何標準方法進行，包括但不限於用分子量截留為約IOOK的膜(如MWCO為IOOK的聚碸膜)進行超濾。病毒溶液可濃縮至約100倍，包括但不限於90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍和5倍。在一些實施方式中，病毒溶液濃縮至約50倍，但更通常包括20倍和30倍。4.純化可用標準方法如密度離心純化病毒。在一些實施方式中，病毒通過尺寸排阻凝膠層析純化。使用尺寸排阻的一個優點是產率優於用密度離心純化。可用得到病毒純化的任何尺寸排阻凝膠。可用任何標準凝膠，如瓊脂糖凝膠(如Seph arose CL-2B)。在一些實施方式中，柱子長度為約70至120cm以得到所需純化，包括但不限於約80、90、100和110。在其他實施方式中，柱子長度為約80至100cm，例如柱子長度為約90cm。在一些實施方式中，用多個柱子串聯可得到所述長度，如兩個45cm的柱子或3個30cm的柱子(如，長度為30-32cm，直徑為30cm的柱子)。濃縮的病毒可用標準方法上柱，如，所述病毒可以5-10%的柱體積(CV)，通常5-7% CV上柱。然後可以從柱子上收集病毒峰，用標準方法(例如，超濾)進一步濃縮。在一些實施方式中，用總長度為90cm的2至3個柱子串聯，聚集最終峰，用超濾濃縮。5.包膜蛋白溶解濃縮的病毒峰材料可用標準方法溶解，如用非離子去汙劑。可以進行溶解以製備ISCOM配方的材料(見下文)。非離子去汙劑的實例包括但不限於壬醯-N-甲基葡萄糖醯胺(Nonanoyl-N-Methylfucamide) (Mega 9)、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、毛地黃阜苷、C12E8、Lubrol、Nonidet P-40 和 Tween (如 Tween 20、80 或 120)。溶解後，病毒可用於生產疫苗，和/或可加入佐劑。例如，對於ISCOM佐劑生產，可加入脂質混合物，以有助於ISCOM形成。所述脂質混合物可包括磷脂醯膽鹼和合成膽固醇。在一些實施方式中，所述病毒在室溫下邊攪拌邊用Mega 9破壞，然後可加入脂質混合物(磷脂醯膽鹼和膽固醇)，並繼續攪拌。6.佐劑形成疫苗和/或藥物組合物中可加入適合的佐劑。佐劑的實例包括含有油和水的乳液的那些，以及還包含氫氧化鋁的那些。在後一種情況下，可使用市售的氫氧化鋁，例如，Alhydrogel, (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark)和 Rehydrogel(ReheisInc.)。油和水的乳液通常包含礦物油或可代謝的油(如，植物油、魚油)。非離子去汙劑或表面活性劑可用作乳化劑。乳化劑的實例包括Tween 80/Span 80、Arlecel 80/Tween 80和Montanides (Seppic, Paris, France)。在佐劑乳液的情況下，一般5-25%的體積是油，75-95%的體積是水。在一些實施方式中，佐劑乳液為20%體積的油和80%體積的水。氫氧化鋁的量一般為水相的約5%和15%之間。在一些實施方式中，Emunade 是佐劑。對於一些實施方式，ISCOM用作輔助劑。ISCOM是免疫刺激複合物的首字母縮合詞，Morein等人(Nature 308 :457-460 (1984))描述了該技術。ISCOM是新型疫苗遞送系統並且與傳統佐劑技術不同。ISCOM可方便地以兩種方式中的一種形成。在一些實施方式中，抗原在其配製期間物理上併入結構中。在其他實施方式中，ISCOM-基質(例如，通過Isconova提供)不含抗原，但通過終端使用者在免疫之前與選擇的抗原混合。在混合後，抗原在溶液中與ISCOM-基質一起存在，但在物理上不併入結構中。一般來說，在ISCOM中，純化抗原基於在關鍵濃度下Quil A自發形成膠束，並通過疏水/親水鍵捕獲純化的免疫原的能力以多聚體形式存在。