一種發酵生產阿魏菇多糖及其口服液的方法
2023-07-13 08:30:26 1
專利名稱：：一種發酵生產阿魏菇多糖及其口服液的方法
技術領域：
：本發明涉及一種發酵生產阿魏菇多糖及其口服液的方法，具體地涉及一種基於阿魏菇的生物學特性、通過液體深層發酵實現阿魏菇多糖及其口服液工業化生產的方法。
背景技術：
：阿魏菇(PleurotusferulaeLanzi)又名阿魏側耳、阿魏蘑菇、白靈菇，是南歐、北非、中亞內陸地區春末夏初發生的品質極為優質的一種大型肉質珍稀食用真菌，是近幾年發展起來的食用菌新秀之一。我國野生阿魏菇僅分布於新疆荒漠地區(木壘、託裡、阿勒泰、伊犁、塔城等地)的阿魏灘上，因其生長於傘形花科植物阿魏(Ferula,asafoetide)的根上而得名。阿魏菇集食用、藥用於一身，營養成份全面豐富且含量又高，被學者美譽為當今食用菌皇后，在食用菌族中獨秀一枝，與另一種高檔藥食兩用菌_羊肚菌並稱為姊妹菌。阿魏菇生物活性有效組分食藥用真菌多糖的含量很高，其子實體多糖和液態深層發酵培養過程中產生的真菌多糖入藥有消積殺蟲的作用，對腹部腫痛、腹部腫塊、癌症等均有顯著療效。目前，阿魏菇多糖的藥用價值及其應用已為世界各國重視。近年來，國內的研究重點已經由阿魏菇的栽培及菌種的馴化轉移到其多糖的深層發酵、提取、分離純化及活性功能等方面。傳統的阿魏菇多糖的生產方法是從阿魏菇子實體中提取，但該法生產受子實體生產的季節性限制且生產成本高，而經液態深層發酵培養獲得的阿魏菇菌絲體和發酵液，其營養價值和有效成分與子實體相當，並且液態深層發酵法具有生產周期短、生長條件易控制、產量高等優點，相對傳統方法而言更易實現大規模產業化、周年化生產，且降低了生產成本。阿魏菇多糖的提取要根據多糖的存在形式及提取部位不同而採用不同的提取方法。從近年來報導的阿魏菇多糖酸提、鹼提、熱水浸提的實驗結果來看，熱水浸提法時間長、效率低，酸鹼法又極易導致多糖的立體結構破壞及生物活性改變。而採用有關酶類對阿魏菇子實體和菌絲體進行預處理，或者藉助超聲波、微波等輔助手段來提高其多糖的提取率，將會有利於其糖類物質的溶出和分離，還降低了生產成本。從近幾年的研究成果綜合來看，無論是通過何種方法製備的阿魏菇多糖都含有半乳糖和葡萄糖，但分子量差別很大，試驗原料不同、提取方法不同，得到的真菌多糖種類也不盡相同。近年來阿魏菇多糖的活性功能主要集中在免疫、抗氧化和抗腫瘤等方面的研究，研究發現，阿魏菇子實體粗多糖具有非特異性免疫功能和特異性細胞免疫功能，其菌絲體水溶性粗多糖和子實體水溶性純多糖免疫活性不明顯；熱提阿魏菇多糖對0H—和02均能有效清除，且對連苯三酚自氧化速率有明顯的抑制作用，說明具有較強的抗氧化作用；阿魏菇水提多糖對各類型腫瘤細胞株的生長及蛋白質合成均有明顯抑制作用，且表現出劑量依賴關係。阿魏菇是深受消費者歡迎的食藥用真菌，對其真菌多糖的研究及開發是今後阿魏菇研究和應用的重點。液態深層發酵是獲取大量阿魏菇活性多糖的有效途徑，提高阿魏菇多糖的提取率是進行多糖產品開發首要解決的關鍵問題。因此，應基於阿魏菇的生物學特性，更加深入地研究阿魏菇深層發酵的工藝條件，建立發酵過程動力學模型應，並結合阿魏菇細胞結構組成的特點，對阿魏菇多糖的提取方式和工藝進行進一步的研究，儘可能地提高多糖得率，減少多糖破壞。本申請的發明人經過近幾年對發酵法生產阿魏菇多糖工藝的潛心研究和對阿魏菇多糖口服液生產經驗的全面總結，設計了一種基於阿魏菇生物學特性、通過液體深層發酵實現阿魏菇多糖及其口服液生產的方法，並在新疆離子束生物工程中心(有限公司)得到了實踐驗證，結果表明該方法是一種適用於阿魏菇多糖及其口服液工業化生產的新方法。
