2,4-二甲氧基反式茋的新用途的製作方法

2023-07-13 14:35:16

專利名稱：2,4-二甲氧基反式茋的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及2，4_ 二甲氧基反式芪的新用途，特別是2，4_ 二甲氧基反式芪在降脂 及抗老年痴呆中的用途。
背景技術：
心腦血管疾病是威脅全人類健康與生命的頭號殺手。在中國，每年大約有260 萬人死於心腦血管疾病，且發病率仍不斷上升。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)可 以引起冠心病、腦卒中、心肌梗死等病症。在動脈粥樣硬化的發病機理中，高脂血症是一 個主要的獨立危險因素。高脂血症是指血液中的總膽固醇(total cholesterol, TC), 低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholestero，LDL-C)及甘油三酯水平 (triglyceride,TG)高於正常範圍及/或高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平低下1_2，脂質代謝紊亂尤其是低密度脂蛋白水平增高可引起血粘 稠度增高，血流緩慢，血液中過多的脂質沉積於血管壁，形成粥樣斑塊，導致動脈粥樣硬化 的發生。腦部動脈硬化可引起腦血栓或腦溢血；心臟冠狀動脈硬化可引起心慌、胸悶，嚴重 者可導致心肌梗塞。所以控制高脂血症的發生對於預防心腦血管疾病有著重要意義3_4。阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)是一種最常見的痴呆症，影響到全球 1500萬人口生活質量。隨著生命周期的延長，到2050年，大約25%的西半球人年齡超過65 周歲，而其中1/3的人口將會發展為老年痴呆5。在中國，人口老齡化問題也日益突出，所以 面臨同樣的挑戰。老年痴呆發病期長，護理費用高，給家庭和社會帶來沉重負擔。目前臨床 用於治療AD的藥物主要為膽鹼酯酶抑制劑，此類藥物雖然能改善症狀，但不能改變AD的發 病進程，因此，開發抗AD藥物迫在眉睫。此外，越來越多的證據證實，老年痴呆(AD)與高膽固醇血症有著密切的關係6_8， 流行病學研究也發現，血清中膽固醇的水平升高會增加神經退行性痴呆的發病風險9_1(1。例 如，載脂蛋白E的ε 4表型是AD的重要危險因子，載脂蛋白E ε 4表型與血清中膽固醇高低 密切相關「。另外，早老痴呆患者腦脊液中24s-羥基膽固醇水平明顯比同年齡段的正常人 高12_13，24s-羥基膽固醇是一種只可能在腦組織中由膽固醇代謝生成的產物14，提示早老痴 呆患者腦中膽固醇可能比同年齡段的正常人高。2，4-二甲氧基反式芪最早合成於1956年15。現有技術中僅有少數文獻報導過2， 4-二甲氧基反式芪類似物的一些活性，例如美國專利申請公開號US2007/0249647 Al公開 通式I的反式芪化合物參與抑制癌症和癌前病變、炎症、中風、局部缺血，且這些化合物都 有抗氧化活性。Heynekamp J. J.等人16報導反式芪(包括天然產物白藜蘆醇及其衍生物) 具有抑制腫瘤壞死因子α (TNFa)對NF-κΒ的激活作用。Ali MA.等人17報導羥基芪類 具有殺線蟲活性。經查現有技術文獻，未見2，4-二甲氧基反式芪關於降脂和抗老年痴呆活性的報 導。

發明內容
本發明的目的是尋找並開發2，4_ 二甲氧基反式芪(以下簡稱S3)的醫藥新用途。本發明首次採用在高脂大鼠側腦室注射A β建立AD模型，驗證S3的抗AD作用，復 制了老年痴呆患者同時伴有高膽固醇血症的自然發病環境。本發明人經研究發現，2，4-二 甲氧基反式芪具有降脂和抗老年痴呆的良好前景。本發明第一方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在製備治療高脂血症的藥物中的用 途。本發明第二方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在製備治療老年痴呆的藥物中的用 途。本發明第三方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在製備治療老年痴呆同時伴有高脂血 症的藥物中的用途。本發明第四方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在製備預防由高脂血症導致的老年痴 呆的藥物中的用途。進一步，本發明提供含有2，4_ 二甲氧基反式芪以及藥學上可接受的載體的藥物 組合物在製備治療高脂血症的藥物中的用途、治療老年痴呆的藥物中的用途、在製備治療 老年痴呆同時伴有高脂血症的藥物中的用途和在製備預防由高脂血症導致的老年痴呆的 藥物中的用途。本發明藥物組合物中的載體包括稀釋劑、吸收劑、溼潤劑、粘合劑、崩解劑、崩解抑 制齊 、吸收促進劑、潤滑劑、分散劑、助溶劑、緩衝劑、表面活化劑。本發明所述的藥物或藥物組合物是以片劑、注射劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉 劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑的形式使用。本發明所述的藥物或藥物組合物經靜脈、口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮膚、 腹腔、直腸給予。2，4_ 二甲氧基反式芪可依據本發明的方法製備，也可根據現有技術所述的方法制 備。用於此目的時，如果需要，可將2，4-二甲氧基反式芪與一種或多種固體或液體藥物賦 形劑和/或輔劑結合，製成可作為人用藥使用的適當的施用形式或劑量形式。