這些膠束結構大小為35nm並很容易被免疫系統識別。與傳統的儲存輔助劑不同，ISCOM很快從注射部位清除和引出局部、體液和細胞介導的免疫反應。在具體的實施方式中，ISCOM如下形成。所述病毒用標準方法溶解，如用非離子去汙劑(如Mega-9、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、毛地黃皂苷、NonidetP-40、C12E8, Lubrol, Tween-80)。加入脂質混合物以有助於ISCOM形成。所述脂質混合物可包括磷脂醯膽鹼和合成膽固醇。在一些實施方式中，所述混合物首先在室溫下邊攪拌邊用非離子去汙劑處理，然後可加入脂質混合物(例如，等份數的磷脂醯膽鹼和膽固醇)，並繼續攪拌。將Quil A(皂苷的純化糖苷)加至病毒脂質混合物中並 繼續攪拌。可加入所述Quil A得到最終濃度為約0. 01至0. 1%的Quil A，包括但不限於0. 02,0. 03,0. 04,0. 05、
0.06、0. 07、0. 08和0. 09的Quil A。在一些實施方式中，所述最終濃度為約0. 05%。去除所述非離子去汙劑(例如，通過與醋酸銨滲濾)。ISCOM的基質通過Quil A形成。通過電子顯微鏡觀察，ISCOM粒子的形態學顯示典型的籠狀結構，大小為約35nm。ISCOM形成時期可用切向流滲濾精簡。ISCOM顯示了基於Quil A在關鍵濃度下自發形成膠束和通過捕獲純化抗原的疏水/親水鍵的能力呈多聚體形式的純化抗原。ISCOM的形成可通過電子顯微鏡證實其已形成的典型籠狀結構而證實。ISCOM呈遞的免疫反應顯示至少比作為凝集膜蛋白膠束單獨呈遞的相似抗原負荷量的免疫反應好十倍。還發現ISCOM能誘發細胞介導的反應，這在用傳統的整個病毒疫苗時未發現。在一些實施方式中，最終濃度為約0.05%。也可在疫苗和/或藥物組合物中加入免疫刺激劑。免疫刺激劑包括單獨使用或組合使用的細胞因子；生長因子；趨化因子；來自淋巴細胞、單核細胞或來自淋巴器官的細胞的細胞培養上清液；植物的細胞製劑和/或提取物；細菌、寄生蟲的細胞製劑和/或提取物；或促細胞分裂劑，以及從其他病毒和/或其他來源(如雙鏈RNA、CpG)得到的新型核酸；嵌段共聚物；納米珠或本領域已知的其他化合物。佐劑和其他免疫刺激劑的具體實例包括但不限於溶血卵磷脂；葡萄糖苷(如皂苷和皂苷衍生物，如Quil A或GPI-0100);陽離子表面活性劑(如DDA);季銨烴基滷化物(quaternary hydr°C arbon ammonium halogenides);複合多兀醇；聚陰離子和多原子離子；聚丙烯酸，非離子嵌段聚合物(如Pluronic F-127);和MDP (如，N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇氨醯基-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-降-胞壁醯基-L-丙氨醯基-D-異穀氨醯胺、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙氨醯基-D-異穀氨醯胺基-L-丙氨酸-2-(1' -2，-二棕櫚醯基-sn-丙三基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺)。D.疫苗效力本領域熟知測定亞單位、減毒、片段和/或滅活病毒疫苗是否與臨床分離物或從其中得到的適於組織培養的分離物的病毒維持相似抗原性的方法。這些已知方法包括抗血清或抗體、HA和NA活性和抑制以及DNA篩選(如探針雜交或PCR)的應用，以證實編碼抗原決定簇的供者基因在滅活病毒中存在。本領域也熟知鑑別疫苗是否誘導血清學反應的方法，其包括用疫苗免疫待測動物，然後接種致病病毒，並鑑別疾病症狀存在還是不存在。因此，流感疫苗效力可在動物中檢測，通常用白鼬、小鼠和豚鼠。