再生角膜內皮細胞片、製造方法及其使用方法
2023-07-12 21:14:51 1
專利名稱：再生角膜內皮細胞片、製造方法及其使用方法
技術領域：
本發明涉及生物學、醫學等領域中的再生角膜內皮細胞片、製造方法及使用它們的治療方法。
背景技術：
角膜組織由5層構成從外側表面開始，依次為角膜上皮層、前彈力層(Bowman′s membrane)、角膜基質層、後彈力層(Descemet′s membrane)、角膜內皮層。最裡側的角膜內皮層對角膜組織成為內襯的形狀，後彈力層相當於由角膜內皮層的粘著蛋白形成的基底膜。角膜內皮細胞的功能在於逆著角膜基質的膨潤壓力從基質一側向前房一側吸出水，這是由於使用Na-KATP酶的泵作用而產生的。人的角膜內皮細胞通常在活體內不會發生細胞分裂，變性、脫落的內皮細胞的部分通過殘存的細胞發生肥大化、或者移動而被代償。此時，若殘存的角膜內皮細胞數量過少，則角膜內皮組織的泵功能已經變得不充分，角膜組織發生膨脹，引發角膜內皮損傷、大泡性角膜病變等疾病。作為對於這類疾病的治療方法，可以舉出使用治療眼睛疼痛的軟性隱形眼鏡，或使用高滲食鹽水的眼軟膏或眼藥水以從腫脹的角膜組織去除水分的方法等，但是這種方法只不過是對症療法，還是期望能有根本性的治療方法。
隨著醫療技術的顯著發展，近年來，用他人的器官替換難以治療的器官的器官移植得到了普遍化。對上述的角膜內皮損傷、大泡性角膜病變等疾病，也已嘗試利用全層角膜移植來根本性地治療。但是，角膜捐獻者人數遠遠少於患者人數，相對於僅國內每年需要角膜移植的患者就有約2萬人，實際上能夠進行移植治療的患者只有其1/10，約2000人左右。現狀是儘管已經有角膜移植這樣的已被大致確立的技術，但由於角膜捐獻不足的問題，所以尋求另一種醫療技術。
作為解決上述問題的手段，最近，在活體外人工培養得到必要的組織的再生醫療技術急速地發展。一直以來，這樣的細胞培養是在玻璃表面上或在經過種種處理的合成聚合物的表面上進行的。例如，進行了如γ射線照射、矽酮塗布等表面處理的各種聚苯乙烯材質容器等作為細胞培養用容器得到普及。但是，上述角膜內皮細胞是一種難以在此類容器表面上高密度地增殖的細胞，所以希望有更好的培養方法。
另外，使用細胞培養用容器培養、增殖的細胞，通常用胰島素之類的蛋白分解酶或用化學藥品進行處理而從容器表面剝離、回收。但是，實施如上所述的化學藥品處理來回收增殖的細胞時存在如下缺點混入雜質的可能性大，以及增殖的細胞經過化學處理而轉化或損傷、細胞原有的功能受損等。為了克服上述缺點，到目前為止已提出了若干技術方案。
日本專利特公平2-23191號公報中記載了可移植角蛋白組織的膜的製造方法，其特徵為，在角蛋白組織的膜能夠在容器表面上形成的條件下，在培養容器中培養源自人新生兒的角化表皮細胞，使用酶剝離角蛋白組織的膜。具體而言，公開了這樣的技術將3T3細胞作為飼養層使其增殖、多層化，使用作為蛋白質分解酶的分散劑回收細胞片。但是，該公報中所記載的方法具有如下缺點(1)分散劑源自菌，所回收的細胞片必須充分地洗淨。
(2)所培養的每種細胞其分散劑處理條件都不同，而且對該處理必須熟練。
(3)通過分散劑處理來培養的表皮細胞在病理學上被活化。
(4)胞外基質通過分散劑處理被分解。
(5)因此移植了該細胞片的患處易受感染。
除上述的現有技術的缺點之外，作為本發明對象的角膜內皮細胞，還具有如下缺點由於細胞與細胞間的結合不如皮膚細胞強，因此即使使用上述分散劑，培養後也無法作為整張細胞片進行剝離、回收。
另外、在日本專利特願2001-226141號中，在細胞培養支持體上培養前眼部相關細胞，該細胞培養支持體是將相對於水的上限或下限臨界溶解溫度為0～80℃的溫度響應性聚合物覆蓋在基材表面上而成的，根據需要按照常規方法將培養細胞層多層化，通過只改變支持體的溫度剝離所培養的細胞片，由此，製造具有充分強度的細胞片成為可能。但是，考慮到實際所得到的角膜內皮細胞片的成活性、功能，希望能夠進一步改善。
發明內容
本發明以解決上述現有技術的問題為目標。即，本發明的目的在於提供對眼部組織的附著性良好的再生角膜內皮細胞片。另外，本發明的目的在於提供其製造方法及使用方法。
本發明人們為了解決上述課題，從各種角度加以探討，進行了研究開發。其結果發現，在用溫度響應性聚合物覆蓋基材表面的特定條件的細胞培養支持體上，在特定條件下培養角膜內皮細胞，之後，將培養液溫度調節成基材表面的聚合物進行水合的溫度，將所培養的再生角膜內皮細胞片緊密貼合在特定的載體上，一邊抑制細胞片的收縮，一邊將其連同載體一起剝離，由此可以得到對活體組織附著性極其優良的再生角膜內皮細胞片。本發明基於上述認識得以完成。