2，4_ 二甲氧基反式芪或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可 為腸道或非腸道，如靜脈、口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒 劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其它劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混 懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑等。2，4_ 二甲氧基反式芪可以製成普通製劑、也可以是緩釋製劑、控釋製劑、靶向製劑 及各種微粒給藥系統。為了將單位給藥劑型製成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體 的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如澱粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄 糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、矽酸鋁等；溼潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、 乙醇、丙醇、澱粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、 紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如乾燥澱粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、 褐藻澱粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基
4纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收 促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化矽、玉米澱粉、硬脂 酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。其它載體如聚丙稀酸樹脂類、脂質體，水溶性載體如 PEG4000和PEG6000、PVP等。還可以將片劑進一步製成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、 腸溶包衣片，或雙層片和多層片。例如為了將給藥單元製成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體 的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷 酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或麵糊等； 崩解劑，如瓊脂粉、乾燥澱粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。例如為了將給藥單元製成膠囊，將有效成分2，4-二甲氧基反式芪與上述的各種 載體混合，並將由此得到的混合物置於硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將2，4_ 二甲氧基反 式芪製成微囊劑，混懸於水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中應用。例如，將2，4_ 二甲氧基反式芪製成液體製劑，如溶液劑、混懸劑、溶液劑、乳劑，這 種製劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學上可接受的載體、稀釋劑、粘合 劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二 醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。此外，還可以添 加常規的助溶劑、緩衝劑、PH調節劑等。這些輔料是本領域常用的。此外，如果還需要，也可以向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味 劑或其它材料。為達到用藥目的，增強治療效果，2，4-二甲氧基反式芪製成的藥物或藥物組合物 可用任何公知的給藥方法給藥。2，4_ 二甲氧基反式芪、含有它的藥物組合物的給藥劑量取決於許多因素，例如所 要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應，給 藥途徑、給藥次數、治療目的，因此本發明的治療劑量可以有大範圍的變化。一般來講，本發 明中化學成分的使用劑量可以根據2，4_ 二甲氧基反式芪組合物中最後的製劑中所含有的 化合物實際數量，加以適當的調整，以達到其治療有效量的要求，完成本發明的治療目的。 通常人用每天的劑量不超過lg。