可用血細胞凝集抑制(HI)或神經氨酸酶抑制(NI)方法檢測抗體效價，或檢測組織培養物中的病毒中和抗體(微中和檢測)，這些方法一般均已知。挑戰性研究可提供評估疫苗的重要信息。適合治療的藥物組合物和/或疫苗包括病毒或病毒亞單位與無菌水性或非水性溶液混合物。生產藥物組合物和/或疫苗的方法可包括分離適於組織培養的分離物，生長和純化病毒分離物，滅活和/或減毒病毒並以適合的效價與生理上可接受的稀釋劑和免疫刺激劑混合。或者，病毒蛋白可經純化以用於亞單位疫苗，並以適量與生理上可接受的稀釋劑和免疫刺激劑混合。可純化足夠的病毒，以使得沒有可幹擾滅活步驟和/或病毒的免疫原性的汙染材料或物質。適合效價的病毒或適合濃度的病毒蛋白可與稀釋劑和免疫刺激劑混合。TCID5tl測量是一種測量病毒效價的方法(感染50%組織培養物劑量)。例如， 可用約IO5至IO12的TCID5tl(基於預滅活效價)的效價，包括但不限於106、107、108、IO9UOltl和IO110任選所述效價可用HA效價分析，並在疫苗中每個病毒可包含約I至30 y g的HA，包括但不限於用於佐劑製劑的I至IOii g和用於非佐劑疫苗的I至30ii g。在一些實施方式中，效價為約15ii g。因此，例如，當未加佐劑疫苗中包括3種病毒時，I個成人劑量含有45ii gHA(3種病毒株，每一種15ug)的等同物。在其他實施方式中，每株的量可不同(例如，取決於抗原性)，但最終濃度為約 I 至約 60ii g HA，包括 2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 和 55 y g。在另一個實施方式中，預期佐劑疫苗含有的HA量為約I至30 ii g，包括2、5、10和20 u g。疫苗的體積通常為約50ii I和5000 u I之間，包括100、500、1000、2000和5000 U I。可用生理上可接受的標準稀釋劑，例如，EMEM、Hanks平衡鹽溶液和磷酸鹽緩衝液(PBS)和生理鹽水。疫苗和/或藥物組合物中可加入適合的免疫刺激佐劑。免疫刺激佐劑的實例包括但不限於單獨使用或組合使用的礦物油、植物油、氫氧化鋁、皂苷、非離子去汙劑、角鯊烯、嵌段共聚物、納米珠、ISCOM, ISCOM基質或本領域已知的其他化合物。除了佐劑外，藥物組合物中也可包括可用於抗流感的任何適合的抗病毒劑。這些抗病毒劑包括例如，金剛乙胺(rimantadine)、金剛燒胺(amantadine)、神經氨酸酶抑制劑(如zanamivir和oseltamivir)、y幹擾素、胍、輕基苯並咪唑、幹擾素a、幹擾素0、縮氨基硫服(thiosemicarbarzones)、美替沙腙(methisazone)、利福平(rifampin)、利巴韋林(ribavirin)、卩密唳或嘌呤類似物和磷甲酸鈉(foscarnet)。含有多於一種病毒或病毒蛋白株的疫苗可用本發明的方法生產。混合物可免疫原性滴定以提供適當的等同免疫性。免疫原性滴定意指生產的最終產物平分免疫性的不同。例如,如果製備A株和B株混合物，且A株有5倍的免疫原性，則混合株的比例為A株B株為I : 5。IV.疫苗給藥疫苗組合物和/或藥物組合物的給藥可用於預防性目的。當預防性提供時，組合物在任何流感病毒感染症狀明顯出現之前提供。組合物的預防性給藥用於預防或減弱任何後續感染。藥物組合物和/或疫苗可以本領域已知的任何方式給藥，包括通過吸入、鼻內(例如用減毒疫苗)、口服或胃腸外給藥。胃腸外途徑給藥的實例包括皮內、肌肉內、靜脈內、腹膜內和皮下。在一些實施方式中，疫苗經上臂肌肉內或深層皮下注射給藥。對於之前沒有接種或沒有接觸流感(未致敏)的一些兒童來說，第二劑量可間隔2至4周給藥。一或多個加強劑疫苗可在最初免疫之後的適合的時間給藥。給藥有效量的疫苗和/或藥物組合物。有效量是足以取得諸如誘導足夠體液或細胞免疫等所需生物學效應的量。這可能取決於疫苗類型、接受者的年齡、性別、健康狀況和體重。所需生物效應的實例包括但不限於無症狀產生、症狀減輕、組織或鼻內分泌物的病毒效價減少、完全防止流感病毒感染和部分防止流感病毒感染。在一些實施方式中，免疫學上有效量的CIV疫苗為每劑量約100HAU至約1500HAU。組合物通常為每劑量250至750HAU之間。在一個實施方式中，疫苗組合物包括每劑量約500HAU。