發明內容本發明的一個方面提供基於阿魏菇生物學特性的罐批發酵方法，該方法包括母種的斜面培養、原種的種瓶培養、種液的150L-1500L種子罐擴大培養和10m3發酵罐發酵培養。優選地，在阿魏菇的罐批發酵的步驟中還包括通過pH變化判斷阿魏菇的生理周期和以pH驟降時間作為發酵終點結束的判據，以此為判據結束髮酵，阿魏菇菌絲體多糖的產量達到900mg/L的最高水平。其中，培養基是食用菌深層發酵過程中的關鍵因素之一，由於深層培養是在液體中培養菌絲體，培養液是菌絲體賴以生存的營養條件和進行物質、能量交換的場所，培養基的組成對菌體生長繁殖、產物的生物合成、產品的分離純化、乃至產品的質量和產量都有重要的影響。大量研究表明，碳氮比對阿魏菇的生長和產物形成有很大的影響，碳氮比不但會妨礙菌絲按比例吸收營養物；氮不足表現為菌絲繁殖慢，碳不足表現為菌體易衰老和自溶；同樣速效性和遲效性的碳源或氮源，以及有機的和無機的氮源的比例也會影響其菌絲對營養物的均勻吸收。pH值是食用菌菌絲體在一定環境條件下代謝活動的綜合指標，它涉及各種酶系的活力，是一項重要的發酵參數，它對菌絲的生長和多糖的積累有很大的影響。阿魏菇以偏酸性環境中生長較快，在發酵過程中培養液逐漸變酸，在配製培養液時，一般接近6.5左右，發酵幾天後即達到菌絲體的最適pH環境。溫度是影響食用菌生長和產物合成的重要因素之一，溫度的變化對發酵過程可產生兩方面的影響一方面是影響各種酶反應的速率和蛋白質的性質，另一方面是影響發酵液的物理性質；不同的菌株及同一菌株在不同的代謝階段，其適宜的發酵溫度也不同，因此選擇控制適宜的發酵溫度可以促使菌絲體增長。接種量是影響食用菌發酵周期的重要因素。為了在儘量短的發酵時間內獲得所需的菌絲體，發酵液接種一定量的壯年菌種是必需的，適宜的接種量可以縮短發酵階段的菌體生長的延滯期，從而縮短發酵周期，最終提高發酵產物的生產強度。研究發現，阿魏菇每一級接種量為10%15%時，菌絲生長較快，菌球小，菌液澄清，但以10%接種量菌絲產量最尚。攪拌轉速也是發酵過程中較重要的參數之一，改變攪拌轉速可改變供氧條件使菌體處於最佳溶解氧值，並使菌絲體處於均勻懸浮狀態。大量實驗表明，阿魏菇液體發酵轉速以120r/min160r/min為宜，生成的菌球均勻而稠密；低於此轉速，生長較緩慢，菌絲球直徑大小不一；進一步提高轉速，雖菌絲球直徑變小，發酵周期縮短，但最終菌絲體乾重無顯者差升。本發明的另一個方面提供基於阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌體細胞結構組成特點的後提取方法，該方法包括包括發酵產物的預處理、阿魏菇多糖的連續提取及濃縮、低溫醇析、兩步脫溶的步驟。優選地，在阿魏菇多糖後提取的步驟中還包括超聲波輔助兩次連續提取和兩步脫溶的步驟，兩次連續提取後阿魏菇多糖的提取率在95%以上，兩步脫溶後阿魏菇多糖的溶劑殘留量可控制在50ppm以內。本發明的另一個方面還提供基於阿魏菇多糖營養保健功能的口服液生產方法，該方法包括配料、勻質、灌封、殺菌、抽檢及包裝的步驟。優選地，在阿魏菇多糖口服液生產的步驟中還包括高壓勻質的步驟，高壓勻質後灌封生產的阿魏菇多糖口服液呈淺棕黃色、澄清、無分層、無沉澱。該方法已經在新疆離子束生物工程中心(有限公司)得到了實踐驗證，結果表明該方法是一種適用於阿魏菇多糖及其口服液工業化生產的新方法。具體實施例方式實施例1、基於阿魏菇生物學特性的罐批發酵方法基於阿魏菇生物學特性的罐批發酵方法包括母種的斜面培養、原種的種瓶培養、種液的150L-1500L種子罐擴大培養和10m3發酵罐發酵培養幾個階段。經過種瓶恆溫培養菌絲體長滿種瓶後，用無菌接種鏟將菌絲塊攪碎並瓶於裝有1500mL無菌水的2000mL三角瓶中，加入適量廣譜抗菌劑後接入一級種子罐，待菌絲體生物量最大化後，進行移種逐級擴培，發酵培養。