即，本發明提供一種對前眼部組織的附著性良好、在功能方面具有充分程度的細胞密度的、緊密貼合在載體上的再生角膜內皮細胞片。
另外，本發明提供再生角膜內皮細胞片的製造方法，其特徵為，在用0～80℃的溫度範圍內脫水合的溫度響應性聚合物覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養細胞，之後，(1)將培養液溫度調節成基材表面的聚合物水合的溫度，(2)將所培養的角膜內皮細胞片緊密貼合在載體上，(3)將其連同載體一起剝離。
本發明還提供治療方法，其特徵為，移植上述再生角膜內皮細胞片。
本發明還進一步提供用於治療創傷組織的上述再生角膜內皮細胞片。
圖1表示實施例4中從細胞培養支持體材料剝離的再生角膜細胞片。
圖2表示實施例4中，分別在培養1天後(A)、3天後(B)、7天後(C)、14天後(D)取出培養中的人再生角膜細胞片，對所生成的膠原蛋白IV(上圖)及纖粘連蛋白(下圖)按照常規方法進行染色的結果。
圖3表示實施例4中，對培養4天後的再生角膜細胞片中存在的ZO-1蛋白質進行免疫螢光染色的結果。
圖4表示實施例4中，對得到的剝離途中的人再生角膜細胞片中存在的膠原蛋白IV(左圖)及纖粘連蛋白(右圖)，按照常規方法進行染色的結果。圖中的箭頭表示剝離方向。
圖5表示實施例4中，對剝離後的人再生角膜細胞片進行H/E(Hematoxylin and Eosin)染色的結果(左圖)、對細胞片中存在的膠原蛋白IV(中圖)及纖粘連蛋白(右圖)按照常規方法進行染色的結果。
圖6表示實施例4中得到的人再生角膜細胞片的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。圖中的標記分別表示ECM胞外基質，N核，GC高爾基複合體(Golgi Complex)，M線粒體，EM內質網(Endoplasmic Reticulum)，箭頭部分表示細胞-細胞間結合。
圖7表示用SDS-PAGE法(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳法)確認實施例5、比較例3、4中所示的角膜內皮細胞片表層中存在的蛋白質及參與細胞-細胞間的結合的ZO-1蛋白質的結果。上圖的A表示用考馬斯亮蘭(Coomassie brilliantblue)染色、測定存在於細胞片表層的蛋白質的結果，而下圖的B表示使用抗人ZO-1多克隆抗體染色的結果。圖中的T表示用低溫處理從本發明的細胞培養支持體材料剝離的細胞片的結果，D表示進行分散劑處理而從市售的未被溫度響應性聚合物覆蓋的基材得到的細胞，S表示用刮削法從該市售基材剝離的細胞的分析結果。
圖8表示，對實施例7中得到的剝離前的再生角膜內皮細胞片，用抗兔Na-K ATP酶單克隆抗體進行染色，使Na-K ATP酶泵位點部分染色成綠色，用亞丙基(propidium iodide)使細胞核染色成紅色，使用共焦顯微鏡得到的結果。此時，上圖的A表示從培養細胞片的上方觀察的結果，B是觀察厚度方向的結果。
圖9中的A表示每1個細胞的鈉泵數對於人角膜內皮細胞片內的細胞密度的相關性，圖中的B表示每單位面積的鈉泵數對於細胞密度的相關性。
具體實施例方式
本發明中所使用的代表性的內皮細胞是位於角膜組織內的角膜內皮細胞，但其種類不受任何限制。本發明中，再生角膜內皮細胞片是指，上述各種細胞在培養支持體上被培養成單層狀，之後，從支持體剝離的細胞片。
本發明的再生角膜內皮細胞片在培養時沒有受到以分散劑、胰島素等為代表的蛋白質分解酶的損傷。因此，從基材上剝離的再生角膜內皮細胞片，保持著細胞-細胞間的橋粒結構，結構缺陷少，強度也高。另外，本發明的細胞片在培養時形成的細胞-基材間的基底膜類蛋白質也不會受到酶的破壞。因此，移植時能夠與患處組織良好地粘合，能夠實施效率優良的治療。對以上事實進行具體說明的話，使用胰島素等通常的蛋白質分解酶的情況下，細胞-細胞間的橋粒結構以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質等幾乎無法保持，因而，細胞以各個分開的狀態被剝離。其中，關於作為蛋白質分解酶的分散劑，已知能夠以保持10～60％細胞-細胞間的橋粒結構的狀態剝離細胞片，但由於基本上全部破壞掉細胞-基材間的基底膜類蛋白質等，所以得到的細胞片強度弱。相對於此，本發明的細胞片，其橋粒結構、基底膜類蛋白質皆殘留80％或80％以上，可以得到前述的種種效果。