當以溶液給藥時，所述疫苗可以水溶液、糖漿、酏劑或酊劑的形式製備。這些製劑在本領域已知，並且通過將抗原和其他適合的添加劑溶於適合的溶劑系統中來製備。這些溶劑包括例如，水、鹽水、乙醇、乙二醇、甘油和Al液。適合的添加劑包括經鑑定的染料、香料、甜味劑和抗微生物的防腐劑，如硫萊撒(thimerosal)(乙基萊硫代水楊酸納)。這些溶液可用標準方法穩定，例如，通過加入部分水解的明膠、山梨醇或細胞培養基，並可用標準方法緩衝，用諸如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀的試劑。液體製劑也可包括懸浮液和乳液。懸浮液的製備(例如)用膠體磨，乳液的製備(例如)用勻漿器。V.病毒株和WHO為了有時間生產足夠疫苗原液，必須在流感季節來臨之前決定好對於今年的疫苗(冬季用)來說用流感A株和B株的哪一種。有一個世界性的精巧而複雜的流行病學監控系統來幫助這些決定。此外，WHO通常製備用於生產疫苗的種子病毒。有16種已知HA亞型和9種已知NA亞型。HA和NA蛋白的多種不同組合是可能的。目前僅有一些流感A亞型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人群中普遍流行。其他亞型在其他動物種中最常見。例如，在馬中致病的H7N7和H3N8病毒，最近顯示H3N8也在狗中致病。已知感染鳥類和人類的禽流感A病毒三種顯著亞型為流感A H5-H5感染，如，HPAIH5N1病毒、流感A H7和流感A H9。然而，感染人類並引起流行或大流行的下一批病毒株可來自任何亞型。可用標準方法得到病毒,例如，從患者樣本、美國菌種保藏中心(the AmericanType Culture Collection)(或其他保藏中心)，或從研究病毒的其他特定實驗室得到。在一些實施方式中，病毒從WHO或⑶C得到，包括季節性病毒和可能的大流行株。VI.血清學反應的檢測本領域也熟知鑑別疫苗是否誘導血清學反應的方法。例如，可將免疫原性化合物/疫苗注射入測試動物，並在血清中鑑定抗病毒抗體。本領域熟知鑑別疫苗是否有保護性的方法，該方法包括用疫苗免疫測試動物，然後用致病病毒接種，並鑑別疾病症狀存在還是不存在。可進行血細胞凝集抑制試驗以鑑別對血細胞凝集素的血清學反應的存在。可在所有測試血清樣品上用火雞紅細胞(RBC)進行血細胞凝集抑制(HAI)測定，例如，通過用已知流感亞型如CIV(H3N8)。簡言之，在V形底的96孔微滴定板中的PBS中進行測試血清的兩倍系列稀釋。將含有4-8HAU/50 ill CIV的等體積病毒懸浮液加入到含有測試血清的各孔中，並該板在室溫下孵育30分鐘。然後加入等體積的0.5%的火雞RBC懸浮液。然後將該板在室溫下孵育30分鐘並讀取HAI結果。顯示HA抑制的血清最高稀釋倍數的倒數被認為是測試樣品的HAI效價。測定抗流感病毒抗體存在的其他方法包括神經氨酸酶抑制測試、Western印跡、ELISA、PCR和鑑別流感病毒抗體的其他方法。這些測定是本領域已知的。
