用於檢測循環腫瘤和內皮細胞的血液測試樣機和方法

2023-07-06 15:20:16

專利名稱：用於檢測循環腫瘤和內皮細胞的血液測試樣機和方法
相關申請本申請要求2003年10月31日提交的美國臨時專利申請系列號60/516,571的優先權，其全文在此引入作為參考。
背景技術：
1.發明領域一般而論，本發明涉及改良的細胞粘附基質(「CAM」)和用於分離靶細胞的改良的細胞分離裝置，所述靶細胞為例如來自血液或諸如腹水、刮片和塗片標本的其它組織液體樣品的腫瘤、胎兒和生血管細胞。更具體地說，本發明涉及可用於選擇性分離細胞的CAM系統，所述細胞例如為具有轉移潛能的靶癌細胞和/或顯示侵襲偽足(invadopodia)的內皮祖細胞。
2.相關技術的描述循環腫瘤細胞(CTC)和癌症檢測上皮組織惡性腫瘤是癌症的最常見形式，是造成大多數癌症相關死亡的原因。由於這些腫瘤手術治療的發展，因此死亡率更多地與早期轉移和復發相關聯，但這些早期轉移和復發在初期診斷時經常被忽略(Racila等，1998；Pantel等，1999)。例如，胰腺和其他胃腸(GI)器官解剖學位置相距較遠，在它們侵襲鄰近結構並生長成大於1cm腫瘤之前不太可能檢測到胰腺和其他GI癌症(Compton，2003；Flatmark等，2002；Koch等，2001；Liefers等，1998；Matsunami等，2003；Nomoto等，1998；Pantel等，1999；Walsh和Terdiman，2003；Weihrauch，2002)。甚至就乳癌而言，通過乳房造影術檢測的12-37％乳癌小腫瘤(＜1cm)在診斷時就業已轉移了(Chadha M等，1994；Wilhelm MC等，1991)。文獻中累積的證據表明在循環中所發現的上皮腫瘤細胞代表了轉移形成的最早病徵，可考慮將循環腫瘤細胞(「CTC」)用作獨立的癌症進展診斷法(Beitsch和Clifford，2000；Brandt等，2001；Feezor等，2002；Fehm等，2002；Ghossein等，1999；Glaves，1983；Karczewski等，1994；Koch等，2001；Liefers等，1998；Luzzi等，1998；Matsunami等，2003；Molnar等，2001；Wang等，2000；Weitz等，1999；Wharton等，1999；Racila等，1998；Pantel等，1999)。同樣地，從血液中分離出癌細胞的可靠方法對癌症的臨床診斷和治療應用將產生有意義的影響(Racila等，1998；Pantel等，1999)。一個稱為Mi期的新腫瘤期，業已被建議用於指示癌症患者循環中腫瘤細胞的存在。該期使得可以檢測循環腫瘤細胞(CTC)的血液測試的發展有所依據。癌症研究領域期待著能增加檢測靈敏性的相對於現有方法提高至少一個數量級的新腫瘤細胞富集方法的產生(Pantel等，1999)。
循環內皮祖細胞，血管發生和心血管危險內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化斑塊發展的重要刺激因素(Ross，1993)。已鑑定可分離自外周血單核細胞級分、骨髓和臍帶血的循環內皮祖細胞(「CEC」)為內皮細胞損傷之標誌(Asahara等，1997；Hill等，2003)。實驗室證據表明這些細胞表達多種內皮特異性細胞表面標記並具有眾多內皮特性。已注意到當這些細胞注射入具有局部缺血的動物模型中時，它們迅速地與新血管形成位點結合。在初步研究中，Hill等，2003發現低CEC水平與心血管危險因素及臂叢(brachial)反應性相關。業已表明在缺乏足夠的CEC下內皮損傷可能影響心血管疾病的進展。該初期研究指出了CEC在心血管疾病診斷和治療中的潛在應用。CEC通過提供細胞循環富集以促進血管生成而有助於內皮修復(Szmitko等，2003)。因此，CEC可作為心血管疾病危險的陰性預測因子。所以，CEC有效富集的方法在心血管疾病的診斷前和治療中將特別有用。