圖1 :S3對側腦室注射Αβ25_35$導神經損傷模型小鼠海馬細胞凋亡的影響(圖中 箭頭所示)。a 對照組；b 模型組；c :S3 (50) ；d :S3 (25)。圖2 :S3對高脂+側腦室注射Αβ25_35神經損傷大鼠跳臺實驗潛伏期的影響。均數 士標準差(η = 10) ;，<0.01化對照齊<0.05化高脂+側腦室注射六325_35神經損傷 模型組。圖3 :S3對高脂+側腦室注射Αβ25_35神經損傷大鼠跳臺實驗錯誤次數的影響。均 數士標準差(η = 10) ；##Ρ < 0. Olvs對照；*P < 0. 05vs高脂+側腦室注射A β 25_35神經損 傷模型組。 圖4 :S3對高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型大鼠海馬細胞凋亡的影響(圖 中褐色團塊)。A 對照組；B 高脂組；C 高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型組；D :S350mg/kg；E :S3 25mg/kg；F :S3 12.5mg/kg。圖5 :S3對高脂+側腦室注射々025_35神經損傷模型大鼠海馬SOD酶活性的影響。 均數士標準差(η = 6)卞<0.05^對照組，乍<0.05^高脂+側腦室注射4 025_35神經 損傷模型組。圖6 :S3對高脂+側腦室注射Αβ 25_35神經損傷模型大鼠海馬GSH-PX酶活性的影 響。均數士標準差(η = 6) ；##P<0.01vs對照組廣P<0.01vs高脂+側腦室注射Αβ25_35 神經損傷模型組。圖7 :S3對高脂+側腦室注射Αβ 25_35神經損傷模型大鼠海馬丙二醛(MDA)含量 的影響。均數士標準差(η = 6) ；##Ρ < 0. Olvs對照組，**Ρ < 0. Olvs高脂+側腦室注射 Αβ25_35神經損傷模型組。圖8 :S3對高脂+側腦室注射Aβ 25_35神經損傷模型大鼠海馬乙醯膽鹼轉移酶 (ChaT)活性影響。均數士標準差(η = 6) 』##Ρ < 0. Olvs對照組，**Ρ < 0. Olvs高脂+側 腦室注射A β 25_35神經損傷模型組。圖9 :S3對高脂+側腦室注射々025_35神經損傷模型大鼠海馬乙醯膽鹼酯酶(AchE) 活性影響。均數士標準差(η = 6) ；-P < 0. Olvs對照組,P < 0. 05vs高脂對照；*P < 0. 05vs 高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型組。圖10 :S3對高脂+側腦室注射々025_35神經損傷模型大鼠海馬乙醯膽水平的影響。 均值均數士標準差(η = 6) ；##Ρ < 0. Olvs對照組·，Ρ < 0. 05vs高脂對照；*P < 0. 05vs高 脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型組。圖11 :S3對細胞色素C(Cyto-C)釋放的影響。分離線粒體和胞漿後，胞漿部分採 用WB檢測細胞色素C的釋放。均數士標準差(η = 3) ；##Ρ < 0.01, _Ρ < 0. Olvs對照； ■P < 0. Olvs高脂對照，**Ρ < 0. Olvs模型組。圖12 :S3對高脂大鼠血清總膽固醇(TC)的影響。均數士標準差；##P < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05vs高脂模型組。圖13 :S3對高脂模型大鼠血清中高密度脂蛋白(HDL-C)的影響。均值士標準差； flflP < 0. Olvs對照組廣P < 0. Olvs模型組。圖14 :S3對高脂模型大鼠血清低密度脂蛋白(LDL-C)的影響。均數士標準差；##P < 0. Olvs對照組；*P < 0. 05vs模型組。圖15 :S3對A β 25_35誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響。將細胞與不同濃度的A β 25_35 共同孵育48小時，MTT方法檢測細胞活力。< 0. Olvs對照組。圖16 S3對A β 25_35損傷SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。細胞加入S3 IOmin後， 再加入 Αβ 25_35 共同孵育 48h。##P < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05vs Αβ 25_35 組。圖17 :S3對Αβ25_35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響。細胞在50 μ mo 1/L Αβ25_35 作用下加入S3 48h後。圖18 :S3對A β 25_35誘導SH-SY5Y細胞產生活性氧(ROS)的影響。細胞中加入S3， IOmin後，再加入A β 25_35共同孵育48h，經H2DCF-DA探針染色後，通過螢光比色法檢測ROS 的產生。##P < 0. Olvs 對照組廣P < 0. 01ν8Αβ25_35 組。圖19 :S3對A β 25_35誘導SH-SY5Y細胞損傷細胞線粒體膜電位變化。細胞中加入 S3 IOmin後，加入A β 25_35共同孵育48h，JC-1探針染色。
具體實施例方式以下將結合實施例與附圖用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發 明的範圍和精神實質。實施例12，4-二甲氧基反式芪(以下簡稱S3)的製備化合物1 (苄化溴，0. Imol)與稍過量的亞磷酸三乙酯(0. 125mol)反應，油浴加熱 到120°C，反應至無氣體逸出，約需3小時，得化合物2 (淺黃色油狀液體)。在IOOml圓底瓶中置上步反應製得的化合物2 (0. 02mol)，將反應瓶置於冰水浴 中，加入無水四氫呋喃，攪拌下加入NaH(0. 02mol)，反應2小時，加入化合物3 (0. 0126mol)， 攪拌2小時後，室溫攪拌過夜。將反應液過濾，濾液濃縮至無四氫呋喃蒸出，固體以水甲醇為2 1的溶液做重 結晶，得白色針狀結晶，為化合物4，即2，4- 二甲氧基芪(S3)，此步收率為80. 1 %。EI-MS240(M+,100)，197，182，165，153，121，91。1H-WR(CDCl3) 3. 82 (3H, s)，3. 86 (3H，s) ,6. 46 (1H, d, J = 2. 4Hz)，6. 51 (1H，dd, Jl = 2. 