(1)、母種的斜面培養用無菌接種鉤刮取少量阿魏菇菌絲體，接種到PDA斜面培養基上，在28°C培養7d；(2)、原種的種瓶培養用無菌接種鉤挑取一定量的斜面菌絲塊，接種到裝有350ml種瓶培養基的500ml廣口瓶中，28°C恆溫靜置培養15d，其中，種瓶培養基的成分為(w/v)木屑粉30%、麩皮粉7%、白砂糖0.5%、石膏0.5%、石灰2%，其餘為無菌水；(3)、種液的150L-1500L種子罐擴大培養菌絲體長滿種瓶後，用無菌接種鏟將菌絲塊攪碎並瓶於裝有1500mL無菌水的2000mL三角瓶中，然後加入0.2%的土黴素等廣譜抗菌素抑止雜菌汙染，按120的接種量接種於裝有100L種液培養基一的150L氣升式發酵罐中，通氣充分攪拌培養，28°C發酵96小時；接著按10%的接種量接入裝有1000L種液培養基二的1500L攪拌釜式發酵罐中擴培，25°C恆溫培養96h;其中，150L、1500L攪拌釜式發酵罐的攪拌轉速分別為200r/min和160r/min、空氣流量分別為12m3/h和120m3/h，種液培養基一的成分為(w/v)小麥粉1.5%、蔗糖1.0%、酵母膏0.4%、麩皮(煮汁)1.5%、KH2P040.2%,MgS040.15%，種液培養基二的成分為(w/v):小麥粉0.7%、蔗糖0.7%、酵母膏0.28%、麩皮(煮汁)1.0%、KH2P040.2%,MgS040.15%,pH值滅菌前均自然，121°C滅菌30min。(4)、10m3發酵罐發酵培養將經過擴培的發酵液按110的比例接種於裝有7m3發酵培養基的10m3攪拌釜式發酵罐中，28°C恆溫發酵120h後結束髮酵；其中，攪拌轉速為120r/min、空氣流量為840m3/h，發酵培養基的成分為(w/v):小麥粉0.5%、蔗糖0.5%、酵母膏0.2%、麩皮(煮汁)0.7%,KH2P040.2%,MgS040.15%，pH值滅菌前自然，121°C滅菌30min。實施例2、基於阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌體細胞結構組成特點的後提取方法基於阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌體細胞結構組成特點的後提取方法包括發酵產物的預處理、阿魏菇多糖的連續提取及濃縮、低溫醇析、兩步脫溶幾個階段。經過罐批發酵得到的發酵產物經過離心脫水、球磨破壁等預處理後，打入提取罐，兩次充分連續提取後經過減壓濃縮、低溫醇析、兩步脫溶等處理後，得到阿魏菇菌絲體粗多糖，以備阿魏菇多糖口服液等深加工產品添加之用。(1)、發酵產物的預處理將經過罐批發酵獲得的發酵產物50L裝入200目的過濾袋中置於SS800三足式離心機中，在1200r/min的轉速下離心30min，再按料液比11.5加入無水乙醇，在上述相同工作轉速下離心30min，收集幹菌體，然後將得到的幹菌體50Kg平均裝入4個25L球磨罐中置於QM-2SP100-GL球磨機中，在700r/min的轉速下破壁30min，收集破碎菌體。(2)、阿魏菇多糖的連續提取及濃縮將經過預處理的發酵產物130Kg按料液比15加入650L經過去離子處理的自來水平均打入700L1、2號提取罐中，經過功率6KW的超聲波處理5min後，在100°C的提取溫度、50r/min的轉速下攪拌提取60min，然後將1號罐中的提取液放入暫存罐中，關閉閥門再將2號提取罐的提取液打入1號提取罐中，暫存罐中的提取液打入2號提取罐中，在上述相同的提取條件下攪拌提取60min，接著將提取液放入暫存罐中，開啟減壓閥門在0.08Mpa的負壓下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋轉蒸發器中在95°C、200r/min減壓濃縮，蒸發的水蒸氣經過10m2冷凝器在0°C液化回收到1.5m3溶劑回收罐中，得到的濃縮物打入醇析罐中結晶。(3)、低溫醇析將得到的濃縮物按料液比15打入裝有150L無水乙醇的200L醇析罐中在_4°C結晶12h，然後放入12-15個孔徑38ym的尼龍袋中掛於300L存儲罐中過濾24h，將得到的結晶物倒入30L不鏽鋼桶中以備後續脫溶。