一種製備纖維結合蛋白的方法
2023-07-07 04:19:01 3
專利名稱：一種製備纖維結合蛋白的方法
技術領域：
本發明屬生物化學，血液學，生物製品學領域，具體涉及一種製備纖維結合蛋白的方法。
纖維結合蛋白的提純開始於70年代。1970年Mosesson MW等以冷沉澱為原料，用磷酸緩衝液溶解，分別加甘氨酸和乙醇沉澱後，再溶解，通過DEAE-纖維素柱，磷酸緩衝液洗脫獲得纖維結合蛋白。所得的纖維結合蛋白含有纖維蛋白原，產生白色絮狀沉澱，使製品的穩定性較差，得率較低，純度較差。1971年Axen用抗纖維結合蛋白的抗體的親和層析柱直接從新鮮血漿中吸附纖維結合蛋白，用鹽酸-甘氨酸洗脫獲得。這種方法首先需要纖維結合蛋白的專一抗體，其成本非常大，不適用於大規模生產。1973年Allen等用硫酸銨沉澱血漿，分離的沉澱物溶解後進行肝素-sepharose親和層析，用氯化鈉溶液洗脫獲得纖維結合蛋白，此法獲得的纖維結合蛋白純度較差，穩定性不高。1977年Eva Engvall等根據纖維結合蛋白和明膠結合的特性，發展了明膠-sepharose 4B親和層析分離纖維結合蛋白的較簡單的方法，其利用纖維結合蛋白分子中可與明膠結合的功能區域，將明膠以共價鍵偶聯在Sepharose 4B上，血漿或冷沉澱溶解液直接過柱，進行親和層析後，再用起始緩衝液洗滌明膠柱，最後用尿素將纖維結合蛋白洗脫。但存在如下缺陷尿素洗脫液中由於含有多量纖維蛋白原(Fg)，而Fg是極不穩定的蛋白，在純化的過程中，溫度或其他因素的影響，會不斷促使Fg變為纖維蛋白而析出，使樣品出現白色絮狀沉澱，將親和柱堵塞，影響純化過程。其次，因Fg和Fn相互結合，所以，當Fg變為纖維蛋白析出時，會使Fn以共沉澱的形式，形成Fn和Fg白色絮狀沉澱，從而使Fn的回收率降低。第三，明膠-Sephorose4B親和柱對纖維結合蛋白的吸附不專一，對Fg，等等也有吸附作用，同時，由於Fg與Fn的相互作用，使最終製品的純度不高。最終製品中不能完全去除Fg，在含有Fg的Fn製品中，因Fg變為纖維蛋白，使製品溶液出現沉澱，會嚴重影響製品質量。第四，尿素對製品的生物活性有影響，高濃度的尿素會影響Fn的某些生物活性。
本發明通過下述步驟進行，1、用Tris-HCl緩衝液溶解冷沉澱，所述緩衝液其PH為7.0-8.5，含有檸檬酸三鈉0.5-2.0％，氯化鈉0.50-2.0％，溶解比例為1∶3-1∶20，溶解溫度為5-40℃，溶解時間為1-3小時。
2、酒精沉澱將冷沉澱溶解液離心，轉速為1000-4000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精溶液(含有檸檬酸三鈉0.5-2.0％，氯化鈉0.5-2.0％，0～-30℃)至濃度為3-30％，冰浴中攪拌30-60min，然後靜置2-5h，低溫離心，轉速3000-7000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液(PH7.0-8.5)，含有檸檬酸三鈉0.5-2.0％，氯化鈉0.50-2.0％，溶解至原體積，溶解液可控制在0-30℃。
3、第一步PEG沉澱酒精沉澱溶解液中加入濃度為40％的PEG溶液，至終濃度為4-15％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度在10-25℃之間，控制系統的PH在7.0-8.5之間，室溫攪拌30分鐘，靜置30-60分鐘後離心，轉速3000-5000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱(此沉澱溶解即為纖維蛋白原製劑)。
4、第二步PEG沉澱第一步PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入5-25mlPEG溶液，控制系統的PH在7.0-8.5之間，溫度在10-25℃之間，室溫下攪拌30分鐘，靜置30-60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000-5000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液(PH7.0-8.5)進行溶解至原體積。
5、離子交換層析取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液(PH7.0-8.5)平衡QAE凝膠層析系統。共需要Tris-HCl緩衝液(PH7.0-8.5)三個柱床體積。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，上樣流速為10-40ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液(PH7.0-8.5)，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液(PH7.0-8.5)進行洗滌，其中氯化鈉濃度為(0.05-0.14M)，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液(PH7.0-8.5)進行洗脫，其中氯化鈉濃度為(0.16-1.0M)，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
本發明所述實驗材料及試劑冷沉澱為上海生物製品研究所提供，乙醇，聚乙二醇(MW4000)，QAE膠，兔抗人纖維結合蛋白血清，甘氨酸(Gly)，纖維結合蛋白標準品均為市購。
結果證實，用本發明提供的提純方法，得到的纖維結合蛋白的純度可達90％左右(紫外薄層掃描法)，其得率可達30.00％以上。表1為纖維結合蛋白純化結果。
表1原液 酒精沉澱 PEG沉澱 PEG沉澱 QAE層析12Fn濃度 1.250.93 0.60 0.49 2.02mg/ml體積(ml) 50 50 5750 12得率(％) 100.0 74.4 54.72 39.238.78純度(％) 11 19 5071 90本發明方法建立的工藝路線可以從冷沉澱中得到纖維結合蛋白。製備的纖維結合蛋白製劑其凍幹製品的外觀為白色，溶解度高，透明澄清。本方法確立了可用於規模化生產的製備纖維結合蛋白的工藝。本方法具有下述優點1)本發明提高最終製品的純度及穩定性，能將病毒滅活處理步驟結合於其中。2)本方法適用於規模化生產，中間步驟少，簡單易操作。3)本發明方法提供的提純纖維結合蛋白的製備，周期短，有利於生產過程中無菌控制。4)本方法引入了陰離子層析路線，與已有親和層析製備技術相比，本發明利用強陰離子柱QAE，其吸附纖維結合蛋白的能力明顯高於明膠親和柱；本發明所得的纖維結合蛋白純度高；活性高；本發明因不採用溴化氰等活化劑活化Sepharose 4B，故對環境無汙染。5)本方法同時可以製得纖維結合蛋白製劑和纖維蛋白原製劑，提高了冷沉澱的利用度，節約成本。本方法採用酒精沉澱纖維蛋白原和纖維結合蛋白後，再用PEG分離纖維蛋白原和纖維結合蛋白，同時可以製得纖維結合蛋白製劑和纖維蛋白原製劑。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(0℃)至濃度為4％，冰浴中攪拌40min，然後靜置3h，低溫離心，轉速5000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.0，含有檸檬酸三鈉0.60％，氯化鈉0.50％進行溶解至原體積，溶解液溫度為0℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為5％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為12℃，系統的PH控制在7.0，室溫攪拌30分鐘，靜置30分鐘，離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入7mlPEG溶液，系統的PH控制在7.0，溫度控制在12℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置30分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.0，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.0，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為10ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.0，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.0進