本發明的再生角膜內皮細胞片在作為活體組織的前眼部組織上能極其良好地成活。我們發現，通過抑制從支持體表面剝離的再生角膜內皮細胞片的收縮能夠實現該性質。此時，再生角膜內皮細胞片的收縮率在細胞片內的任意方向的長度上都希望達到20％或20％以下，優選10％或10％以下，更優選5％或5％以下。若收縮率在細胞片的任意方向的長度上達到20％以上，剝離的細胞片成為鬆弛的狀態，該狀態下附著到活體組織上，也無法緊密貼合在組織上，不能指望本發明所顯示的高成活性。
不使再生角膜內皮細胞片收縮的方法，只要是不讓細胞片收縮的方法就不受任何制約，例如可以舉出，從支持體剝離再生角膜內皮細胞片時，在這些細胞片上緊密貼合切掉了中心部分的環狀載體等，將該載體與細胞片一起剝離的方法等。
使再生角膜內皮細胞片緊密貼合時所使用的載體，是用以保持本發明的細胞片不收縮的結構物，可以使用例如聚合物膜或由聚合物膜成型的結構物、金屬性夾具等。例如，載體的材質使用聚合物時，其具體的材質可以列舉聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯、聚乙烯、纖維素及其衍生物、紙類、幾丁質(chitin)、殼聚糖(chitosan)、膠原蛋白、烏拉坦(urethane)等。
本發明中所謂緊密貼合的情況是指，在細胞片與載體的邊界面上，細胞片在載體上不會錯離也不會移動，以使細胞片不收縮的狀態，可以由物理性的結合而緊密貼合，也可以通過兩者之間存在的液體(例如培養液、其他等滲液)緊密貼合。
載體的形狀不受特別的限制，例如，在移植所得到的再生角膜內皮細胞片時，若使用這樣的載體，即在該載體上切掉了與移植部位同等大小或者比移植部位大的一部分，則細胞片僅僅固定在被切掉部分的周圍，只需將位於切掉部分的細胞片接觸到移植部位就可以，是比較合適的。另外，由於角膜內皮組織位於角膜組織的最內層，也可以使用這樣的移植方法即，將上述的細胞片用細胞片曾與支持體接觸的面的反面固定在夾具上，就那樣地將其插入角膜組織內，設置細胞片。此時夾具的形狀不受特別的限定，例如，具有與活體內的角膜內皮組織的形態同等的曲率的曲面的夾具，在該夾具上設有吸引口以固定細胞片的夾具等，操作簡便、比較合適。
另外，本發明的再生角膜內皮細胞片的特徵對活體組織的高成活性，是在特定的培養條件下實現的。即，本發明的細胞片是在支持體表面上接種再生角膜內皮細胞後經過培養而得到的，而我們明確了在支持體表面上細胞達到鋪滿(充滿的狀態)後起10天以後，優選12天以後，更優選20天以後是令人滿意的。若少於10天，則剝離的再生角膜內皮細胞片的基底膜不充分，因此附著性也降低，無法達到本發明的特徵之一的高成活性。
本發明的再生角膜內皮細胞片是具有角膜內皮組織原有功能的高密度的細胞片。此時的細胞密度為2500個/mm2或其以上，優選為2700個/mm2或其以上，更優選為2900個/mm2或其以上。若細胞密度在2500個/mm2以下，就不能體現充分的鈉泵功能，無法希求本發明的特徵之一的高功能性。
本發明的再生角膜內皮細胞片是具有充分的鈉泵功能的細胞片。我們判明此時的鈉泵位點(Na-K ATP酶泵位點)數在3.4×109個/mm2或其以上，優選在3.8×109個/mm2或其以上，更優選在4.2×109個/mm2或其以上是令人滿意的。若鈉泵位點數在3.4×109個/mm2以下，就不能體現充分的泵功能，無法達到本發明的特徵之一的高功能性。
本發明的再生角膜內皮細胞片，如上所示，是能夠極其良好地附著在活體組織上，並且能夠作為角膜內皮組織充分發揮作用的高密度細胞片，是從現有技術完全無法得到的細胞片。
關於本發明的細胞培養支持體，覆蓋在基材上的溫度響應性聚合物是隨著溫度的變化而發生水合、脫水合的聚合物，其溫度範圍在0～80℃，優選在10℃～50℃，更優選在20℃～45℃。若超過80℃，細胞就有死亡的可能性，因此不優選。另外，若低於0℃，細胞增殖速度通常極度低下，或細胞會死亡，因此也不優選。
本發明中使用的溫度響應性聚合物可以是均聚物、共聚物的任意種。作為這樣的聚合物可以列舉例如日本專利特開平2-211865號公報中記載的聚合物。具體而言，例如，由以下的單體單獨聚合或者共聚得到。可以使用的單體，例如可以列舉(甲基)丙烯醯胺化合物((甲基)丙烯醯胺是指丙烯醯胺和甲基丙烯醯胺。以下也同樣)、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物、或者乙烯基醚衍生物，對於共聚物，可以使用其中任意兩種或兩種以上。另外，也可以使用與上述單體以外的單體類的共聚，聚合物之間的接枝或共聚，或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不損害聚合物原有性質的範圍內進行交聯。