4Hz, J2 = 6. 0Hz)，7. 01 (1H, d, J = 16. 2Hz)，7. 21 (1H, t, J = 7. 8Hz)，7. 32 (1H, t, J = 7. 8Hz)，7. 39 (1H, d, J = 16. 2Hz)，7. 51 (3H, m)。實施例2S3對Αβ 25_35腦室注射誘導記憶缺陷小鼠的保護作用(一 )實驗方法1.實驗動物Balb/c小鼠，雌性，6周齡，購自中國醫學科學院動物研究所。2.藥物用量及分組分4組對照組、模型組、採用本發明實施例1得到的S3高劑 量組(50mg/kg/day)、S3低劑量組(25mg/kg/day)。每組動物15隻。給藥方式以0. 5wt% 羧甲基纖維素鈉作為溶媒製作S3的藥物混懸液，自手術當天開始灌胃給藥，0. 2ml/只/天。 對照組和模型組以等量的溶媒灌胃。3. Αβ 25_35腦室注射動物飼養在中國醫學科學院基礎醫學研究所清潔級動物房， 飼料和飲水均經過消毒。所有動物適應行餵養一周，採用戊巴比妥鈉3%，0. lml/100g腹腔 注射麻醉小鼠。酒精擦拭小鼠頭部皮膚，剪毛。碘酒擦拭消毒，酒精再擦去碘。鑷子提起頭 部皮膚，沿兩耳中線中部剪開口後再向前剪開約1cm，在前滷後2mm中隔左邊1.5mm，進針 2. 5mm的部位注射lmg/ml的A β 25_35 5 μ 1，接著縫合皮膚。用棉球蘸酒精，擦去皮膚傷口處
P(OC2Hs):
Λ /-CH2PO(OC2H5)1
7血漬。4.檢測指標(1)小鼠空間記憶測定造模後，第5天開始做動物水迷宮實驗(water-maze test)，將小鼠頭朝池壁放入黑色圓形水池中(直徑100cm，高50cm，水深25cm，)，水池中有 一平臺(直徑5cm)，平臺位於水面下lcm。池水用墨水染成黑色，記錄動物找到平臺的時間， 第一次實驗中，如果動物找到平臺的時間超過120s，則引導動物到平臺，讓動物在平臺停留 10s。(2)細胞凋亡測定採用免疫組化實驗方法檢測，試劑盒購置Roche molecular biochemicals，USA0(3)小鼠海馬、皮質ChAT、AchE及SOD活性測定購置南京建成生物工程研究所的 乙醯膽鹼轉移酶(ChAT)、乙醯膽鹼酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，採用紫外分 光光度計測定。( 二)實驗結果1. S3對A β 25_35腦室注射誘導記憶缺陷小鼠空間記憶的影響由表1可見，與對照組比較，模型組在造模後第7天和第8天，小鼠找到平臺的時 間明顯延長(Ρ<0.01)；與模型組比較，S3 (50)和S3(25)組小鼠在造模後第7天和第8天 找到平臺的時間明顯縮短，顯示S3可以明顯改善Αβ25_35腦室注射小鼠的空間學習記憶能 力。表1 S3對側腦室注射A β 25_35誘導AD模型小鼠學習記憶能力的影響
5th天6th天7th天8th天對照104.6 土 2675.2±30.144.4±31.543.3 土 15.2模型107.6 土 23.672.9 土 33.381.4±37.7##83.4 土 34.4.7##S3 (50mg/kg)105.5 土 15.668.2±27.248.0 士 23.廣46.9士21.4"S3 (25mg/kg)108.2 土 23.769.5 土 20.8556.1±25.8*53.4 土 22 廣均值士標準差(η = 12)。數據顯示小鼠找到水底平臺需要的時間(潛伏期)。##Ρ < 0. Olvs 對照，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs 模型組2. S3對A β 25_35腦室注射誘導神經凋亡的保護作用由圖1可以看出，空白對照組無凋亡細胞出現，模型組，海馬區有大量凋亡細胞出 現(箭頭所指褐色團塊)；S3 (50)組海馬區無凋亡細胞出現；S3 (25)組海馬區有凋亡細胞， 但明顯少於模型組。提示S3對々025_35腦室注射誘導神經凋亡的保護作用。3. S3對腦室內注射Αβ 25_35誘導神經損傷模型小鼠海馬、皮質SOD活性的影響與對照組比較(表2)，模型組海馬和皮質的超氧化物歧化酶(SOD)活性分別下降 20.6% (P < 0.01) ^P 35.4% (P < 0.01), S3 (50)與模型組比較，海馬和皮質的SOD活性 分別提高40. 2% (P <0.01)和45.0% (P < 0. 01)。提示S3能改善A β 25_35腦室注射誘導 的SOD活性的降低。表2 S3對海馬和皮質SOD酶活性的影響
8SOD 活性(IU/g)組別海馬皮質對照組116.7±15.8162.3±23.8模型組92.7士 11.6#105.0 士 20.0##S3 (50)130.0 士 18.4**152.3 士 19.1S3 (25)106.8±15.295.8±24.2均數士 標準差(η = 10) /P < 0. 05，##Ρ < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs
模型組4. S3對腦室內注射Αβ 25_35小鼠海馬、皮質ChAT活性的影響與對照組比較(表3)，模型組海馬和皮質的乙醯膽鹼轉移酶(ChAT)活性分別下降 20. 6% (P < 0. 01)和61. 2% (P < 0. 01) ；S3 (50)與模型組比較，海馬和皮質的ChAT活性 分別提高39. 5% (Ρ<0. 05)和55. 3% (P < 0. 05)。提示S3能改善Αβ 25_35腦室注射誘導 的ChAT活性的降低。表3 S3對海馬和皮質乙醯膽鹼轉移酶酶(ChAT)活性的影響