細胞異質性及現有的細胞分離技術在血液(細胞異質來源)中循環的腫瘤和內皮祖細胞非常稀少。這些細胞很難被純化用於分析。在癌症患者中，與非贅生細胞的數量相比，血液中的CTC或剝落的異常細胞(贅生細胞)數量通常較少。因此，通過常規細胞病理學進行的剝落的異常細胞檢測經常受限於之。此外，剝落的細胞常常是高度異質性，由多種不同細胞類型組成(有趣的是許多基因最初報導在剝落的細胞中差異表達，而實際上是在非腫瘤細胞中表達的)。由於增加了這種異質性問題，所以存在於每一臨床標本中的贅生細胞頻率易變，使得在隨機混合群體中不同基因表達的量化產生偏差並變複雜。在較大的腫瘤、外周血和腹水中常見凋亡和壞死的細胞。這些細胞不含高質量的RNA，因此對於分子分析來說存在著技術困難(Karczewski等，1994)。業已描述了多種循環腫瘤和內皮祖細胞的細胞富集方法a)顯微切割可用於逐一分離稀少的腫瘤細胞(Suarez-Quian等，1999)。該方法通常具有一些限制(1)後繼樣品處理過程複雜，(2)很難確定細胞生存力，以及(3)選擇要被切割的細胞主要是基於形態學上的標準，會造成高頻率的假陽性結果。b)也可以利用腫瘤細胞的物理特性，例如形狀、大小、密度或電荷(Vona等，2000)。已經發展了幾種密度梯度離心方法用於富集有核血細胞(不含成熟紅細胞)中的腫瘤細胞。密度梯度離心方法可獲得500到1000倍的細胞富集。富集的腫瘤細胞可接著用於分子分析，使用了高靈敏的測定方法，例如免疫細胞化學和逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，該逆轉錄聚合酶鏈式反應可用於擴增推定的腫瘤標記或內皮標記，例如胰腺特異性抗原(PSA)mRNA或細胞角蛋白19mRNA(Peck等，1998)。但是，這些方法不能有效地從正常細胞中富集有活力的腫瘤細胞。也就是說，500-1000倍的細胞富集通常認為是相對適度的富集，其實質上所產生背景噪聲對進一步的分子分析產生了不利影響。另外，基於物理分離技術的富集方法通常是麻煩、冗長的，且包括可導致細胞損害的步驟(如，超過2-3輪的離心)。c)基於抗體的技術是新近才發展的。免疫親合方法包括將抗體固定到物理載體或螢光標記上。在抗體與感興趣細胞表面上存在的其靶標結合後，接著進行分選步驟用於陽性或陰性富集期望的細胞類型。上述方法包括親合色譜法、粒子磁分離、離心或過濾，以及流式細胞術(包括螢光激活細胞分選術；FACS)。
(1)流式細胞術或螢光激活細胞分選術(「FACS」)從背景細胞中逐一檢測並分離單個細胞。在模式試驗中，該方法可檢測單核細胞級分中的乳癌細胞(Gross等，1995)和內皮祖細胞(Hill等，2003)，該單核細胞級分業已通過密度梯度離心富集自外周血。此外，在使用抗體塗覆的磁性微珠富集步驟後，FACS可檢測血液中天然存在的乳癌和胰腺癌細胞(Racila等，1998；Beitsch和Clifford，2000)。但是，在FACS方法中，捨棄了以簇或塊存在的細胞，且在某些情況下，例如，在卵巢癌中，大多數細胞都以團聚體存在，使得FACS CTC或CEC檢測基本無效。
(2)基於抗體塗覆的微珠方法可使用磁場(Racila等，1998)、柱層析、離心、過濾或FACS以獲得分離。儘管富集效率很高，但仍存在與所有基於抗體的細胞分離方法相關的內在限制。最重要的一個限制是癌細胞通常表達推定的腫瘤特異性抗原的程度不定(Sabile等，1999)；因此在收集過程中容易丟失大量和潛在的腫瘤細胞非隨機亞類。抗體也傾向於以有效的非特異性親和力結合損害的細胞，導致它們與感興趣細胞一起分離。總之，該基於抗體的細胞分離方法具有較預期更高的假陰性率。