(4)、兩步脫溶稱量30Kg結晶物倒入脫溶鍋中，在60°C的脫溶溫度、0.08MPa工作壓力下減壓脫溶2h；然後從脫溶鍋底部通入N2，在上述相同的條件下減壓脫溶1.5h。最後，收集阿魏菇菌絲體粗多糖，以備阿魏菇多糖口服液等深加工產品添加之用。實施例3、基於阿魏菇多糖營養保健功能的口服液生產方法基於阿魏菇多糖營養保健功能的口服液生產方法包括配料、高壓勻質、脫氣灌封、殺菌、抽檢及包裝幾個階段，經過上述操作生產的阿魏菇多糖口服液呈淺棕黃色、澄清、清涼爽口、酸甜適中、無分層、無沉澱，阿魏菇多糖含量>1.0g/L、總酸(以檸檬酸計)<1.0%、pH值4.20，細菌數<lOOOcfu/g、黴菌數<100cfu/g、大腸菌群、致病菌未檢出。(1)、調配按照正交優化獲得的阿魏菇多糖口服液配方稱量配料，然後將原料邊攪拌邊加入50°C的蒸餾水中進行調配，其中，口服液配方為(w/v):5.0g/L的阿魏菇多糖溶液20%、甜味劑蔗糖12%、酸味劑(檸檬酸、檸檬酸鈉質量比101)0.1%、穩定劑(海藻酸鈉、CMC-Na(2)、高壓勻質將調配好的漿液加入穩定劑後均質，均質壓力為1520MPa。(3)、脫氣灌封均質後，將料液進行脫氣處理，適宜條件為0.05MPa脫氣lOmin，脫氣後，按10mL/瓶的量在全自動灌裝生產線上灌裝、壓蓋密封。(4)、殺菌採用高溫滅菌，滅菌條件115°C滅菌30min。(5)、抽檢及包裝冷卻後，對產品進行隨機抽樣進行理化指標(見表1)、微生物指標檢驗，最後，對合格品進行貼籤、裝盒、裝箱入庫。表1理化指標tableseeoriginaldocumentpage8通過上述具體的實施例，更容易理解本發明。上述實施例只是舉例性的描述，而不應當被理解為用來限制本發明的範圍。質量比21)0.2%,Vc0.02%。權利要求一種基於阿魏菇生物學特性的罐批發酵方法，其特徵在於母種的斜面培養用無菌接種鉤刮取少量阿魏菇菌絲體，接種到PDA斜面培養基上，在28℃培養7d；原種的種瓶培養用無菌接種鉤挑取一定量的斜面菌絲塊，接種到裝有350ml種瓶培養基的500ml廣口瓶中，28℃恆溫靜置培養15d，其中，種瓶培養基的成分為(w/v)木屑粉30％、麩皮粉7％、白砂糖0.5％、石膏0.5％、石灰2％，其餘為無菌水；種液的150L-1500L種子罐擴大培養菌絲體長滿種瓶後，用無菌接種鏟將菌絲塊攪碎並瓶於裝有1500mL無菌水的2000mL三角瓶中，然後加入0.2％的土黴素等廣譜抗菌素抑止雜菌汙染，按1∶20的接種量接種於裝有100L種液培養基一的150L氣升式發酵罐中，通氣充分攪拌培養，28℃發酵96小時，接著按10％的接種量接入裝有1000L種液培養基二的1500L攪拌釜式發酵罐中擴培，25℃恆溫培養96h，其中，150L、1500L攪拌釜式發酵罐的攪拌轉速分別為200r/min和160r/min、空氣流量分別為12m3/h和120m3/h，種液培養基一的成分為(w/v)小麥粉1.5％、蔗糖1.0％、酵母膏0.4％、麩皮(煮汁)1.5％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，種液培養基二的成分為(w/v)小麥粉0.7％、蔗糖0.7％、酵母膏0.28％、麩皮(煮汁)1.0％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，pH值滅菌前均自然，121℃滅菌30min；10m3發酵罐發酵培養將經過擴培的發酵液按1∶10的比例接種於裝有7m3發酵培養基的10m3攪拌釜式發酵罐中，28℃恆溫發酵120h後結束髮酵；其中，攪拌轉速為120r/min、空氣流量為840m3/h，發酵培養基的成分為(w/v)小麥粉0.5％、蔗糖0.5％、酵母膏0.2％、麩皮(煮汁)0.7％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，pH值滅菌前自然，121℃滅菌30min。2.