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.05M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.0進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.16M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例2從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱100g以1∶5溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.10，含有檸檬酸三鈉0.70％，氯化鈉0.90％，溶解溫度為8℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為2000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-3℃)至濃度為6％，冰浴中攪拌40min，然後靜置2h，低溫離心，轉速6000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.10，含有檸檬酸三鈉0.70％，氯化鈉0.90％進行溶解至原體積，溶解液溫度為3℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為7％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為10℃，系統的PH控制在7.10，然後室溫攪拌30分鐘，靜置40分鐘，離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入9mlPEG溶液，系統的PH控制在7.10，溫度控制在10℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.10，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.10，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為12ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.10，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.10進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.06M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.10進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.18M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例3從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱100g以1∶7溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.20，含有檸檬酸三鈉1.00％，氯化鈉0.90％，溶解溫度為37℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-5℃)至濃度為8％，冰浴中攪拌40min，然後靜置4h，低溫離心，轉速6000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.20，含有檸檬酸三鈉1.00％，氯化鈉0.90％進行溶解至原體積，溶解液溫度為5℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為8％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為14℃，系統的PH控制在7.2，然後室溫攪拌30分鐘，靜置60分鐘，離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入10mlPEG溶液，系統的PH控制在7.2，溫度控制在14℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.20，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.20，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為15ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.20，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.20進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.07M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.20進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.20M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例4從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱200g以1∶9溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.30，含有檸檬酸三鈉1.00％，氯化鈉1.00％，溶解溫度為35℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-8℃)至濃度為10％，冰浴中攪拌50min，然後靜置3h，低溫離心，轉速6000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.30，含有檸檬酸三鈉1.00％，氯化鈉1.00％進行溶解至原體積，溶解液溫度為6℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為9％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為15℃，系統的PH控制在7.3，然後室溫攪拌30分鐘，靜置40分鐘，離心，轉速4000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入11mlPEG溶液，系統的PH控制在7.3，溫度控制在15℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.30，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.30，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為20ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.30，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.30進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.08M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.30進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.25M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例5從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱200g以1∶11溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.40，含有檸檬酸三鈉1.30％，氯化鈉1.20％，溶解溫度為20℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-9℃)至濃度為12％，冰浴中攪拌40min，然後靜置3h，低溫離心，轉速5000