Vl I.實施例如下實施例提供製備用於生產主要種子的均勻病毒群的流感病毒分離、適應和純化步驟。這些實施例使用Veix)細胞(關國菌種保藏中心，CCL81)，但可用流感病毒適用的任何細胞類型。 實施例I :化學試劑和牛物試劑所用感染培養基含有IL DMEM(Cambrex,目錄號04-096)或等同物，貯存在2-7V;20mL L-穀氨醯胺(Cellgro，目錄號25-005-CV)或等同物，貯存在_10°C或更低溫度，一旦融解，其可貯存在2-7°C多達4周；以及IX型胰蛋白酶(Sigma產品號T0303，CASNo. 9002-07-7)或等同物，分裝並冷凍貯存在_5至_30°C。在感染細胞之前新配製感染培養基。細胞培養基製備如下1L DMEM、20mL L-穀氨醯胺、50mL胎牛血清(Gibco目錄號04-4000DK)或等同物(注意來自無BSE的國家)。完全培養基製備後在2_7°C下貯存不多於30天。用於傳代細胞的EDTA-胰蛋白酶(Cellgro目錄號98-102-CV或等同物)貯存在_5至-30 0C，由製造商指示有效日期。實施例2 :細胞培養物製備因為用於病毒感染步驟的蛋白酶稀釋可根據批次變化，在使用之前滴定新的胰蛋白酶批次以建立最適水平。滴定的實施例是在含有L-穀氨醯胺的DMEM中系列稀釋IX型胰蛋白酶，用半對數稀釋用含有新鮮匯合單層Veix)細胞的96孔板，用280 y L的PBS將板的每個孔洗滌2次。洗滌後立即按行加入200 u L每個稀釋倍數的IX型胰蛋白酶至板中。然後將所述板在37°C加或減2°C下在5% CO2中孵育，並在4天後觀察細胞。選擇那些顯示對細胞健康狀況沒有或很少影響的胰蛋白酶的最低稀釋倍數作為胰蛋白酶的適合濃度，以用於流感感染的分離和優化。令人滿意和常見的是每個濃度內接種的孔之間很少或沒有變化。對於在Veix)細胞中的病毒有限稀釋克隆來說，用單層細胞匯合，通常為3-4天齡的細胞；在96孔Falcon微測定板中生長。所述細胞源自ATCCCCL 81並用第132和156代之間的細胞。Vero細胞從液氮(LN2)中如下製備從LN2中取出I安瓿Vero細胞並在36°C加或減2°C下水浴融解。將小瓶中的全部內容移至25cm2含有補充10%胎牛血清的IOmL細胞培養基的組織培養瓶中。該瓶在36°C加或減2°C下，在4-6%0)2中孵育。I小時後輕輕取出上清液和未附著的細胞，並加入IOmL新鮮組織培養基。細胞在36°C加或減2°C下，在4-6% CO2中孵育直至達到90-100%的匯合。Vero細胞傳代如下用10_20mL PBS將單層細胞洗滌約3分鐘。輕輕倒出PBS並換成3mL EDTA-胰蛋白酶(Cellgro，目錄號98-102-CV)，將單層細胞孵育約3分鐘或直至細胞從瓶中脫離。加入17mL製備的生長培養基(含有FBS)稀釋懸浮液，以稀釋並中和胰蛋白酶。然後用血細胞計數器進行細胞計數，測定每mL懸浮液中的細胞數。瓶的數量可通過如下計算的懸浮液準備每mL細胞數(懸浮液)X所需懸浮液的mL數=每個容器的板的mL數。每mL細胞數(所需)計算懸浮液mL數的總和，懸浮液總mL數必須少於可用的體積。如果不是如此，則鋪板細胞密度調節至適應這個情況，然而，應當注意，鋪板時細胞密度較低時細胞匯合的時間長度將比較長。容器通常以細胞密度為每mL IX IO4至IX IO5個細胞的細胞懸浮液鋪板。細胞孵育3-4天或直至匯合。這些維持和繁殖Veix)細胞的技術可相似地 應用於所用的其他細胞系，如馬-達氏犬腎(MDCK)和 HEK 293。克隆尤其適於繁殖病毒分離物的HEK 293細胞。這種HEK 293亞克隆稱為GT-D22(或 D22)，從最初的 HEK 293 細胞(ATCC 號 CRL-1573 ;ATCC 批號 F-11285，第 33 代)製劑中分離。亞克隆HEK 293細胞，並根據攜帶有表達p53基因的5型重組腺病毒的改進產率選擇。對有正常形態和足夠的生長率的克隆進行胰蛋白酶消化，並以每孔1-2X106個細胞接種以用於進一步分析。最能產生克隆的克隆經受進一步亞克隆和選擇。最後選擇D22亞克隆。D22亞克隆繁殖流感的能力已用豬流感病毒(SIV)證實。當研究活的流感病毒時，採取生物安全預防措施。流感是2級病原微生物，並應該遵守 CDC-NIH, HS 出版號(CDC) 88-8395 (Biosafety in Microbiological and BiomedicalLaboratories)中對在實驗室中操作病毒的建議。