被實施覆蓋的基材，從通常用於培養細胞的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、有機玻璃等化合物開始，到通常能夠賦予形態的物質，例如上述之外的聚合物、陶瓷類等全都可以使用。
溫度響應性聚合物向支持體上覆蓋的方法不受特別的限制，例如，可以按照日本專利特開平2-211865號公報中記載的方法進行。即，可以對基材和上述單體或聚合物，利用電子束照射(EB)、γ射線照射、紫外線照射、等離子處理、電暈處理、有機聚合反應的任意種，或者利用塗布、混煉等物理吸附等進行所述覆蓋。
溫度響應性聚合物的覆蓋量最好是0.4～3.0μg/cm2的範圍，優選0.7～2.8μg/cm2，更優選0.9～2.5μg/cm2。覆蓋量少於0.4μg/cm2時，即使給與刺激，該聚合物上的細胞也難以剝離，操作效率非常差，不優選。反之，覆蓋量在3.0μg/cm2以上時，細胞難以在該區域附著，難以充分附著細胞。
本發明中對支持體的形態沒有特別的限制，例如可以列舉皿、multiplate微孔板、燒瓶、細胞培養小室(Cell Insert)等。
本發明中，細胞的培養是在如上所述製造的細胞培養支持體上進行的。培養基的溫度只要是在覆蓋在基材表面的前述聚合物脫水合的溫度下進行就沒有特別的限制。但是，在導致培養細胞無法增殖的低溫區域、或導致培養細胞死亡的高溫區域中的培養顯然是不合適的。溫度以外的培養條件只要按照常規方法就可以，不受特別的限制。例如，對於使用的培養基，可以是添加有公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培養基，還可以是不添加這類血清的無血清培養基。本發明的方法中，從支持體材料剝離回收所培養的細胞時，將培養的再生角膜內皮細胞片緊密貼合在載體上，通過將附著有細胞的支持體材料的溫度調節成支持體基材的覆蓋聚合物水合的溫度，就那樣地將細胞連同載體一起剝離。此時，也可以在細胞片與支持體之間加上水流，使剝離順利進行。另外，細胞片的剝離可以在培養細胞的培養液中進行，也可以在其它等滲液中進行，可以根據目的進行選擇。
作為溫度響應性聚合物以聚(N-異丙基丙烯醯胺)為例對以上事實進行說明。已知，聚(N-異丙基丙烯醯胺)是在31℃具有下限臨界溶解溫度的聚合物，處於游離狀態時，在水中31℃以上的溫度下發生脫水合，聚合物鏈凝集、產生白色混濁。反之，在31℃以下的溫度下聚合物鏈進行水合，成為溶解於水的狀態。本發明中，該聚合物是覆蓋、固定於培養皿之類的基材表面上的。因此，如果溫度在31℃以上，基材表面的聚合物也同樣發生脫水合，但由於聚合物鏈覆蓋、固定於基材表面，因此基材表面呈疏水性。反之，在31℃以下的溫度下，基材表面的聚合物進行水合，由於聚合物鏈覆蓋、固定於基材表面，因此基材表面呈親水性。此時的疏水性表面是細胞能夠附著、增殖的適當的表面，而親水性表面是細胞無法附著的程度的表面，培養中的細胞或者細胞片也可以僅通過冷卻就能被剝離。
本發明的細胞片中細胞以高密度存在。該製造方法不受特別限定，但由於角膜內皮細胞並不能快速地增殖到高密度，因此例如可以舉出這樣的方法預先進行幾次傳代培養，在達到規定的總細胞數的階段，將所有的細胞接種於規定的面積。此時，為了提高細胞分散液中的細胞濃度可以進行離心分離來濃縮，也可以減少基材的培養面積來增加每單位面積的細胞數。在細胞進行傳代培養時使用的基材不受特別的限定，在例如膠原蛋白IV、膠原蛋白I、膠原蛋白III、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、人工基膜(Matrigel)等的粘著蛋白上培養的話，角膜內皮細胞的形態不會被破壞，比較合適。
接種時，基材的每單位面積的細胞數在2000個/mm2或其以上為宜，優選在2300個/mm2或其以上，更優選2500個/mm2或其以上。在小於2000個/mm2的情況下，很難使得到的再生角膜內皮細胞片的細胞密度達到2500個/mm2或其以上。
在本發明中，將細胞片貼於患處之後，將細胞片從載體剝離就可以。該剝離方法不受任何限制，例如，可以是浸溼載體，使載體與細胞片的緊貼性減弱而剝離的方法；或者也可以是使用手術刀、剪刀、雷射、等離子波等的工具切斷的方法。例如使用上述緊密貼合在被切掉了一部分的載體上的細胞片的情況下，若使用雷射等沿著患處的邊界線切斷，則可避免細胞片附著到患處之外不需要的部分上，是比較合適的。
本發明所示的再生角膜內皮細胞片與活體組織間的固定方法不受特別的限定，可以縫合細胞片與活體組織，或者由於本發明所示的再生角膜內皮細胞片迅速地在活體組織上成活，因此附著於患處的細胞片不與活體一側縫合也可以。
