一種評價麥芽脂質氧化程度的方法與流程
2023-07-12 21:26:06 2
本發明涉及啤酒檢測領域，具體的說是一種評價麥芽脂質氧化程度的方法。
背景技術：
新鮮度是評價啤酒可飲性的重要指標，其老化機理極其複雜，包括脂質氧化、胺基酸的Strecker降解、酒花物質的氧化等。其中麥芽中類脂和不飽和脂肪酸氧化產生的反-2-壬烯醛(trans-2-nonenal，T2N)是導致啤酒風味嚴重敗壞、新鮮度下降的重要物質之一，在啤酒中表現為紙板味，閾值僅為0.1μg/L。
脂質氧化以脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)為關鍵酶，研究發現使用高LOX活力麥芽釀造的啤酒T2N含量較高，兩者呈正相關。已有研究表明不同麥芽品種的LOX活力存在較大差異。但單純考慮LOX活力的差異還不足以篩選低脂質氧化麥芽，一方面因為LOX酶是一種熱敏感酶，提高制麥焙焦溫度會大幅度降低LOX活力，但壬烯醛前驅體可能已經生成，仍然會後續影響T2N的生成，也就是說LOX活力高了肯定不好，但LOX活力低了不一定就好，這就需要引入麥芽的T2N和壬烯醛潛力(nonenal potential，NP)指標。
NP代表了壬烯醛前驅體含量，是由T2N和胺基化合物加成產生的，從制麥開始就一直存在於成品麥芽中，糖化過程也是NP形成的重要階段。在發酵階段逐漸降低，但在啤酒貨架期又逐步釋放出遊離T2N，影響啤酒新鮮度。資料報導有將麥芽或麥汁的NP含量作為預測啤酒中T2N或新鮮度的指示因子，但沒有將麥芽的LOX活力、T2N、NP綜合考慮來評價麥芽的脂質氧化程度。
另一方面，因為麥芽本身就是一個複雜的氧化還原系統，例如麥芽為啤酒貢獻了70％～80％的酚類物質，尤其是低分子量的單酚類物質對啤酒抗氧化力貢獻是非常大的；例如金屬離子促進基態氧轉變為活性氧，金屬離子含量高也會大幅度降低啤酒風味穩定性。這些氧化還原物質也會影響脂質氧化的進程。
因此，我們需要全面考慮影響脂質氧化的指標，而不是用單一的指標來評價麥芽的脂質氧化程度。而目前沒有一種可以全面評價麥芽脂質氧化程度的方法。
技術實現要素：
根據上述不足之處，本發明的目的在於提供一種可以全面評價麥芽脂質氧化程度的方法。
為實現上述目標，本發明的技術方案在於：一種評價麥芽脂質氧化程度的方法，選取促進脂肪氧合酶酶促反應的物質的含量、抑制脂肪氧合酶酶促反應的物質的含量、反-2-壬烯醛含量和壬烯醛前驅體含量以及脂肪氧合酶活力作為評價因素，建立麥芽脂質氧化綜合評價體系。
優選的是：所述的促進脂肪氧合酶酶促反應的物質為阿魏酸、兒茶酸和咖啡酸；所述的抑制脂肪氧合酶酶促反應的物質為Mg離子、Fe離子、Na離子、K離子、Ca離子。
優選的是：選定阿魏酸含量X1、兒茶酸含量X2、咖啡酸含量X3、Mg離子含量X4、Fe離子含量X5、Na離子含量X6、K離子含量X7、Ca離子含量X8、脂肪氧合酶活力X9、反-2-壬烯醛含量X10和壬烯醛前驅體含量X11作為脂質氧化綜合評價的指標，通過主成分分析，建立脂質氧化綜合評價體系，即脂質氧化綜合評價指標得分LOI＝PC1-(1.885×PC2+1.66×PC3+1.453×PC4)/(1.885+1.66+1.453)；
其中，PC1＝-0.688×X1+0.966×X2+0.688×X3；
PC2＝1.011×X9+0.934×X10+0.452×X11-0.107×X4+0.608×X5+0.511×X6-0.819×X7+0.357×X8；
PC3＝-0.039×X9-0.022×X10+1.002×X11-0.306×X4-0.85×X5+0.084×X6+0.336×X7+0.905×X8；