實施例3 :有限稀釋克隆有限稀釋克隆的稀釋管準備和樣品稀釋如下。在試管架上設置測試管(12X75mm)並貼上標籤。每板檢測一個樣品，每個樣品的稀釋系列為KT1至10,。稀釋培養基用血清移液器以I. SmL的量分裝至每個測試管。第一個試管標為病毒鑑別。其他幾個試管準備用作稀釋對照，並在稀釋期間有誤差發生的情況下替換。將樣品震蕩混合約5秒，然後將200 y L樣品移至KT1稀釋管制備起始稀釋物。繼續系列稀釋至10_1(1。對於每個稀釋，樣品震蕩混合併在稀釋物之間更換移液器吸頭。稀釋物如下轉入細胞平板中。在使用之前即時從細胞平板中按無菌操作倒出培養基。用12道移液器用280 y L無菌PBS將每個孔清洗2-3次。將平板無菌倒空，但不能幹涸。將平板標上病毒鑑別、日期和稀釋方案。每個稀釋物在加至平板之前都短暫震蕩。用監控的Finnpipette或其它合適的移液器和1000 u L吸頭，將每孔200 U L樣品接種至平板的一行。根據病毒濃度加樣。首先，將2行稀釋對照加入平板，然後是最高稀釋的病毒(10_1(1)，接著是餘下的樣品。從10_1(1至KT1連續加樣。實施例4 :病毒製劑收穫病毒並如下評估CPE。孵育4天後，用顯微鏡檢查讀取致細胞病變效應(CPE)。用細胞碎片的存在、死細胞和缺乏活性的細胞的出現來鑑定CPE，因為它們是流感病毒的典型現象。偶爾會在起始病毒稀釋物中觀察到非特異性幹擾，因此檢查數個稀釋物的CPE很重要。當評估CPE時，檢查顯示CPE的最高倍稀釋物的孔中CPE程度很重要。通過選擇呈現CPE的最高倍樣品稀釋物的孔來達成取得最高水平的成功，但在這些孔中，優選呈現最小程度的CPE的那些孔。一旦被選擇，通過用單道IOOOil L移液器吸出液體來收集所述孔中的內容物。通常重複吸出液體，以去除在孔底鬆散附著的細胞，並幫助打散懸浮液中的細胞或病毒塊。然後用收集的液體進行下一輪或幾輪的有限稀釋克隆，或有時用於接種新鮮單層細胞以生產克隆後種子。一般來說立即連續地進行2至3輪有限稀釋克隆以產生均一的病毒群。過程中每一步都分析HA效價，結果顯示在表I中。A/Indonesia/05/2005 (IND0H5N1)、A/Vietnam/1203/04 (VNH5N1)、A/NewCaledonia/20/99 (A/NC/20/99 (R))和 A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05R)是由 CDC 提供的重配流感病毒。對於重配病毒，編碼表面糖蛋白HA和NA的基因來自流感株(IND0H5N1、VNH5N1、A/New Caledonia/20/99 和 A/Wis/67/05)，而其餘的內部基固來自 A/PR/8/34。有限稀釋克隆也適用於野生型(未進行PR8重配)流感株A/New Caledonia/20/99 (A/NC/20/99)、A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05)和 B/Malaysis/2506/04。病毒通過反向遺傳技術產生並在含雞胚的雞蛋中傳代。雞蛋材料直接用於在Ve ro細胞中的有限稀釋克隆(用於HA效價的步驟顯示在實施例5中)。表I
有限稀釋克隆(LDC)之前，之後的HA效價 ____
流感株起始材LDC之第二次笫三次滾動生物反_料「 前… LDC後 LDC後瓶_應器
IndoHSNl_ 20,4801601,2802,560 5,120 7,680
VNHSNl_ 2560<406401,280 5,120 7,680
A/NC/20/995，6006401,280———_____
A/NC/20/99(R) 10,2401,2801,280------ 2,560 10,240
AAVis/67/05(H3) 2,5606401,280.........-.......