乙醯膽鹼轉移酶(ChAT)活性(IU/mg)組別海馬皮質對照組1.02 士 0.190.98 士 0,20模型組0.81±0.14#0.38 士 0.13##S3 (50)1.13±0.13"0.59±0.12*S3 (25)0.87 士 0.130.42 士 0.14均數士 標準差(η = 7) /P < 0. 05、##Ρ < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs
模型組5. S3對腦室內注射Αβ 25_35小鼠海馬、皮質AchE活性的影響與對照組比較(表4)，模型組海馬和皮質的乙醯膽鹼酯酶(AchE)活性分別提高 36. 2% (P < 0.01)和 45. 8% (P < 0.01) ；S3 (50), S3 (25)與模型組比較，海馬和皮質的 AchE 活性分別下降 59. 0% (P < 0. 01) ,29. 2% (P < 0. 01)和 40. 0% (P < 0. 01) ,28. 6% (P < 0. 05)，提示S3能改善A β 25_35腦室注射誘導的AchE活性的升高。表4 S3對海馬和皮質乙醯膽鹼酯酶(AchE)酶活性的影響
AchE 活性(IU/g) 組別海馬皮質
對照組0.138 士0.0240.048±0.014
模型組0.188±0.037##0.070士 0.017##
9S3 (50)0.077±0.016**0.042±0.009**
S3 (25)0.133士0.026**0.050±0.015*均數士 標準差(η = 7)，flflP < 0. Olvs 對照組；**Ρ < 0. Olvs 模型組實施例3S3對高脂+Αβ 25_35腦室注射誘導記憶缺陷大鼠的保護作用(一 )實驗方法1.實驗動物wistar大鼠，雌性，180g，購自中國醫學科學院動物研究所，許可證 編號SCXK (京)2005-0013。2.藥物用量及分組動物分6組，分別為正常對照組，高脂對照組，模型組，採用市 售的 S3 高劑量組(50mg/kg/day)，S3 中劑量組(25mg/kg/day)，S3 低劑量組(12. 5mg/kg/ day)。每組動物10隻。3. Αβ 25_35腦室注射動物飼養在中國醫學科學院基礎醫學研究所清潔級動物房， 飼料和飲水均經過消毒。所有動物適應行餵養普通飼料一周後，除正常對照組外，其他所有 組給予高脂飼料餵養兩個月。隨後腦室注射Aβ 25_35 戊巴比妥鈉1%，0. 5ml/100g腹腔注射 麻醉大鼠。腦室定位儀固定大鼠，酒精擦拭大鼠頭部皮膚，剪毛。碘酒擦拭消毒，酒精再擦 去碘。手術刀切開頭部皮膚，在前滷後Imm中隔左邊2mm的部位用牙科鑽在顱骨鑽一小孔， 用微量注射器進針3.8!11111注射11^/1111的六025_35 10μ1，接著縫合皮膚。用棉球蘸酒精，擦 去皮膚傷口處血漬。腹腔注射8萬IU的青黴素。4.給藥方式以0. 5%羧甲基纖維素鈉作為溶媒製作S3的藥物混懸液，自手術當 天開始灌胃給藥，2ml/只/天。對照組和模型組以等量的溶媒灌胃。5.檢測指標(1)S3對模型大鼠空間記憶的影響動物造模後，第3天開始做動物水迷宮實 驗(water-maze test)，將大鼠頭朝池壁放入黑色圓形水池中(直徑120cm，高60cm，水深 30cm，)，水池中有一平臺(直徑8cm)，平臺位於水面下2cm。池水用墨水染成黑色，記錄動 物找到平臺的時間，第一次實驗中，如果動物找到平臺的時間超過60S，則引導動物到平臺， 讓動物在平臺停留10s。(2)跳臺實驗跳臺裝置為一 25CmX20CmX75Cm的被動迴避反應箱，箱底鋪直徑 為Imm銅柵，通36V交流電，銅柵的一角固定一 8cmX 8cmX 5cm大小的塑料泡沫塊作為動物 迴避電擊反應的安全區。先將大鼠放入箱中自由活動3min，熟悉環境，然後接通銅柵電源， 大鼠受到電擊，其正常反應是跳回泡沫塊以躲避傷害性刺激，多數動物可能再次或多次跳 至銅柵上，受到電擊(雙足同時接觸銅柵)又跳回安全區，如此訓練5min。24h後重複上述 試驗，記錄每隻大鼠第一次跳下安全區的時間(潛伏期)和錯誤次數，作為記憶測試成績。(3)細胞凋亡測定採用免疫組化實驗方法檢測，試劑盒購置Roche molecular biochemicals, USA。(4)大鼠海馬ChAT、AchE、GSH-PX、MDA及SOD活性測定購置南京建成生物工程研究 所的乙醯膽鹼轉移酶(ChAT)、乙醯膽鹼酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、GSH-PX 試劑盒、MDA試劑盒，採用紫外分光光度計測定。(5)大鼠海馬Ach水平的測定大鼠酶聯免疫吸附測定試劑盒[ELISA Kit for Rat]。試劑購自ADL公司。
10
(6)細胞色素C的釋放採用West Blot方法檢測。抗體購自R&D公司。(二)實驗結果1. S3對高脂+側腦室注射Aβ 25_35神經損傷模型大鼠空間記憶的影響與對照組 比較(表5)，高脂對照組在第7天找到平臺的時間明顯延長(P <0.01)；高脂+Αβ25_35 造模後第6天和第7天，找到平臺的時間明顯延長(P <0.01)；與高脂+Αβ 25_35組比較， S3 (50)和S3(25)組小鼠在造模後第6天和第7天找到平臺的時間明顯縮短。顯示S3可以 明顯改善Αβ 25_35腦室注射小鼠的空間學習記憶能力。表5 S3對高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型大鼠學習記憶的影響
5th天6th天7th天對照組38.22士23.5839.99±16.5410.61±6.32高脂對照組57.1 土 9.1744.72±17.0940.49土 19.78#高脂+Αβ25_3549.26±15.9856.61±6.9#52.09±6.9##S3 (50)39.2 土 20.1933.8 士 17.5"34.75士 19.07*S3 (25)52.78±11.9935.34±23.31*37.10±21.16S3 (12.5)40.2 土 25.6044.93土 21.5738.80±18.49