PC4＝-0.391×X9+0.401×X10+0.185×X11+0.925×X4+0.232×X5-0.797×X6-0.17×X7+0.455×X8；
根據麥芽樣品LOI得分的數值範圍判斷麥芽的脂質氧化程度，將麥芽分為三個等級，當LOI≥1時，判定麥芽脂質氧化很輕，麥芽新鮮；當-1＜LOI＜1時，判定麥芽脂質氧化較重，麥芽一般老化；當LOI＜-1時，判定麥芽脂質氧化很嚴重，麥芽嚴重老化。
優選的是：所述的X1是測定麥芽乾燥粉末；所述的X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10和X11是測定麥芽汁。
優選的是：所述麥芽汁的處理方法為：將麥芽磨成細粉，料水比為1:5，50℃休止40min，升溫到65℃，保持60min，升溫到76℃後，5000rpm離心10min，得到的上清液即麥芽汁。
本發明的有益效果在於：
1、本發明綜合考慮，選取了影響麥芽脂質氧化程度的多個影響因素，建立了一個全面的評價體系用於評判麥芽的脂質氧化程度，從而可以提前預測啤酒的新鮮度，對於保證啤酒品質至關重要；
2、本發明不僅可用於評價單個麥芽樣品的脂質氧化程度，還可以對不同麥芽品種進行宏觀分析，研究品種間的差異；
3、目前由於生產中使用的原料存在質量波動，對啤酒的新鮮度造成一定的壓力。通過檢測原料麥芽的多項脂質氧化相關指標，進行脂質氧化綜合評價，針對脂質氧化程度較高的麥芽，採取多項措施進行調整，一是合理搭配麥芽配方比例，與脂質氧化程度低的麥芽搭配使用，二是儘快使用，低溫儲藏，降低氧化程度，三是調整麥汁製備工藝如嚴格控制充氧條件等，穩定麥汁、發酵液的反-2壬烯醛含量，從而降低下遊新鮮度控制的壓力，保證了產品質量。
附圖說明
圖1為還原物質對LOX酶促反應的影響；
圖2為金屬離子對LOX酶促反應的影響；
圖3為不同麥芽品種的LOX活力，T2N、NP含量對比；
圖4為不同麥芽品種的單酚物質含量對比；
圖5為不同麥芽品種的Mg、K離子含量對比；
圖6為不同品種麥芽的Fe、Na、Ca離子含量對比；
圖7為不同麥芽品種脂質氧化指標的判別分析；
圖8為不同麥芽品種的正向脂質氧化指標的評價得分；
圖9為不同麥芽品種的負向脂質氧化指標的評價得分；
圖10為不同麥芽的脂質氧化綜合評價指標得分。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
單酚物質的測定方法為：麥汁經0.22μm濾膜過濾後直接進樣檢測。進樣量10μL，流動相為0.01％三氟乙酸水溶液和乙腈混合液，進行梯度洗脫。柱溫：30℃，在210nm下檢測兒茶酸含量，在322nm下檢測咖啡酸和阿魏酸含量。
金屬離子的測定方法為：取10mL樣品到聚四氟乙烯複合材料(TFM)消解罐中，加入5mL濃硝酸(68％)，加蓋置於微波消解儀中消解，消解完成冷卻後去蓋，消解液及衝洗液轉移至25mL容量瓶中，用去離子水定容待測，稀釋2.5倍，採用外標法定量。
脂肪氧合酶(LOX)活力的測定方法為：取5g麥芽細粉加入5mL醋酸緩衝液(pH 5.0)於水浴中低溫提取，10000rpm離心10min後獲得粗酶液。在25℃水浴條件下，向2.9mL磷酸緩衝液(pH8.5)中加入50μL粗酶液和50μL亞油酸底物進行反應，反應4min後測定234nm下的吸光度，同時做空白對照。將吸光度在單位時間內的變化率定義為一個酶活力單位(U/g)。