AAVis/67/05(H3R) 7,6806401,280------ 2，S60 5,120
B/Malaysia/2506/04 2,560 <40 640 ------ ------ 15，120* HA效價表示為單位/mL。〃⑶C提供的卵胚材料的HA效價。⑶C提供的用卵胚材料直接感染的Veix)細胞的HA效價。如上表I所不,細胞培養系統能產生與蛋中產生的病毒效價同樣高的病毒效價。另外，最初在Vero細胞上顯示不可檢測的生長的病毒株VNH5N1和B/Malaysia/2506/04可通過有限稀釋克隆而適於Vero細胞上生長。有限稀釋克隆之前VNH5N1和B/Malaysia/2506/04在雞蛋羊膜上的繁殖增強了這些病毒在Vero細胞上生長的適應性。用SRID(單向輻射免疫擴散)定量血細胞凝集素，在濃縮的Veix)細胞培養基中的B/Malaysia/2506/04得到多達132 u g/mL的血細胞凝集素蛋白。產率(每mL培養物的HAyg數)較公布的用Veix)細胞的已知方法高10倍。目前，一個人疫苗的劑量相當於約15 u g/病毒株。因此，可從ImL濃縮的Vero細胞培養基中得到約8_9個劑量。實施例5:流感通過羊膜傳代增強病毒在組織培養細胞上生長的能力從⑶C收到流感病毒VNH5N1-PR8/⑶C-RG。這是一種重配病毒，由在PR8病毒骨架上的禽H5N1流感病毒越南株H5和NI基因組成。這種病毒在通過尿囊腔接種的11天齡含胚雞蛋中擴增。接種後2-3天收集尿囊液，病毒產率為256 0血細胞凝集素單位(HAU)/ml。在含有I. 25ii g/mlIX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀釋尿囊液( 200 yl)，並使得匯合單層Vero細胞(ATCC CCL號81，第147代)在36±2°C下吸收60分鐘。將含有
I.25ii g/mlIX型胰蛋白酶的25mL DMEM加入培養物中，孵育3天，收集培養上清液。在收集的液體中沒有可檢測的血細胞凝集素活性。將含病毒的尿囊液以I : 10，000稀釋，將100 ill接種至11天齡的含胚雞蛋的尿囊腔和羊膜上。將雞蛋在約39°C下孵育三天，分別收集尿囊和羊膜液。Vero細胞(第132至152代)在含5%胎牛血清的DMEM中以IX IO4至IX IO5個細胞/1111、200111/孔接種至96孔板，並在36±21、3-5% CO2下孵育3-4天(直至匯合)。在尿囊液或羊膜液中的VNH5N1病毒在含有1.25iig/ml IX型胰蛋白酶的DMEM中以KT1至10,系列稀釋。從Vero細胞去除培養基，用280 Ul的磷酸鹽緩衝液清洗每個孔，然後將200 ill的每種病毒稀釋物接種至8個重複的孔中。平板在36±2°C，3-5% CO2下孵育4天。與尿囊來源病毒的10_7稀釋相比，羊膜來源的病毒的致細胞病變效應高達10_9稀釋，其可證實羊膜液導致在Veix)細胞上生長的病毒效價更高(見表2)。收穫來自顯示致細胞病變相應的最高稀釋倍數的孔的病毒，通過第二次有限稀釋進行克隆。再一次，與尿囊來源病毒所見相比，羊膜液來源的病毒顯示了在較高稀釋倍數下的致細胞病變效應(病毒約多10倍)。表2有限稀釋傳代I尿囊液病毒丨稀釋致細胞病變效應(+出現)
ICT10 ~I- I- I- I- I- I- I-~
ICT9- - - - - - - -~
ICT8- - - - - - - -~
ICT7+ + - + -- + +
IO"6+ ++ + + ++ +
IO"5+ ++ + + ++ +
IO'4+ ++ + + ++ +
權利要求