均數士標準差(η= 10).表中數據顯示大鼠找到水底平臺需要的時間(潛伏期) flP < 0. 05、flflP < 0. Olvs 對照組；*Ρ < 0. 05、**Ρ < 0. Olvs 高月旨 +A β 25_35
2. S3對高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型大鼠記憶的影響 從圖2和圖3可以看出，與空白對照組比較，模型組大鼠首次跳下平臺需要的時間 (潛伏期)明顯縮短(P < 0. 05)，錯誤次數明顯增加(P < 0. 05)。高脂組與正常對照組比 較潛伏期與錯誤次數無差異。與模型組比較，S3 (50)組潛伏期明顯延長，錯誤次數明顯減 少，提示S3可改善大鼠記憶。3. S3對高脂+側腦室注射Αβ 25_35神經損傷模型大鼠海馬組織細胞凋亡的影響從圖4可以看出，空白對照組海馬區域無凋亡細胞出現，高脂組有海馬區域零星 的凋亡細胞(褐色團塊)；而高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型組海馬區有大量凋亡 細胞出現(褐色團塊)；S3 (25)和S3 (50)組海馬區仍有凋亡細胞；S3 (50)組海馬區則僅有 零星凋亡細胞，明顯少於高脂+側腦室注射Αβ 25_35神經損傷模型組。4. S3對模型大鼠皮質、海馬SOD活性的影響從圖5可以看出，高血脂對大鼠腦海馬SOD活性並無影響，而高脂+腦室注射 Αβ 25_35則能明顯降低海馬SOD活性(與對照組比，P < 0. 05) ；S3(50/mg/kg)能明顯升高 SOD 的活性(P < 0. 05，P < 0. 05)。5. S3對A β 25-35腦室注射誘大鼠海馬GSH-PX活性的影響從圖6可以看出，高脂大鼠海馬GSH-PX活性與正常組比較無顯著性差異；腦室注 射Αβ25_35後，大鼠海馬GSH-PX活性與正常組比較明顯降低(P <0.01)。S3(50/mg/kg)則 能明顯升高GSH-PX的活性(P < 0. 01)。6. S3對A β 25_35腦室注射誘大鼠海馬MDA水平的影響從圖7可以看出，高脂大鼠海馬中MDA含量比正常組稍有升高，但無統計學意義； 模型組大鼠海馬MDA含量比正常組明顯升高(P < 0. 05)。給予S3能劑量依賴性的降低海
11馬中MDA含量，但只有在S3高劑量時才有顯著性差異(P < 0. 01)。7. S3對A β 25_35腦室注射誘大鼠海馬ChAT活性的影響由圖8可以看出，高脂大鼠海馬中ChAT活性比正常組升高，但無統計學意義。模 型組大鼠海馬中ChAT活性與正常組比較明顯降低；給予高劑量的S3能升高ChAT活性，與 模型組比價有顯著性差異(P < 0. 01)。8. S3對高脂+側腦室注射ΑΒ25-35神經損傷模型海馬AchE活性的影響由圖9可以看出，高脂組和高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型組大鼠海馬 中AchE活性比正常組升高(P < 0. 05，P < 0. 01)。高劑量S3能明顯降低AchE活性(P < 0. 05)。9. S3對高脂+側腦室注射ΑΒ25-35神經損傷模型海馬Ach水平的影響由圖10可以看出，高脂對照組大鼠海馬中Ach水平比對照組稍有降低，但無統計 學意義；模型組大鼠海馬Ach水平比正常對照組和高脂對照組明顯降低(均P < 0. 01)。給 予高劑量的S3和中劑量的S3後，海馬中Ach水平較模型組明顯升高(P < 0. 01，P < 0. 05)。10. S3對高脂+側腦室注射A β 25_35神經損傷模型大鼠海馬細胞色素C(Cyto-C)釋 放的影響由圖11可以看出，與對照組相比，高脂組與模型組腦組織胞漿中cyto-c水平升高 (均 P < 0. 01) ；S3 (50)和 S3 (25)能顯著降低 cyto-c 的釋放(均 P < 0. 01)。實施例4、S3對高脂模型大鼠血脂的影響(一)實驗方法1.動物來源及飼料雌性Wistar大鼠(二級)購自中國醫學科學院實驗動物研究 所繁育場，動物合格證號SCXK (京)2005-001372隻，體重180g。飼養於本所清潔動物房，動 物房編號SYXK (京)2005-0036。動物適應性餵養一周後開始實驗，實驗期間動物自由進食 和飲水，所有飼料和飲用水均進過消毒處理。大鼠高脂飼料配方如下10%豬油，1.5%的膽 固醇，0. 2%的膽酸鹽，5%的蛋黃粉，0. 2%的甲基硫氧嘧啶，83. 的基礎飼料。2.藥物辛伐他汀片由默沙東公司生產。3.動物分組將動物隨機分成6組①正常組；②高脂模型組；③辛伐他汀組；④本 發明實施例1得到的S3低劑量組；⑤S3中劑量組；⑥S3高劑量組。(二)實驗結果1. S3對高脂大鼠TC的影響由圖12可以看出，與對照組比較，高脂模型組大鼠TC水平提高508% (P <0.01)； 與模型組比較，辛伐他汀組TC水平降低30. 0% (P < 0. 05)，S3 (50)、S3 (25)組TC水平分 別降低30. 0%和27. 9%。2. S3對高脂模型大鼠HDL-C的影響由圖13可以看出，與對照組比較，模型組HDL-C的水平升高79. 94% (P < 0. 01)。 與模型組比較，S3 (50)組升高26. 9% (P < 0. 01)。辛伐他汀與S3 (25)及S3 (12. 5)分別 與模型組比較無顯著性差異。3. S3對高脂模型大鼠LDL-C的影響由圖14可以看出，與對照組比較，模型組LDL-C的水平升高24. 2倍(P < 0. 01)。