反-2-壬烯醛的測定方法為：採用SPME-GC-MS柱上衍生技術，GC條件：色譜柱DB-5MS，使用氦氣為載氣，流速為1mL/min。進樣口溫度為250℃。無分流進樣。程序升溫：初始溫度為60℃，保持2min後以5℃/min的速率升溫至180℃；接著以1℃/min的速率升溫至190℃；以30℃/min的速率升溫至250℃，保持3min。MS條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量為70eV，GC-MS接口溫度為250℃；離子源溫度為230℃；四極杆溫度為150℃；掃描範圍為50～550amu。麥汁稀釋10倍，加入2g NaCl，使用50μL對氟苯甲醛作為內標，測定反-2-壬烯醛含量。
壬烯醛前驅體含量的測定方法為：用磷酸將麥汁pH調到4.0，通入氬氣以排除空氣，加入50μL內標對氟苯甲醛和2g NaCl，沸水浴加熱2h，冷卻後測定反-2-壬烯醛含量，乘以稀釋倍數換算為壬烯醛前驅體含量。
數據統計分析方法為：採用SPSS 17.0軟體對所有試驗數據進行方差分析、Pearson相關性分析、判別分析、主成分分析。
單酚標準品(阿魏酸、兒茶酸、咖啡酸)：美國Sigma公司；
還原型穀胱甘肽、維生素C、反-2-壬烯醛、亞油酸、對氟苯甲醛、乙腈(HPLC級)、三氟乙酸：美國Sigma公司；
金屬元素標準品：德國Merck公司；
硝酸：Up級，蘇州晶銳化學試劑公司；
其它試劑：生工生物工程(上海)股份有限公司。
Ultrospec 2100pro紫外分光光度計：美國GE公司；
高壓液相色譜HPLC：美國Waters公司；
iCAP6300電感耦合等離子體光譜儀：美國ThermoFisher公司；
MarsXpress微波消解儀：美國CEM公司；
Integral 5純水系統：美國Millipore公司；
Clarus600GC-MS：美國PerkinElmer公司；
固相微萃取自動進樣器：瑞士CTC公司；
65μm PDMS-DVB固相微萃取纖維：美國Supelco公司；
DB-5ms(60m×320μm×0.25μm)色譜柱：美國Agilent公司。
實施例1
一種評價麥芽脂質氧化程度的方法，選取促進脂肪氧合酶酶促反應的物質的含量、抑制脂肪氧合酶酶促反應的物質的含量、反-2-壬烯醛含量和壬烯醛前驅體含量以及脂肪氧合酶活力為評價因素，建立麥芽脂質氧化綜合評價體系。
具體的說，選擇還原效果較好的3種單酚物質(阿魏酸、兒茶酸、咖啡酸)和兩種其它還原物質(還原型穀胱甘肽、維生素C)，向亞油酸與LOX的模擬反應體系中，分別單獨添加後，與空白對照比較5min內吸光值的變化量，根據變化量計算降低比例，考察對LOX酶促反應的抑制效果。結果如圖1所示，5種還原物質對脂質酶促反應的抑制效果：阿魏酸＝兒茶酸＝咖啡酸＞Vc＞還原型穀胱甘肽。阿魏酸、兒茶酸、咖啡酸的抑制率達100％。表明這3種單酚物質能明顯抑制LOX的酶促氧化作用。因此，選定阿魏酸含量、兒茶酸含量和咖啡酸含量這三個因素作為促進脂肪氧合酶酶促反應的因素。
向亞油酸與LOX的模擬反應體系中，分別加入FeCl3、FeSO4、CaCl2、MgCl2、KCl、NaCl，與空白對照比較5min內吸光值的變化量，根據變化量計算增長比例，考察6種金屬離子對LOX酶促反應的催化效果。結果如圖2所示，金屬離子對LOX酶促反應的催化效果為：Mg2+＞Fe3+＞Fe2+＞Na+＞K+＝Ca2+。Mg2+離子、Fe3+離子、Fe2+離子的催化效果明顯，吸光值增長率分別達到69％，65％，50％，表明Mg、Fe離子能顯著催化加速LOX酶降解亞油酸。而另外3類離子均有一定程度的促進作用，所以選定Mg離子含量、Fe離子含量、Na離子含量、K離子含量和Ca離子含量這五個因素作為抑制脂肪氧合酶酶促反應的因素。