當前，抗體-啟動的磁性分離方法檢測到很低水平的CTC，即，每毫升乳癌和胰腺癌患者血液1-100個CTC(Racila等，1998)，或每毫升處於心血管疾病危險中個體血液小於50個CEC(Hill等，2003；Beitsch和Clifford，2000)。在一毫升(mL)或一克血液中大約存在5×109個紅細胞和5×106個有核白細胞。因此，要在一毫升的血液中檢測存在的數千個的癌或內皮細胞仍是一個具挑戰性的工作(Gulati和Acaba，1993)。在過去的20年中，已鑑定了在侵襲性腫瘤細胞表面發現的特殊複合物，該複合物促進了這些細胞從原發性腫瘤到轉移位點的運動(Aoyama和Chen，1990；Chen和Chen，1987；Chen等，1994a；Chen等，1984；Chen等，1994b；Chen，1996；Chen，1989；Chen和Wang，1999；Ghersi等，2002；Goldstein和Chen，2000；Goldstein等，1997；Kelly等，1994；Monsky等，1994；Monsky等，1993；Mueller等，1999；Mueller和Chen，1991；Mueller等，1992；Nakahara等，1996；Nakaliara等，1998；Nakahara等，1997；Pavlaki等，2002；Pineiro-Sanchez等，1997；Saga等，1988；Zucker等，2000；Zukowska-Grojec等，1998)。我們命名為「侵襲偽足」的這些複合物，結合併降解多種類型的上皮細胞基質(ECM)成分。在分化的正常血細胞或原發性腫瘤細胞上沒有發現侵襲偽足，且它們在死亡或垂死細胞中也無法起有效作用。侵襲偽足存在於循環內皮祖細胞中，但在超過99.999％的血細胞中不存在，也存在於孕婦外周血中發現的胎兒細胞中。本發明人已意識到基於侵襲偽足作用的富集步驟可有效地用於從發現於腹水、血液和許多其他體液的大多數細胞類型中分離有活力的轉移性腫瘤細胞和內皮細胞，並將克服上述其他技術所具之限制。
發明概述
在一個實施方案中，提供了用於分離血樣或其他組織液體樣品中有活力的特異性靶細胞的CAM，所述樣品用於疾病的篩選、診斷評估、預後和治療。本發明的CAM使用處在芯材周圍的細胞粘附材料以有效地促進包括CTC和CEC在內的靶細胞的粘附。有用的細胞粘附材料包括血源性粘附化合物，其包括，不限於，纖連蛋白、血纖蛋白、肝素、層粘連蛋白、生腱蛋白或玻連蛋白，以及合成的化合物，例如合成的纖連蛋白和層粘連蛋白肽，額外的細胞基質化合物，或其片段，它們的組合等等。CAM中有用的細胞粘附材料應具有能單獨或與其他材料結合有效地塗覆基質芯材的能力。所述芯優選包含化學非反應性的材料例如，但不限於，明膠顆粒、骨碎片、膠原、玻璃珠、惰性聚合材料(例如磁性膠體、聚苯乙烯、諸如尼龍的聚醯胺材料、聚酯材料、纖維素醚類和諸如纖維素醋酸酯的纖維素酯類)、氨基甲酸酯DEAE-葡聚糖以及其他天然和合成的材料，例如泡沫顆粒、棉花、羊毛、滌綸、人造絲、丙烯酸酯等等。CAM可用於形成塗層，例如形成約1.0-1.5mm厚的塗層。例如，CAM可包含塗覆有I型膠原溶液的明膠顆粒或玻璃珠芯材，所述膠原溶液隨後聚合形成膜。接著將該含有上述多孔的膠原塗覆珠子的膜暴露於樣品，例如含有一種或多種血源性粘附成分的血清或全血，該粘附成分促進諸如CTC和CEC的靶細胞的粘附。促進諸如CTC和CEC的細胞粘附的血源性粘附材料可包括，例如，基底膜成分例如纖連蛋白、血纖蛋白、層粘連蛋白、肝素，和玻連蛋白，其片段或它們的組合，或這些化合物的生物學模擬物，及其修飾形式，如外滲或內皮損傷所見的，以及可通過從天然來源純化或通過人工方法合成製備的。CAM可進一步包括特異性配體，其也識別並結合靶細胞，具有高靈敏性和高特異性。所述CAM膜可包括微珠，例如I型膠原塗覆的明膠微珠或玻璃微珠，覆蓋著血源性細胞粘附分子，例如存在於血液或體液中的那些，以及結合材料。例如，微珠可包含(但不限於)脫水的明膠顆粒或玻璃珠，直徑在200-2000微米範圍內。