12與模型組比較，辛伐他汀組和S3 (50)組LDL-C的水平降低20. 72% (P < 0. 05)和20. 47% (P < 0. 05)。S3 (25)組S3 (12. 5)與模型組比較LDL-C的水平無顯著性差異。實施例5S3對A β 25_35誘導SH-SY5Y細胞的保護作用(一)實驗方法1.藥物來源S3由本發明實施例1得到。2.試劑 RPMI 1640粉末GIBCO公司產品；青黴素鈉，80萬U/瓶；硫酸鏈黴素， 100萬U/瓶，華北製藥集團有限責任公司產品；胎牛血清(FBS) ,Hyclone公司產品；MTT粉 末Amresco公司產品；Αβ 25_35，sigma公司產品；DCFH-DA探針，sigma公司產品。3.儀器細胞培養箱SANY0 MCO175, Japan 超淨工作檯蘇州艾可林淨化設備 有限公司；SpectraMax M5酶標儀。4. Αβ 25_35損傷SH-SY5Y細胞模型的建立SH-SY5Y細胞購自中國醫學科學院藥物 研究所，以低糖RPM1640培養基(含10%胎牛血清，青黴素100U/ml，鏈黴素100 U/ml)，於 37°C,5% CO2恆溫培養箱中培養，採用含有EDTA的胰蛋白酶消化傳代。SH-SY5Y細胞採用 含有EDTA的胰蛋白酶消化傳代，以0. 5X IO5個/孔接種於96孔板。培養12h後，加入終 濃度為 12. 5ymol/L、25ymol/L、50ymol/L、100ymol/L 的 Αβ25_35，培養 48h 後，進行細胞 活力測定。A β 25_35處理結束後，棄去原培養液，用PBS洗兩次，每孔加入100 μ 1 MTT液(採用 RPM1640培養基配製，MTT終濃度為0. 5mg/ml)，於37°C，5% CO2繼續培養4小時。吸棄上 清，每孔加入100 μ 1的DMS0，充分振蕩10分鐘，觀察每孔中甲贜顆粒均已溶解後於570nm 處測定OD值。5. S3對A β 25_35誘導細胞損傷的保護S3用DMSO溶解，然後用無血清RPM1640培 養基倍比稀釋至所需濃度，-20°C保存，DMSO使用最高終濃度< 0. 1%。細胞共分為五個 組另I」，分別為正常組、々325_35組、雌二醇(10_7M)組，S3 (HD)組(10_6M)、S3 (MD)組(10_7M)， S3 (LD)組(I(T8M)和 S3 (I(T7M)+ICI (I(T6M)組。細胞採用含有EDTA的胰蛋白酶消化傳代，以0. 5X IO5個/孔接種於96孔板。12h 後，加入 S3 (終濃度分另Ij lXl(T6mol/L、lXl(T7mol/L、lXl(r8mol/L)，雌二醇 ICT6M 及 ICI 10_6M，隨後加入終濃度為50ymol/L的A β 25_35 (Α β 25_35的使用終濃度根據損傷模型結果來 確定)，培養24小時後進行細胞活力檢測。不加A β 25_35的作為正常對照組，只加A β 25_35為 A β 25_35組。正常組和A β 25_35組加入與S3藥液等體積的無血清RM1640培養基。棄去原培養液，用PBS洗兩次，每孔加入100 μ 1 MTT液(採用無血清RM1640培 養基配製，MTT終濃度為0. 5mg/ml)，於37°C，5% CO2繼續培養4小時，吸棄上清，每孔加入 100 μ 1的DMS0，充分振蕩10分鐘，觀察每孔中甲贜顆粒均已溶解後於570nm處測定OD值。6.細胞凋亡(Hoechst 33342染色)A β 25_35作用48小時後，吸盡培養液，用無 酚紅的培養基洗滌兩次，加入50μ 1的Hoechst 33342染色液(10 μ g/ml)，37°C染色20分 鍾。用無酚紅的培養基洗滌兩次，加入ΙΟΟμΙ無酚紅培養基，在螢光顯微鏡下檢測。激發 波長在350nm左右，發射波長在460nm左右。7. S3對Αβ 25_35誘導細胞ROS水平的影響吸出細胞上層培養液，加入100 μ 1的 DCFH-DA(5 μ Μ)探針，37°C孵育45min，吸出上清，用PBS(Ph = 7. 3)洗滌3次，加入100 μ 1
13PBS (Ph = 7. 3)上機檢測，激發波長為480nm，發射波長為525nm。8. S3對細胞線粒體膜電位的影響細胞線粒體膜電位的測定吸取mitolight Apoptosis Detection Kit (LOT :PS01450307 Exp 2009/06)染色液 2 μ 1 加入到 0. 9ml 的 雙蒸水中，加入0. Iml的IOX buffer，加入Iml的無酚紅DMEM高糖培養基，超聲助溶。吸出 細胞上清，加入配好的染色液，每孔0. 25ml。37°C孵育20min，吸出上清液，用無酚紅的DMEM 培養基洗細胞兩次，上螢光顯微鏡觀察(激發光為藍光和綠光)。(二)實驗結果1. Αβ 25_35誘導細胞損傷模型的建立由圖15可以看出，細胞活力與△日25_35成濃度依賴性的降低。下面實驗中，Αβ25_35 濃度均取50(ymol/L)。2. S3對A β 25_35誘導細胞損傷的保護由圖16可以看出，Αβ25_35的細胞活率比對照組降低27. (P < 0. 01)，S3在 10_6Μ濃度時，與模型組比較細胞活率提高30. 8% (P < 0. 05)。3. S3對Αβ 25_35誘導的細胞凋亡的影響由圖17可以看出，Hoechst 33342染色實驗結果表明，對照組細胞核多數為大小 較一致、染色均勻的圓形核，偶見固縮濃染核；Αβ25_35處理組細胞數減少，出現凋亡細胞核， 染色質發生固縮，細胞核緻密濃染，形狀不規則，為顆粒、小塊狀。給予S3後能顯著減少細 胞凋亡。4. S3對A β 25_35誘導損傷細胞ROS的影響由圖18可以看出，與對照組比較，模型組(Αβ25_35)的ROS水平顯著提高(增 加了 124.2%，P <0.01)；與模型組比較，S3能劑量依賴的降低細胞ROS水平，分別降低 50. 98%,40. 22%,24. 95% (P < 0. 01)。5. S3對A β 25_35誘導損傷細胞線粒體的影響由圖19可以看出，與正常組比較，模型組細胞突觸變短，細胞變圓，細胞膜電位降 低(染色變綠)。S3 (50)，S3 (25)組與模型組比較，細胞膜電位明顯升高(顯示橙色細胞變 多)。