最終選定阿魏酸含量X1、兒茶酸含量X2、咖啡酸含量X3、Mg離子含量X4、Fe離子含量X5、Na離子含量X6、K離子含量X7、Ca離子含量X8、脂肪氧合酶活力X9、反-2-壬烯醛含量X10和壬烯醛前驅體含量X11作為脂質氧化綜合評價的指標，對11項脂質氧化綜合評價的指標進行標準化處理，通過主成分分析，建立脂質氧化綜合評價體系，即脂質氧化綜合評價指標得分LOI＝PC1-(1.885×PC2+1.66×PC3+1.453×PC4)/(1.885+1.66+1.453)；
其中，PC1＝-0.688×X1+0.966×X2+0.688×X3；
PC2＝1.011×X9+0.934×X10+0.452×X11-0.107×X4+0.608×X5+0.511×X6-0.819×X7+0.357×X8；
PC3＝-0.039×X9-0.022×X10+1.002×X11-0.306×X4-0.85×X5+0.084×X6+0.336×X7+0.905×X8；
PC4＝-0.391×X9+0.401×X10+0.185×X11+0.925×X4+0.232×X5-0.797×X6-0.17×X7+0.455×X8；
根據麥芽樣品LOI得分的數值範圍判斷麥芽的脂質氧化程度，將麥芽分為三個等級，當LOI≥1時，判定麥芽脂質氧化很輕，麥芽新鮮；當-1＜LOI＜1時，判定麥芽脂質氧化較重，麥芽一般老化；當LOI＜-1時，判定麥芽脂質氧化很嚴重，麥芽嚴重老化。
其中，X1是測定麥芽乾燥粉末；通過EBC粉碎機得到；X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10和X11是測定麥芽汁。
麥芽汁的處理方法為：將麥芽磨成細粉，料水比為1:5，50℃休止40min，升溫到65℃，保持60min，升溫到76℃後，5000rpm離心10min，得到的上清液即麥芽汁。
實施例2
採集來自全國不同麥芽廠的37個麥芽樣品，包括6個品種，其中加麥Copeland 10個，加麥Metcalfe 3個，澳麥Gairdner 9個，澳麥Scope 3個，澳麥Bass 3個，國麥甘啤9個。分析不同麥芽品種在脂質氧化相關指標(3種單酚物質、5種金屬離子、LOX活力、T2N、NP)上的分布特點，指標之間的相關性，品種之間是否有明顯差異，並採用本脂質氧化綜合評價體系進行評價，進一步說明本脂質氧化綜合評價體系的重要性。
一、單因素試驗及分析
(1)分析不同麥芽品種的脂質氧化指標分布特點
採用SPSS中的箱圖對比分析37個麥芽樣品的11項指標含量，如圖3-6所示。
如圖3所示的不同麥芽品種的LOX活力，T2N、NP含量對比圖可知，加麥Metcalfe、澳麥Scope的LOX活力普遍較低，都在10U/g以下。對於其它麥芽品種，在同一品種內的LOX活力差異都較大，離散程度大，如澳麥Gairdner的最小值為0.91U/g，最大值為20.65U/g。甘啤的LOX活力普遍較高一些，為7.72～27.83U/g。甘啤和加麥Copeland的T2N含量較高，澳麥Bass的含量較低，T2N總範圍為2.06～23.69μg/L。加麥Copeland、澳麥Gairdner和甘啤的NP含量都較高，且在同一品種內，離散程度較大，如澳麥Gairdner的NP含量從11.10～48.14μg/L。
如圖4所示的不同麥芽品種的單酚物質含量對比圖可知，其中，圖中咖啡酸含量＝實際含量×10。加麥Metcalfe和Copeland的阿魏酸含量較高，兒茶酸、咖啡酸含量較低。澳麥Scope的三種單酚含量都較低，但比較集中。而澳麥Gairdner、加麥Copeland和甘啤的阿魏酸離散程度較大。