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.40，含有檸檬酸三鈉1.30％，氯化鈉1.20％進行溶解至原體積，溶解液溫度為7℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40PEG％溶液，至終濃度為10％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為16℃，系統的PH控制在7.40，然後室溫攪拌30分鐘，靜置50分鐘，離心，轉速4000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入12mlPEG溶液，系統的PH控制在7.40，溫度控制在16℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.40，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.40，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為30ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.40，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.40進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.09M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.40進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.28M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例6從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱200g以1∶13溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.50，含有檸檬酸三鈉1.50％，氯化鈉1.0％，溶解溫度為20℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-10℃)至濃度為14％，冰浴中攪拌50min，然後靜置3h，低溫離心，轉速5000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，含有檸檬酸三鈉1.50％，氯化鈉1.00％進行溶解至原體積，溶解液溫度為10℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為11％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為18℃，系統的PH控制在7.50，然後室溫攪拌50分鐘，靜置50分鐘，離心，轉速4000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入14mlPEG溶液，系統的PH控制在7.50，溫度控制在20℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為40ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.50進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.10M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.50進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.33M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例7從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱200g以1∶15溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.60，含有檸檬酸三鈉1.30％，氯化鈉1.50％，溶解溫度為9℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-12℃)至濃度為16％，冰浴中攪拌30min，然後靜置3h，低溫離心，轉速4000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.60，含有檸檬酸三鈉1.30％，氯化鈉1.50％進行溶解至原體積，溶解液溫度為15℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為12％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為20℃，系統的PH控制在7.60，然後室溫攪拌30分鐘，靜置40分鐘，離心，轉速4000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入16mlPEG溶液，系統的PH控制在7.60，溫度控制在25℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.60，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.60，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為35ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.60，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.60進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.11M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.60進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.35M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例8從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱200g以1∶17溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.70，含有檸檬酸三鈉1.10％，氯化鈉1.00％，溶解溫度為40℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-16℃)至濃度為18％，冰浴中攪拌40min，然後靜置3h，低溫離心，轉速3000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.70，含有檸檬酸三鈉1.10％，氯化鈉1.00％進行溶解至原體積，溶解液溫度為20℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為13％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為20℃，系統的PH控制在7.70，然後室溫攪拌30分鐘，靜置50分鐘，離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入18mlPEG溶液，系統的PH控制在7.70，溫度控制在10℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速4000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.7，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.70，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為25ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.70，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.70進