為達到高回收率地剝離、回收再生角膜內皮細胞片的目的，可以單獨使用或者同時使用下述方法或者輕敲或者晃動細胞培養支持體的方法，或用移液器攪拌培養基的方法，在細胞片與基材之間加上水流的方法等。另外，也可以根據需要用等滲液等衝洗培養細胞進行剝離回收。
本發明所示的再生角膜內皮細胞片的用途不受任何限制，例如對角膜內皮損傷、大泡性角膜病變有效。
根據上述方法得到的再生角膜內皮細胞片，與以往的方法得到的細胞片相比，由於在剝離時的非侵襲性方面、並且在高功能方面極為優良，因此強烈期待其作為移植用角膜內皮細胞片的臨床應用。特別是，本發明的再生角膜內皮細胞片與以往的移植細胞片不同，具有與活體組織的高成活性，能極為迅速地在活體組織上成活。可以認為，這是可以提高患處的治療效率、進一步可以減輕患者負擔的極其有效的技術。另外，本發明的方法中所使用的細胞培養支持體可以重複使用。
實施例以下基於實施例進行進一步詳細說明本發明，但這些實施例對本發明沒有任何限定。
實施例1、2在市售的直徑3.5cm細胞培養用培養皿(ベクトン·ディッキンソン·ラブゥェア(Becton Dickinson Labware)公司制、ファルコン(FALCON)3001)上，塗布0.10ml 40wt％(實施例1)、45wt％(實施例2)N-異丙基丙烯醯胺單體的異丙醇溶液。照射0.25MGy強度的電子束，在培養皿表面上使N-異丙基丙烯醯胺聚合物(PIPAAm)固定化。照射後，用離子交換水洗淨培養皿，除去殘餘的單體和未與培養皿結合的PIPAAm，在淨化臺內乾燥，用環氧乙烷氣體滅菌，得到細胞培養支持體材料。PIPAAm的覆蓋量分別為1.6μg/cm2(實施例1)、1.8μg/cm2(實施例2)。
另一方面，根據常規方法在深度麻醉下從白色家兔角膜周邊部分採取角膜內皮組織，使用塗覆了膠原蛋白IV的燒瓶，按照常規方法對該角膜內皮細胞進行5次傳代培養(使用培養基DMEM、10％FCS、37℃、10％CO2下)。其結果，最終能夠回收4×106個角膜內皮細胞。
然後，在上述培養皿表面上固定化PIPAAm而成的培養支持體材料上接種全部上述細胞，就那樣地繼續培養4周。培養後，在所培養的細胞上蓋上載體，所述載體由切除1.8cm直徑圓形的直徑2.3cm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘進行冷卻，兩種細胞培養支持體材料上的細胞皆連同覆蓋在其上的載體一起剝離。得到的細胞片收縮率在5％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。得到的細胞片內的細胞密度為3000個/mm2。
另外，上述各實施例中，「低溫處理」是在20℃下培養30分鐘的條件下進行，本發明中的「低溫處理」不限於這一溫度和時間。本發明中的「低溫處理」優選的溫度條件在0℃～30℃，優選的處理時間為2分鐘～1小時。
將實施例1、2中得到的再生角膜內皮細胞片移植給角膜內皮組織部分缺損的白色家兔。此時，用再生角膜內皮細胞片的曾與支持體接觸的面的反面吸引、固定在夾具上，用手術刀切除載體，所述夾具具有與活體內的角膜內皮組織同等曲率的吸引面。用夾具將再生角膜內皮細胞片推碰到創傷部位，停止夾具的吸引，就那樣地附著15分鐘。此時，並未進行再生角膜內皮細胞片與活體的縫合。最後，按照常規方法，將切開的角膜組織縫合到眼球上。3周後，觀察患處，實施例1、2的再生角膜內皮細胞片都在眼球上良好地成活，並且也沒有觀察到角膜的膨潤。
實施例3將含有N，N-亞甲基雙丙烯醯胺(1wt％/丙烯醯胺單體)的丙烯醯胺單體溶於異丙醇以得到5wt％的溶液。對實施例1的細胞培養支持體，在其上繼續塗布0.10ml該溶液，覆上直徑1.8cm的金屬制掩膜，以這樣的狀態照射0.25MGy強度的電子束，使未覆蓋金屬掩膜部分的丙烯醯胺聚合物(PAAm)固定化。照射後，用離子交換水洗淨培養皿，除去殘餘的單體和未與培養皿結合的PAAm，在淨化臺內乾燥，用環氧乙烷氣體滅菌，得到細胞培養支持體材料。
然後，按照與實施例1同樣的方法，在深度麻醉下從白色家兔角膜周邊部分採取角膜內皮組織，進行4次傳代培養，最終能夠回收7.6×105個角膜內皮細胞。然後，在上述細胞培養支持體材料上接種全部上述細胞，就那樣地繼續培養3周。培養後，與實施例1同樣地在所培養的細胞上蓋上載體，所述載體由切除1.8cm直徑圓形的直徑2.3cm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘進行冷卻，將細胞培養支持體材料上的細胞連同覆蓋在其上的載體一起剝離。得到的細胞片收縮率在5％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。得到的細胞片內的細胞密度為2800個/mm2。