如圖5所示的不同麥芽品種的Mg、K離子含量對比圖可知，Mg離子含量範圍在85～114mg/L，其中澳麥Bass的Mg離子較低，都在100mg/L以下；澳麥Scope的Mg離子較高；甘啤、澳麥Gairdner的離散程度較大。加麥Metcalfe的K離子含量較高，澳麥Bass的較低，澳麥Gairdner、加麥Copeland的離散程度較大。
如圖6所示的不同麥芽品種的Fe、Na、Ca離子含量對比圖可知，加麥Copeland和Metcalfe的Fe離子含量較高，澳麥Gairdner的較低，其中，圖中Fe含量＝實際含量×100。除了澳麥Bass和澳麥Scope外，其餘四個麥芽品種的Fe離子離散程度都較大。甘啤和加麥Metcalfe的Na離子含量較低，澳麥Gairdner和加麥Copeland的Na離子離散程度較大。加麥Metcalfe的Ca離子含量較低，澳麥Gairdner和甘啤的Ca離子離散程度較大。
從不同麥芽品種的脂質氧化指標分布情況來看，分布離散，不存在一定的規律性，因此，通過測定某一麥芽的某一項指標，從而來判斷其脂質氧化程度是不合理，也是不合適的。
(2)方差分析
以品種為組，對所有數據進行單因素方差分析，分析組間多項指標之間是否有顯著差異。
如表1所示，不同麥芽品種的T2N、阿魏酸、兒茶酸、咖啡酸、Mg離子、K離子、Ca離子含量之間存在非常顯著的差異(P＜0.01)，NP含量、Fe離子之間存在顯著差異(P＜0.05)，而LOX活力、Na離子含量之間沒有顯著差異(P＞0.05)。
表1不同麥芽品種脂質氧化指標的單因素方差分析
註：*顯著性水平為0.05，**顯著性水平為0.01
從上述分析可知，不同麥芽品種之間的各項指標的顯著性差異各異，也就是說，同一品種的不同樣本的麥芽，其各項指標之間存在較大的差異，無法通過測定一個品種的麥芽來推測其不同樣品的脂質氧化程度。
(3)Pearson相關性分析
使用SPSS軟體對所有數據進行Pearson相關性分析，如表2所示。結果顯示T2N含量與LOX活力正相關，與兒茶酸負相關，分析可能原因，T2N主要來自LOX酶反應途徑，兒茶酸是主要的抑制因子。NP含量與Ca離子正相關，與LOX沒有顯著相關性，分析原因，LOX途徑產生的T2N中大部分仍然以游離狀態存在，而小部分參與到NP的生成中，與胺基結合為加合物。此處的T2N、NP是將麥芽在糖化條件下做成麥汁，測定的麥汁中的含量，沒有涉及到煮沸，除了糖化外，煮沸階段也是影響NP生成的重要階段。所以說，加工工藝的不同階段對於其各項指標的影響較大，因此無法通過測定某一階段的某項指標來推定其麥芽脂質氧化程度。
表2不同麥芽品種脂質氧化指標的Pearson相關性分析
(4)判別分析
使用SPSS軟體對所有數據進行判別分析，以判別麥芽的分類狀況，如圖7所示。加麥Copeland、加麥Metcalfe和國麥甘啤的區域聚在一起，沒有明顯分開，表明這三個品種在11項脂質氧化指標上比較接近；澳麥Scope和澳麥Bass的區域接近；澳麥Gairdner與其它品種距離較大，表明澳麥Gairdner在脂質氧化指標上與其它品種有顯著差異。
二、脂質氧化綜合評價體系
麥芽脂質氧化指標較多，相關性造成評價信息相互影響，難以客觀反映各個麥芽品種脂質氧化水平的大小。運用主成分分析構建脂質氧化綜合評價指標，用於評價麥芽的脂質氧化能力，根據綜合評價值對於不同的麥芽品種進行排序，篩選低脂質氧化的麥芽品種。
首先對原始數據變量進行標準化處理，然後對影響脂質氧化的正向變量和負向變量分別進行降維與主成分提取。