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.12M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.70進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.40M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例9從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱200g以1∶19溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH7.50，含有檸檬酸三鈉1.70％，氯化鈉0.80％，溶解溫度為14℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-20℃)至濃度為20％，冰浴中攪拌40min，然後靜置3h，低溫離心，轉速4000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，含有檸檬酸三鈉1.70％，氯化鈉0.80％進行溶解至原體積，溶解液溫度為18℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為15％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為22℃，系統的PH控制在7.50，然後室溫攪拌30分鐘，靜置50分鐘，離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入20mlPEG溶液，系統的PH控制在7.50，溫度控制在22℃，然後室溫下攪拌30分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為30ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH7.50，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.50進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.13M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH7.50進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.35M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
實施例10
從冷沉澱中純化纖維結合蛋白1.冷沉澱200g以1∶20溶解在Tris-HCl緩衝液中，PH8.00，含有檸檬酸三鈉1.60％，氯化鈉1.60％，溶解溫度為17℃，溶解時間約為1小時。
2.將冷沉澱溶解液離心，轉速為3000rpm，得到上清，去掉沉澱。上清中加入低溫酒精(-22℃)至濃度為21％，冰浴中攪拌40min，然後靜置3h，低溫離心，轉速4000rpm，離心30min。棄去上清，得到沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH8.00，含有檸檬酸三鈉1.60％，氯化鈉1.60％進行溶解至原體積，溶解液溫度為17℃。
3.酒精沉澱溶解液中加入40％PEG溶液，至終濃度為14％。沉澱時調整酒精沉澱溶解液及PEG的溫度為25℃，系統的PH控制在8.0，然後室溫攪拌40分鐘，靜置50分鐘，離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。取出上清，棄去沉澱。
4.第一次PEG沉澱處理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入17mlPEG溶液，系統的PH控制在8.0，溫度控制在25℃，然後室溫下攪拌40分鐘，靜置60分鐘，進行第二次PEG沉澱處理。離心，轉速3000rpm，離心時間30分鐘。棄去上清，取沉澱。沉澱用Tris-HCl緩衝液，PH8.00，溶解至原體積。
5.取QAE凝膠裝柱，用Tris-HCl緩衝液，PH8.00，平衡QAE凝膠層析系統。將第二次PEG沉澱得到的沉澱溶解液，上樣，流速為40ml/h，進行QAE陰離子層析；然後再用Tris-HCl緩衝液，PH8.00，洗滌QAE陰離子層析系統，用三個柱床體積；第二次洗滌用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH8.0進行洗滌，其中氯化鈉濃度為0.14M，洗掉雜蛋白；再用含氯化鈉的Tris-HCl緩衝液PH8.0進行洗脫，其中氯化鈉濃度為0.45M，得到的蛋白即為纖維結合蛋白，透析去掉氯化鈉。
權利要求
1.一種製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是按下述步驟進行，1)用Tris-HCl緩衝液溶解冷沉澱，2)酒精沉澱，3)第一步PEG沉澱，4)第二步PEG沉澱，5)陰離子交換層析。
2.按權利要求1所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的任一步驟可單獨進行或其中1、2、3、5步驟可任意組合進行。
3.按權利要求1所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的冷沉澱溶解緩衝液含檸檬酸三鈉和氯化鈉，其PH為7.0-8.5，冷沉澱溶解比例為1∶3-1∶20，溶解溫度為5-40℃，溶解時間為1-3小時。
4.按權利要求3所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的冷沉澱溶解緩衝液的檸檬酸三鈉濃度為0.50-2.0％，氯化鈉濃度為0.50-2.0％。
5.按權利要求1所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的酒精沉澱中酒精溶液含檸檬酸鈉和氯化鈉，其酒精終濃度為3-30％，酒精溶液溫度0～-30℃，PH為7.0-8.5。
6.按權利要求5所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的酒精溶液中檸檬酸鈉濃度為0.5-2.0％，氯化鈉濃度為0.5-2.0％。
7.按權利要求1所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的酒精沉澱溶解液含檸檬酸鈉和氯化鈉，溶解液溫度為0-30℃，PH為7.0-8.5。
8.按權利要求7所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的酒精沉澱溶解液中檸檬酸鈉濃度為0.5-2.0％，氯化鈉濃度為0.5-2.0％。
9.按權利要求1所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的第一步PEG沉澱中的PEG濃度為4-15％，操作溫度為10-25℃，PH為7.0-8.5。
10.按權利要求1所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述的步驟4的第二步PEG沉澱中，在第一步PEG沉澱的上清加入濃度40％的PEG，加入量為每100ml上清中加入5-25ml，操作溫度為10-25℃，PH7.0-8.5，沉澱溶解緩衝液為Tris-HCl，PH7.0-8.5。
11.按權利要求1所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述陰離子交換層析採用的系統是QAE，其中平衡緩衝液、洗滌液和洗脫液是Tris-HCl，PH7.0-8.5。
12.按權利要求11所述的製備纖維結合蛋白的方法，其特徵是所述第二次洗滌液含氯化鈉，其濃度為0.05-0.14M，洗脫液含氯化鈉，其濃度為0.16-1.0M。
全文摘要
本發明屬生物化學，血液學，生物製品學領域，具體涉及一種製備純化纖維結合蛋白的方法。本發明採用酒精沉澱，PEG沉澱，陰離子層析方法聯用製備纖維結合蛋白，同時製得纖維結合蛋白製劑和纖維蛋白原製劑，提高冷沉澱的利用度和最終製品的純度及穩定性。本發明製備工藝簡單，操作過程短，節約成本，適用於大生產。
文檔編號C07K14/435GK1438243SQ0311578
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月13日 優先權日2003年3月13日
發明者王小倩, 朱威 申請人:上海生物製品研究所