一種基於阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌體細胞結構組成特點的後提取方法，其特徵在於發酵產物的預處理將經過罐批發酵獲得的發酵產物50L裝入200目的過濾袋中置於SS800三足式離心機中，在1200r/min的轉速下離心30min，再按料液比11.5加入無水乙醇，在上述相同工作轉速下離心30min，收集幹菌體，然後將得到的幹菌體50Kg平均裝入4個25L球磨罐中置於QM-2SP100-GL球磨機中，在700r/min的轉速下破壁30min，收集破碎菌體；阿魏菇多糖的連續提取及濃縮將經過預處理的發酵產物130Kg按料液比15加入650L經過去離子處理的自來水平均打入700L1、2號提取罐中，經過功率6KW的超聲波處理5min後，在100°C的提取溫度、50r/min的轉速下攪拌提取60min，然後將1號罐中的提取液放入暫存罐中，關閉閥門再將2號提取罐的提取液打入1號提取罐中，暫存罐中的提取液打入2號提取罐中，在上述相同的提取條件下攪拌提取60min，接著將提取液放入暫存罐中，開啟減壓閥門在0.OSMpa的負壓下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋轉蒸發器中在95°C、200r/min減壓濃縮，蒸發的水蒸氣經過IOm2冷凝器在0°C液化回收到1.5m3溶劑回收罐中，得到的濃縮物打入醇析罐中結晶；低溫醇析將得到的濃縮物按料液比15打入裝有150L無水乙醇的200L醇析罐中在-4°C結晶12h，然後放入12-15個孔徑38μm的尼龍袋中掛於300L存儲罐中過濾24h，將得到的結晶物倒入30L不鏽鋼桶中以備後續脫溶；兩步脫溶稱量30Kg結晶物倒入脫溶鍋中，在60°C的脫溶溫度、0.OSMPa工作壓力下減壓脫溶2h；然後從脫溶鍋底部通入N2，在上述相同的條件下減壓脫溶1.5h，最後，收集阿魏菇菌絲體粗多糖，以備阿魏菇多糖口服液等深加工產品添加之用。3.一種基於阿魏菇多糖營養保健功能的口服液生產方法，其特徵在於調配按照正交優化獲得的阿魏菇多糖口服液配方稱量配料，然後將原料邊攪拌邊加入50°C的蒸餾水中進行調配，其中，口服液配方為(w/v):5.0g/L的阿魏菇多糖溶液20%、甜味劑蔗糖12%、酸味劑(檸檬酸、檸檬酸鈉質量比101)0.1%、穩定劑(海藻酸鈉、CMC-Na質量比21)0.2%,Vc0.02%；高壓勻質將調配好的漿液加入穩定劑後均質，均質壓力為1520MPa；脫氣灌封均質後，將料液進行脫氣處理，適宜條件為0.05MPa脫氣lOmin，脫氣後，按IOmL/瓶的量在全自動灌裝生產線上灌裝、壓蓋密封；殺菌採用高溫滅菌，滅菌條件115°C滅菌30min；抽檢及包裝冷卻後，對產品進行隨機抽樣進行理化指標(見表1)、微生物指標檢驗，最後，對合格品進行貼籤、裝盒、裝箱入庫。表1理化指標tableseeoriginaldocumentpage3全文摘要一種發酵生產阿魏菇多糖及其口服液的方法,本發明的一個方面提供基於阿魏菇生物學特性的罐批發酵方法，該方法包括母種的斜面培養、原種的種瓶培養、種液的150L-1500L種子罐擴大培養和10m3發酵罐發酵培養。本發明的另一個方面提供基於阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌體細胞結構組成特點的後提取方法，該方法包括包括發酵產物的預處理、阿魏菇多糖的連續提取及濃縮、低溫醇析、兩步脫溶的步驟。本發明的另一個方面還提供基於阿魏菇多糖營養保健功能的口服液生產方法，該方法包括配料、勻質、灌封、殺菌、抽檢及包裝的步驟。文檔編號C12P19/04GK101812491SQ20101011579公開日2010年8月25日申請日期2010年1月31日優先權日2010年1月31日發明者呂長武,林增祥,陳小龍,陳恆雷申請人:陳恆雷;林增祥;呂長武