從3個正向變量(阿魏酸、兒茶酸、咖啡酸)中提取出特徵值大於1的一個主成分PC1，用1個新變量代替原來的3個變量。通過公式PC1＝-0.688×X1+0.966×X2+0.688×X3，根據成分矩陣、因子得分、方差等計算出各麥芽品種的正向主成分得分，如圖8所示。三種澳麥的正向指標主成分得分都較高，表明澳麥中酚類物質對脂質氧化有著明顯的抑制作用，其中澳麥Gairdner雖然離散度較大，但整體得分最高。而甘啤、兩種加麥的正向指標主成分得分較低，表明在這三種麥芽中，酚類物質作用較小。
從8個負向變量(LOX活力、T2N、NP、Mg、Fe、K、Na、Ca)中提取出特徵值大於1的主成分有三個PC1、PC2和PC3，用3個新變量代替原來的8個變量。通過下述3個公式：
PC2＝1.011×X9+0.934×X10+0.452×X11-0.107×X4+0.608×X5+0.511×X6-0.819×X7+0.357×X8
PC3＝-0.039×X9-0.022×X10+1.002×X11-0.306×X4-0.85×X5+0.084×X6+0.336×X7+0.905×X8
PC4＝-0.391×X9+0.401×X10+0.185×X11+0.925×X4+0.232×X5-0.797×X6-0.17×X7+0.455×X8
根據成分矩陣、因子得分、方差等計算出各麥芽品種的三個負向主成分得分，求和後得到綜合負向主成分得分，通過公式，負向綜合評價指標得分＝(1.885×PC2+1.66×PC3+1.453×PC4)/(1.885+1.66+1.453)計算，如圖9所示。負向主成分得分越高，表明負向指標對脂質氧化的促進作用越大，此麥芽品種的脂質氧化程度高。甘啤的綜合負向主成分得分最高，表明甘啤中的負向指標對脂質氧化的促進作用最大。其次是加麥Copeland，負向主成分得分較高，其離散程度也較大。三種澳麥和加麥Metcalfe的負向主成分得分較低，表明對脂質氧化作用較小。
按照正向主成分得分越高越好，負向主成分越低越好，建立脂質氧化綜合評價指標，綜合評價指標得分＝正向主成分得分-負向主成分得分＝(-0.688×X1+0.966×X2+0.688×X3)-(1.885×PC2+1.66×PC3+1.453×PC4)/(1.885+1.66+1.453)
根據麥芽的正向和負向主成分得分中位值，粗算麥芽的脂質氧化綜合評價得分，參見圖10，結果顯示低脂質氧化麥芽排序為澳麥Bass＞澳麥Gairdner＞澳麥Scope＞加麥Metcalfe＞加麥Copeland＞甘啤。兩個加麥和甘啤較接近，這與判別分析的結果相一致。
實施例3
選擇A、B、C三個麥芽樣品，測定其11項脂質氧化指標，計算其脂質氧化綜合評價指標得分。用這三個麥芽進行啤酒釀造小試試驗，將得到的啤酒在35℃下放置7天，測定強化啤酒中的T2N含量。對比數據參加表3。
表3為三個麥芽樣品通過本發明方法預測的老化程度以及與小試試驗的對比情況
從上表可知，通過本發明方法計算得到的A麥芽LOI值最高，為3.23，高於1，說明麥芽脂質氧化很輕，麥芽新鮮。通過此麥芽進行釀造試驗，得到的啤酒經過強化試驗，檢測強化啤酒中的T2N含量為0.08g/L，低於閾值0.1μg/L，說明啤酒新鮮，沒有紙板味。而C麥芽LOI值最低，為-2.87，說明麥芽脂質氧化很嚴重，麥芽嚴重老化。通過此麥芽進行釀造試驗，得到的啤酒經過強化試驗，檢測強化啤酒中的T2N含量為0.29g/L，高於閾值0.1μg/L，說明啤酒不新鮮，有很強紙板味。B麥芽LOI值介於A麥芽和C麥芽之間。這說明，通過本脂質氧化綜合評價的結果與實際應用的結果一致，說明本脂質氧化綜合評價的有效性強。
實際生產過程中，通過分析麥芽的脂質氧化綜合評價指標得分，評估麥芽脂質氧化程度，然後採取應對措施如合理搭配麥芽配方比例、調整糖化工藝等，來控制麥汁T2N含量，從而保證啤酒的新鮮程度。此方法適用於不同來源的麥芽，可以大大降低產品風險，有效提升啤酒品質。