在一個實施方案中，所述微珠是成形的，或具有這樣的形狀和大小以便產生網格(anastomosic)通道使得血液流入膜中。在實施方案中，其中所述靶細胞是CTC和CEC，本發明的CAM膜優選對靶細胞CTC和CEC具有親和力和特異性，對諸如造血細胞小級分的其他細胞具有最小的親和力。CAM膜可設計來模擬動靜脈吻合處血管壁或轉移位置或心血管斑處的位點，在此細胞外基質(ECM)成分，包括膠原、蛋白聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白、血纖蛋白、肝素、生腱蛋白和玻連蛋白等等，在外滲或內皮損傷過程中業已得到修飾。實質上，使用在此提供的信息可以設計CAM組合物和供分析的表面結構，以改善對細胞微環境的模擬以便能最大程度地從全血中回收有活力的靶細胞，例如CTC和CEC。通過本發明方法分離的包括CTC和CEC的靶細胞一般都是有活力的，離體可具有生長能力，並具有對胞外基質成分ECM的粘附活性。從血液中分離的CTC和CEC可用於建立CTC和CEC的表達譜。本發明公開的CAM可用於，例如，癌症的檢測、診斷和治療。CAM可用於高親和力和特異性地識別並結合有活力的癌細胞，因此，該基質可用於從諸如獲得自癌症患者的血樣和/或腹水的液體樣品中分離癌細胞。CAM可用來捕獲患者樣品中轉移的癌細胞，用於診斷和監測上述癌症患者中的疾病。CAMs可用於檢測及分離有活力的循環轉移腫瘤細胞，其來自各種類型的癌症，包括，卵巢癌、諸如非小細胞肺癌和小細胞肺癌的肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌，宮頸癌、腎癌，腎上腺癌、甲狀腺癌和諸如結腸直腸癌的腺癌。或者，所述基質可用於捕獲血樣中的內皮細胞，用於檢測、診斷和治療患者心血管疾病。當來自心血管疾病患者的血樣與基質接觸時，CAM具有以高親和力和選擇性結合血樣中存在的有活力的內皮細胞的能力。不同發育階段的內皮細胞，包括祖內皮細胞，在心血管疾病診斷中可以使用，例如在該疾病患者的血管發生診斷中。本發明也提供了一種細胞分離裝置，使用本發明的CAM從諸如血液的液體樣品中分離靶細胞。上述裝置可提供，例如，一種能有效富集並鑑別靶細胞的「內皮細胞陷阱」，其中所述靶細胞是，例如，具有癌症和/或心血管疾病危險的患者外周血中有活力的內皮祖細胞。CAM啟動的細胞分離裝置可被設計以提供血液中有活力的循環腫瘤細胞和循環內皮細胞的100萬倍富集。在另一個實施方案中，CAM可用於捕獲和分離靶細胞，例如存在於孕婦母體循環中的胎兒細胞。然後，使用標準方法可將粘附在CAM上的分離細胞用於疾病產前診斷的分析，所述疾病例如唐氏症候群、馬凡氏症候群、Taysach氏病和其他疾病。使用本發明基質分離胎兒細胞使得用於疾病產前診斷的方法更加安全，因為胎兒細胞可直接分離自血樣，且孕婦無需侵入性操作。在本發明的該實施方案和其它實施方案中，使用標準的細胞分離技術，CAM富集或增加了對於血樣分析的正常可採用的細胞數量。利用本發明所公開的內容，CAM細胞富集可設計具有如下一個或多個特徵(a)以對疾病診斷必需的靶細胞具有高靈敏性和高特異性，從全血中100萬倍富集有活力的靶細胞，包括CTC和CEC；(b)同時存在的與其他正常血細胞和組織細胞的功能性和形態學鑑別，例如，包括CTC和CEC在內的靶細胞的細胞大小和密度；(c)全血可用於作為起始樣品或通過常用的密度梯度離心方法製備的細胞級分。CAM細胞富集可以是單步驟或多步驟方法。進一步披露的是CAM-啟動的細胞分離裝置，允許從單核細胞群中有效的捕獲有活力的靶細胞，包括CTC和CEC。可對來自患有諸如心血管疾病或癌症的疾病的患者的血液或組織液體樣品中的靶細胞進行分級，如共同未決的PCT專利申請PCT/US01/26735中所討論的，其要求了美國臨時申請號60/231,517的優先權(其全文所公開的內容在此引入作為參考)。