將得到的再生角膜內皮細胞片與實施例1同樣地移植給角膜內皮組織部分缺損的白色家兔。3周後，觀察患處，再生角膜內皮細胞片在眼球上良好地成活，並且也沒有觀察到角膜的膨潤。
比較例1用實施例2製造角膜內皮細胞片，除不使用載體剝離細胞片、產生收縮之外，與實施例2同樣地製造角膜內皮細胞片。此時的收縮率為42％。
與實施例2同樣地將得到的角膜內皮細胞片移植給角膜內皮組織部分缺損的兔子。移植一天後觀察患處，角膜內皮細胞片對眼球的成活性稍差，並且也觀察到角膜的膨潤。
比較例2用實施例3培養角膜內皮細胞，除從細胞培養支持體剝離為止的期間為9天後之外，與實施例3同樣地嘗試製造再生角膜內皮細胞片。嘗試與實施例3同樣地剝離再生角膜內皮細胞片，但只能剝離一部分，不足以作為細胞片。
實施例4對實施例3的覆蓋直徑1.8cm的金屬制掩膜而得到的細胞培養支持體材料，與實施例3同樣地在上述細胞培養支持體材料上接種用與實施例3同樣的方法從人角膜周邊部分採取的角膜內皮細胞，就那樣地繼續培養4周。培養後，使用聚偏二氟乙烯(PVDF)載體，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘進行冷卻，剝離細胞培養支持體材料上的內皮細胞片。得到的內皮細胞片收縮率在5％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。得到的內皮細胞片內的細胞密度為3000個/mm2。圖1表示從得到的內皮細胞片上除去了載體後的細胞片。可知人再生角膜內皮細胞片漂浮在培養支持體材料內。
圖2表示將培養中的人再生角膜內皮細胞片在培養1天後(A)、3天後(B)、7天後(C)、14天後(D)分別取出，按照常規方法將所生成的膠原蛋白IV(上圖)及纖粘連蛋白(下圖)染色的結果。可知隨著培養天數的增加，膠原蛋白IV及纖粘連蛋白蓄積。
對培養4天後的再生角膜細胞片中存在的ZO-1蛋白質進行免疫螢光染色。結果如圖3所示。可知該蛋白質局部存在於細胞-細胞間，從該結果可知本發明中得到的再生角膜內皮細胞片形成了細胞-細胞間的結合，且該形成在剝離後也未被破壞而依然保留。
然後，從培養支持體材料內剝離人再生角膜內皮細胞片。對剝離途中的人再生角膜內皮細胞片中存在的膠原蛋白IV(左圖)及纖粘連蛋白(右圖)用常規方法染色的結果如圖4所示。從該圖也可以知道得到的再生角膜內皮細胞片中具有膠原蛋白IV和纖粘連蛋白。
圖5表示對剝離後的人再生角膜內皮細胞片進行H/E染色的結果(左圖)、對存在於細胞片中的膠原蛋白IV(中圖)及纖粘連蛋白(右圖)用常規方法進行染色的結果。根據H/E染色照片可知本發明中得到的人再生角膜內皮細胞片與在活體內通常的狀態一樣是單層的，膠原蛋白IV局部存在於內皮細胞片曾與支持體相接觸的一側，纖粘連蛋白局部存在於細胞-細胞間。
另外，將同樣地準備的再生角膜細胞片用2％的戊二醛固定，之後用鋨酸染色，用透射電子顯微鏡觀察，結果如圖6所示。從圖也可以知道得到的再生角膜細胞片是與活體內的組織同樣的組織。
實施例5對實施例1中得到的細胞培養支持體材料，與實施例3同樣地在上述細胞培養支持體材料上接種按照與實施例3同樣的方法從人角膜周邊部分採取的角膜內皮細胞，就那樣地繼續培養4周。培養後，不使用聚偏二氟乙烯(PVDF)載體而連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘進行冷卻，從而剝離細胞培養支持體材料上的內皮細胞片。用常規方法抽提出存在於所得到的內皮細胞片表層的蛋白質及參與細胞-細胞間的結合的ZO-1蛋白質等，並用SDS-PAGE法確認。結果如圖7中的T所示。此時，上圖的A用考馬斯亮蘭染色，測定存在於細胞片表層的蛋白質，而下圖的B用抗人ZO-1多克隆抗體染色。由圖7可知，按照本發明的方法，細胞表層的蛋白質不被破壞，依然保留。
比較例3、4在實施例5的實驗中，除人再生角膜內皮細胞的培養是在未覆蓋溫度響應性聚合物的市售的培養基材上培養以外，按照同樣的操作繼續培養4周。培養後，為了剝離培養的細胞，一種方法是按照常規方法，進行分散劑處理來剝離(比較例3)，另一種方法是用橡膠製的刮刀進行物理性剝離的方法(比較例4)。對分別用兩種方法得到的細胞與實施例5同樣地用常規方法抽提出存在於內皮細胞片表層的蛋白質及參與細胞-細胞間的結合的ZO-1蛋白質等，並用SDS-PAGE法進行確認。結果分別如圖7中的D(比較例3)、圖7中的S(比較例4)所示。從圖7可知，用分散劑處理法，細胞表層的蛋白質被破壞，殘餘量變少。另外，用刮削法，儘管細胞表層的蛋白質的殘餘量多，但由於是物理性的剝離，因此得到的角膜內皮細胞片中有多處被切斷，不足以作為本發明所示的再生角膜內皮細胞片。另外，比較圖7的S和T，兩者完全看不出有差別，因此可知由本發明的實施例5得到的再生角膜內皮細胞片的表層蛋白質幾乎沒有被破壞。