1.通過有限稀釋克隆選擇在組織培養細胞中生長的人流感病毒的方法，所述方法包括 a.將一定量的人流感病毒系列稀釋，以獲得一系列人流感病毒濃度遞減的稀釋物， b.使每一份系列稀釋的人流感病毒與組織培養細胞接觸； c.使在步驟b中進行了接觸的所述人流感病毒生長足以產生致細胞病變效應(CPE)的一段時間； d.從接觸了來自引起CPE的、系列稀釋物中的最高倍稀釋物的人流感病毒的組織培養細胞中收穫步驟c中生長的人流感病毒；以及 e.用在步驟d中收穫的一定量的人流感病毒重複所述a到d的步驟。
2.根據權利要求I的方法，還包括在的步驟b的接觸之前將所述一定量的人流感病毒與有效量的胰蛋白酶混合。
3.根據權利要求2的方法，其中所述胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。
4.根據權利要求2的方法，其中所述步驟b的接觸是在少於O.Ol的MOI下進行的。
5.根據權利要求I的方法，其中所述組織培養細胞為哺乳動物胚胎腎細胞。
6.根據權利要求5的方法，其中所述哺乳動物胚胎腎細胞為人胚胎腎細胞。
7.根據權利要求I的方法，其中所述的人流感病毒為A、B或C型流感病毒。
8.根據權利要求7的方法，其中所述人A型流感病毒為H5N1株。
9.根據權利要求I的方法，其中所述人流感病毒分離物最初在含胚雞蛋中生長，以得到大量的人流感病毒。
10.根據權利要求I的方法，其中所述人流感病毒分離物最初在羊膜上生長，以得到大量的人流感病毒。
11.生產人流感病毒疫苗的方法，包括純化根據權利要求I所述的收穫的病毒。
12.根據權利要求11的方法，其中所述純化步驟用尺寸排阻層析進行。
13.根據權利要求11的方法，還包括用有效滅活病毒的量的二乙烯亞胺(BEI)處理所述病毒。
14.根據權利要求5的方法，其中所述哺乳動物胚胎腎細胞為馬-達氏牛腎(MDBK)細胞。
15.通過有限稀釋克隆選擇在組織培養細胞中生長的人流感病毒的方法，所述方法包括 a.將一定量的人流感病毒系列稀釋獲得一系列人流感病毒濃度遞減的稀釋物； b.將所述量的人流感病毒與有效量的IX型胰蛋白酶混合； c.使每一份系列稀釋的人流感病毒與哺乳動物胚胎腎細胞接觸； d.使在步驟C中進行了接觸的所述人流感病毒生長足以產生致細胞病變效應(CPE)的一段時間； e.從哺乳動物胚胎腎細胞收穫在步驟d中生長的人流感病毒，所述的哺乳動物胚胎腎細胞接觸了來自引起CPE的、系列稀釋物中的最高倍稀釋物的人流感病毒； f.將在步驟e中收穫的一定量的人流感病毒系列稀釋獲得一系列人流感病毒濃度遞減的稀釋物； g.將步驟e中收穫的所述量的人流感病毒與有效量的IX型胰蛋白酶混合；h.使每ー份系列稀釋的人流感病毒與哺乳動物胚胎腎細胞接觸； i.使在步驟h中進行了接觸的所述人流感病毒生長足以產生致細胞病變效應(CPE)的一段時間； j.從哺乳動物胚胎腎細胞收穫在步驟i中生長的人流感病毒，所述的哺乳動物胚胎腎細胞接觸了來自引起CPE的、系列稀釋物中的最高倍稀釋物的人流感病毒。
16.根據權利要求15的方法，其中所述哺乳動物胚胎腎細胞為人胚胎腎細胞。
17.根據權利要求16的方法，其中所述人A型流感病毒為H5N1株。
全文摘要
本發明涉及選擇在組織培養細胞中生長的流感病毒以製備適於組織培養的病毒分離物的方法。本發明還涉及由所述分離物製備的疫苗。
文檔編號A61K39/145GK102766606SQ20121025107
公開日2012年11月7日 申請日期2007年12月14日 優先權日2006年12月15日
發明者B·A·埃迪, O·Y·阿布德爾梅吉, P·高, T·L·沃斯梅恩 申請人:先靈-普勞有限公司