這樣的裝置可包括，例如，優選固定於容器表面的CAM塗層，例如，但不限於，試管的內底表面、載玻片的表面，或培養皿的內底表面。當樣品放入該容器中時，CAM啟動的細胞分離容器的基質塗覆的表面優選被設計使得與樣品的接觸最大化。CAM啟動的細胞分離裝置可使用多種現有的實驗室診斷用容器，例如，細胞培養室載玻片、培養用微量滴定板、培養瓶等。CAM啟動的細胞分離裝置可旋轉以最佳地模仿血液流動，從而增加了細胞和CAM之間的接觸，因此促進了更有效的富集(例如，有活力的CTC和CEC的富集)。可基於本發明所公開的內容構造CAM啟動的細胞分離裝置，較共同未決的PCT專利申請PCT/US01/26735(要求美國臨時申請號60/231,517的優先權)中所描述的，其能更有效地從患有例如CTC相關疾病的患者的外周血中分離包括CTC的有活力的靶細胞。上述富集腫瘤細胞的方法和CAM膜也可容易地用作為陰性過濾步驟，用於收集的自體血液或骨髓以除去癌細胞。本發明公開的CAM啟動的血液過濾裝置可用於去除汙染性的癌細胞，例如，涉及癌症手術過程中進行血液再利用的自體輸血、治療性骨髓移植、外周血幹細胞移植和血漿分離置換，其中進行了自體輸血，此外，所述的CAM啟動的血液過濾裝置通過去除血液循環中能轉移的細胞，可用於預防由此產生的癌症全面擴散。同樣地，CAM啟動的血液過濾可用於製備無癌自體骨髓細胞，用於癌症患者中侵入性骨髓化療-放射後的置換。癌細胞檢測可通過分子擴增技術來改善，CAM-富集的細胞可用於多重分子分析中，例如DNA試驗、蛋白質試驗、以及免疫試驗中(例如，對來自患者的CTC和CEC具有特異性)。CAM-富集的細胞及其DNAs、RNAs、蛋白質或抗原可用於癌症診斷目的的多重檢測測定。在該多重CTC檢測測定中使用的細胞標記包括，但不限於，CTC侵襲性表型[膠原消化和通過細胞攝取的乙醯基LDL]、上皮抗原[細胞角蛋白、上皮特異性抗原(EpCAM、HEA、Muc-1、EMA、GA733-1、GA733-2、E-鈣粘蛋白、EGFR、TAGI2、脂籠蛋白2(癌基因24p3)]、內皮抗原[CD31/PECAM1、vanWillebrand因子(vWF)、Flt-1(VEGF受體)、VE-鈣粘蛋白]和其他腫瘤相關抗原[包括，但並不限於，癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體(EGFR)、人激肽釋放酶-2(HK2)、粘蛋白(MUC)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PMA)、人絨毛膜促性腺激素的13亞基(13-hCG)等]。標記可單獨或聯合使用以獲得對來自患者給定體積的血液或體液中有活力的腫瘤細胞進行鑑別和計數的結果。用於數據讀出的方法包括，但不限於，流式細胞術、螢光顯微術、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和定量實時RT-PCR等。CAM-富集的CTC細胞提供了用於癌症遺傳測試的來源。在CTC細胞中可對基因結構和功能的改變進行遺傳測試，包括，但不限於，癌基因(例如，ERBB2、RAS、MYC、BCL2等)、腫瘤抑制基因(例如，p53、APC、BRCA]、BRCA2、CDKN2A、CCND1、CDC2SA、CDC25B、KIP]、RB]等)、與腫瘤進展相關的基因[例如，癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體(EGFR)、人激肽釋放酶-2(HK2)、粘蛋白(MUC)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PMA)、人體絨毛膜促性腺激素的13亞基(13-hCG)等]、以及與轉移級聯相關的基因[例如，核苷二磷酸激酶的nm23家族(HJ-6)(細胞遷移)、PTEN/MMAC](細胞遷移和病灶性粘附)、CADJ/E-鈣粘素(細胞-細胞粘附)、MKK4/SEKi(對應激的細胞響應)、KISS-i(調節MIIMLP9表達)、BR/VISi(細胞運動性)等]。