實施例6用實施例3得到的剝離前的再生角膜內皮細胞片、以及冷卻剝離後再次附著到市售的直徑3.5cm細胞培養用培養皿(FALCON3001)上的再生角膜內皮細胞片，計算剝離前後每1個細胞的鈉泵數。具體而言，使用作為Na-K ATP酶抑制劑的烏本苷，認為1分子的烏本苷與1分子的Na-K泵結合，通過測定烏本苷的總結合量求得每1個細胞的鈉泵數。此時，烏本苷使用3H標記物，用液體閃爍計數器測定。根據烏本苷對細胞片的總結合量、以及細胞片的細胞密度，計算出實施例3中剝離前後每1個細胞的鈉泵數的結果，剝離前的鈉泵數為3.5×106個，剝離後的鈉泵數為3.5×106個。使用本發明的細胞培養支持體，剝離時沒有看到細胞的損傷。
實施例7對實施例3的覆上直徑1.8cm的金屬制掩膜得到的細胞培養支持體材料，與實施例3同樣地在上述細胞培養支持體材料上接種按照與實施例3同樣的方法從人角膜周邊部分採取的角膜內皮細胞，就那樣地繼續培養4周。對該剝離前的人再生角膜內皮細胞片，用抗兔Na-K ATP酶單克隆抗體進行染色，使Na-K ATP酶泵位點部分染色成綠色。此時，用亞丙基(propidium iodide)將細胞核染色成紅色。圖8表示用共焦顯微鏡得到的結果。此時，上圖的A表示從培養細胞片的上方觀察的結果，B是觀察厚度方向的結果。如圖所示，可知本發明的再生角膜內皮細胞片中高密度地殘留有Na-K ATP酶泵位點部分。
實施例8除以人角膜內皮細胞作為所使用的細胞，且培養至細胞片內的細胞密度達到575個/mm2～3070個/mm2之外，按照與實施例6同樣的方法進行培養操作，與實施例6同樣地用液體閃爍計數器測定3H標記化烏本苷結合量，從而測定Na-K ATP酶泵位點數。根據Na-K ATP酶泵位點數和細胞片的細胞密度，算出剝離的再生角膜內皮細胞片的每1個細胞的鈉泵數。得到的結果如圖9所示。圖中的A表示每1個細胞的鈉泵數對細胞密度的相關性，圖中的B表示每單位面積鈉泵數對細胞密度的相關性。從圖中的A可知當細胞密度增加時，每1個細胞的鈉泵數減少；從圖中的B可知當細胞密度增加時，每單位面積的鈉泵數增加。我們明確了通過使細胞密度成為2500個/mm2，達到本發明的鈉泵位點數。
比較例5將含有N，N-亞甲基雙丙烯醯胺(1wt％/丙烯醯胺單體)的丙烯醯胺單體溶於異丙醇以得到5wt％的溶液。對市售的直徑3.5cm的細胞培養用培養皿(FALCON 3001)，按照與實施例3同樣的方法在其上塗布0.10ml該溶液，覆上直徑1.8cm的金屬制掩膜，以這樣的狀態照射0.25MGy強度的電子束，使未覆蓋金屬掩膜部分的丙烯醯胺聚合物(PAAm)固定化。照射後，用離子交換水洗淨培養皿，除去殘餘的單體和未與培養皿結合的PAAm，在淨化臺內乾燥，用環氧乙烷氣體滅菌，得到實施例3的細胞培養支持體中沒有PIPAAm覆蓋部分的培養用支持體。
使用該培養用支持體，與實施例4同樣地用剝離前的再生角膜內皮細胞片、以及用膠原酶處理進行剝離後再附著到市售的直徑3.5cm的細胞培養用培養皿(FALCON 3001)上的再生角膜內皮細胞片，算出剝離前後的每1個細胞的鈉泵數。計算剝離前後的每1個細胞的鈉泵數的結果，剝離前的鈉泵數為3.5×106個，剝離後的鈉泵數為1.5×106個。剝離時發生的細胞的損傷顯著。
產業上的可利用性本發明得到的再生角膜內皮細胞片對活體組織的成活性極高，並具有高功能，強烈地期待其在例如角膜內皮疾病治療等的臨床應用。因此，本發明是在細胞工學、醫用工學等的醫學、生物學等領域極為有用的。
權利要求
1.再生角膜內皮細胞片，其緊密貼合在載體上。
2.根據權利要求1記載的再生角膜內皮細胞片，所述細胞片未經蛋白質分解酶處理而從支持體剝離，剝離後的細胞片的收縮率保持在20％或20％以下。
3.根據權利要求1或2記載的再生角膜內皮細胞片，其殘留有80％或80％以上基底膜類蛋白質。
4.根據權利要求1～3的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片，其殘留有80％或80％以上橋粒結構。
5.根據權利要求1～4的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片，所述細胞片內的細胞密度為2500個/mm2或其以上。