實施例6S3對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響1.實驗方法藥品與試劑S3由本發明實施例1得到；MTT購自Sigma ；DMEM高糖培養基和血清 購自Hyclone ；其他試劑均為國產分析純。MCF-7細胞購自本所細胞中心。實驗方法MCF-7細胞以0.5X IO5密度接種於96孔板中，每孔180 μ L細胞液培 養24小時後，每孔分別加入各濃度的藥物20μ L，使S3終濃度分別為10_4、10_5、10_6、10_7、 10_8mOl/L，雌二醇的終濃度為lO—W/L。48小時後，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20ul, 37°C，繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150ul 二甲基亞碸 DMSO (分析純)，振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測 定各孔光吸收(OD)值，記錄結果。2.實驗結果由表6可見，S3能抑制MCF-7細胞的增殖作用，在10_4、10_5、10_6、liTmol/L濃度時
14與正常組比較有顯著性差異，分別抑制細胞增殖達到46. 3 %，11 %，9. 4 %，9. 4 %。表6 S3對MCF-7細胞增殖作用
組別濃度(mol/L)OD值對照組0.529士 0.051雌二醇組10"0.534士0.04710"7+ICI0.526士 0.048ICIIO"60.458士0.076*10·40.284士 0.041*IO"50.471±0.093*IO"60.479±0.061*ΙΟ·70.479士 0.075S3IO"80.498士 0.061
10'7+ICI0.547士 0.036MCF-7與S3共同孵育48h。MTT方法檢細胞增殖情況，*P < 0. 05vs對照組結論S3結構上類似於植物雌激素，本領域技術人員公知體內雌激素高容易誘發 乳腺癌，而本發明實驗結果顯示S3能抑制MCF-7細胞的增殖作用，克服了雌激素的副作用。實施例7小鼠單次給藥急性毒性實驗實驗動物為昆明小鼠，雌雄各半。體重18_20g。S3由本發明實施例1得到。實驗 分組分3組，每組5隻小鼠，5g/kg組，10g/kg組，15g/kg組。動物灌胃量為0. 2ml/只。實驗方法小鼠按5g/kg給藥，5隻，觀察2天，如果無死亡；按10g/kg給藥，5隻； 觀察2天，如無死亡；按15g/kg給藥，5隻，觀察2天。實驗結果(1)小鼠按5g/kg給藥，觀察14天，無死亡。(2)小鼠按10g/kg給藥，觀察14天，無死亡。結論S3安全性較高。參考文獻1. 「中國膽固醇教育計劃(CCEP) 」暨衛生部「十年百項」冠心病血脂幹預推廣項 目年度工作總結會議簡介.中國臨床醫生，2005 ;33 (2) 27.2.葉平.積極降脂，有效防治冠心病.老年醫學與保健，2005; 11(1) 11 13.3. Prasad K，Kalra J. Oxygen free radicals and hypercholesterolemic atherosclerosis :effect of vitamin E.Am Heart J,1993 ；125(4) :958 973·4.Deepa PR， Varalakshmi P.Atheroprotective effect of exogenous heparin-derivative treatment on the aortic disturbances and lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic diet fed rats. Clin Chim Acta,2005 ；355 (1-2) 119 130.5. Luigi Puglielli，Rudolph E，Tanzi, et al. Alzheimer' s disease :the
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1權利要求
2，4 二甲氧基反式芪在製備治療高脂血症的藥物中的用途。
2.2，4-二甲氧基反式芪在製備治療老年痴呆的藥物中的用途。
3.2，4_ 二甲氧基反式芪在製備治療老年痴呆同時伴有高脂血症的藥物中的用途。
4.2，4_ 二甲氧基反式芪在製備預防由高脂血症導致的老年痴呆的藥物中的用途。
5.根據權利要求1-4任意一項所述的用途，其中2，4-二甲氧基反式芪進一步與藥學上 可接受的載體組合。
6.根據權利要求5所述的用途，其中所述的載體包括稀釋劑、吸收劑、溼潤劑、粘合劑、 崩解劑、崩解抑制劑、吸收促進劑、潤滑齊 、分散劑、助溶齊 、緩衝齊 、表面活化劑。
7.根據權利要求1-4任意一項所述的用途，其中所述的藥物是以片劑、注射劑、膠囊、 滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑的形式使用。
8.根據權利要求1-4任意一項所述的用途，其中所述的藥物經靜脈、口服、肌肉、皮下、 鼻腔、口腔黏膜、皮膚、腹腔、直腸給予。
全文摘要
本發明涉及2，4-二甲氧基反式芪的新用途，特別是2，4-二甲氧基反式芪在降脂及抗老年痴呆中的用途。
文檔編號A61P3/06GK101919830SQ20091008598
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月10日 優先權日2009年6月10日
發明者孫蘭, 斯建勇, 李展, 阮燦軍, 陳迪華, 駱慶峰 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所;中國醫學科學院藥用植物研究所