6.根據權利要求1～5的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片，所述細胞片內的鈉泵位點數為3.4×109個/mm2或其以上。
7.根據權利要求1～6的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片，其用於治療角膜內皮組織的一部分或全部損傷或缺損了的患處。
8.根據權利要求1～7的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片，其剝離的時期是在細胞在支持體表面達到鋪滿後起第10天以後。
9.根據權利要求1～8的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片，其特徵是，治療不是將再生角膜內皮細胞片縫合在患處，而是將再生角膜內皮細胞片覆蓋於患處。
10.根據權利要求1～9的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片，所述細胞片在覆蓋於患處時，按照患處的大小、形狀被切斷。
11.再生角膜內皮細胞片的製造方法，其特徵是，在用0～80℃的溫度範圍內水合力變化的聚合物覆蓋表面而成的細胞培養支持體上培養從組織採取的角膜內皮細胞，培養後，(1)將培養液溫度調節成基材表面的聚合物水合的溫度，(2)將所培養的角膜內皮細胞片緊密貼合在載體上，(3)將其連同載體一起剝離。
12.根據權利要求11記載的再生角膜內皮細胞片的製造方法，其特徵是，從組織採取的角膜內皮細胞通過預先進行多次傳代培養增加總細胞數，使支持體表面的接種細胞濃度最終成為2000個/mm2或其以上，以高密度進行培養。
13.根據權利要求11或12記載的再生角膜內皮細胞片的製造方法，所述傳代培養在膠原蛋白IV上進行。
14.根據權利要求11～13的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片的製造方法，所述聚合物是聚(N-異丙基丙烯醯胺)。
15.根據權利要求11～14的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片的製造方法，其特徵是，所述載體的形狀是切除了中心部分的環狀。
16.根據權利要求11～15的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片的製造方法，所述剝離是未經蛋白質分解酶處理的。
17.一種治療方法，其特徵是，對角膜內皮組織的一部分或全部損傷或缺損的患處，移植權利要求1～8的任意一項記載的再生角膜內皮細胞片。
18.根據權利要求17記載的治療方法，其特徵為，所述移植是(1)將再生角膜內皮細胞片連同載體一起剝離，(2)將細胞片的曾與支持體接觸的面的反面，固定在具有與活體內的角膜內皮組織形態同等的曲率的夾具上進行移植，(3)用曾與支持體接觸的同一面，將再生角膜內皮細胞片覆蓋在患處，之後，去除固定著細胞片的夾具及載體。
19.根據權利要求17記載的治療方法，其特徵為，所述移植是(1)將再生角膜內皮細胞片連同載體一起剝離，(2)將細胞片的曾與支持體接觸的面的反面，固定在具有與活體內的角膜內皮組織形態同等的曲率的夾具上，去除載體，(3)用曾與支持體接觸的同一面，將再生角膜內皮細胞片覆蓋在患處，之後，去除固定著細胞片的夾具。
20.根據權利要求17～19的任意一項記載的治療方法，其特徵是，所述移植不是縫合在患處，而是覆蓋於患處。
21.根據權利要求17～20的任意一項記載的治療方法，其特徵是，覆蓋於患處時，按照患處的大小、形狀切斷再生角膜內皮細胞片。
22.根據權利要求17～21的任意一項記載的治療方法，其特徵是，適合治療的疾病是角膜內皮損傷、大泡性角膜病變。
全文摘要
再生角膜內皮細胞片的製造方法，其特徵是，在用0～80℃的溫度範圍內水合力變化的聚合物覆蓋表面而成的細胞培養支持體上培養從組織採取的角膜內皮細胞，培養後，(1)將培養液溫度調節成基材表面的聚合物水合的溫度，(2)將所培養的角膜內皮細胞片緊密貼合在載體上，(3)將其連同載體一起剝離。利用上述方法得到的再生角膜內皮細胞片對活體組織的附著性極其良好。
文檔編號A61L27/44GK1753696SQ20048000464
公開日2006年3月29日 申請日期2004年2月20日 優先權日2003年2月20日
發明者岡野光夫, 西田幸二, 大和雅之 申請人:創革醫療科技有限公司, 西田幸二