例如，非整倍性和CKi9、ERB2、CEA、MUG]、EGF受體、J3-hCG改變被用於乳癌的診斷；pS3、Ki-ras突變CDKN2A、LOH 3p、FHIP用於肺癌的診斷；p53、APC、CEA、CKi9、CK2O、ERBB2、Ki-ras突變用於結腸直腸癌、胃癌和胰腺癌的診斷；PSA、PSM、HK2用於前列腺癌的診斷；p53突變和小隨體(microsatellite)改變用於頭頸癌的診斷。遺傳標記可單獨或聯合使用以獲得對患者遺傳改變的有效檢測。用於數據讀出的方法包括，但不限於，流式細胞術、螢光顯微術、基於螢光或發色的聚合酶鏈式反應讀出術等。CAM-富集的CEC細胞及其DNAs、RNAs、蛋白質或在特定腫瘤中當前已知的抗原也可用於多重CEC檢測測定，用於檢測具有心血管疾病危險的患者。多重CEC檢測測定中使用的細胞標記包括，但不限於，CEC功能性表型[通過細胞攝取的乙醯基LDL]和內皮抗原[CD31/PECAM-1、van Willebrand因子(vWF)、Flk-1(VEGF受體)、VE-鈣粘蛋白]。標記可單獨或聯合使用以獲得對來自患者給定體積的血液或體液中有活力的內皮細胞進行鑑別和計數的結果。用於數據讀出的方法包括，但不限於，流式細胞術、螢光顯微術、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和定量實時RT-PCR等。CAM-富集的CEC細胞可進一步提供癌症遺傳測試的來源。換句話說，使用通過CAM富集的CTC細胞可對患者基因結構和功能的改變進行遺傳測試。遺傳標記可單獨或聯合使用以獲得對患者遺傳改變的有效檢測。在一個實施方案中，通過選擇合適的芯材和細胞粘附塗層，使用消化酶可容易地從裝置表面釋放CAM上捕獲的有活力的細胞，所述消化酶包括，但不限於，膠原酶、胰蛋白酶/EDTA溶液(購自GIBCO)以及透明質酸酶。例如，CAM膜的細胞粘附分子和膠原或明膠可對消化是敏感的。酶將剪切細胞和基質之間的結合，將有活力的細胞從CAM膜上釋放到懸浮液中。例如，當I型膠原作為支撐細胞粘附分子的骨架時，使用膠原酶可有效地將CAM-捕獲的細胞釋放到懸浮液中。本發明的檢測方法可用於癌症診斷目的，例如，早期檢測、監測治療和手術響應以及癌症進展的預測。CAM-富集的CTC可用於，例如，在使用當前分離腫瘤細胞的手術方法之前檢測癌症、監測治療和手術響應、改善癌症分期的準確性、以及確定患者腫瘤的轉移潛能。使用本領域技術人員公知的額外的多重分子測定法，這些應用可得到進一步增強，所述方法例如測定患者的遺傳改變、校驗循環腫瘤細胞的組織來源、測定所述癌症類型的分子標記、以及確定腫瘤細胞毒性白細胞計數或相關補體減少的程度。預後和治療效果也可以通過本發明的檢測方法來判定。例如，在治療性介入過程中及之後有活力的CTC計數可用於確定治療效果。結合使用顯微成像術和流式細胞術可以檢測並定量CAM-富集的CTC及相關的抗腫瘤宿主的免疫性。通過確定那些沒有不適當副作用的最有效地減少血樣中有活力的CTC數量的治療方案，可以優化對化療治療方案的選擇。也可通過讓CAM-富集的CTC進行一組離體化療治療方案，進行對化療治療方案選擇的優化。接著可給予同一患者有效劑量或藥物組合。在給予所述化合物或試劑之前及之後測定有活力的CTC的數量。在給藥後明顯減少有活力的CTC數量的化合物或試劑可選擇作為有希望的抗癌劑。具有療效的試劑是其能減少CTC數量、增加細胞毒性白細胞和補體系統(宿主免疫性)以及抑制腫瘤細胞增殖的那些。本發明的檢測方法也可用於檢測新的化合物或試劑能否抗心血管疾病，或具有其他活性。應當指出在循環中，由於對腫瘤的宿主免疫性存在，所以大多數CTC是死亡或凋亡的，正如共同未決的PCT專利申請PCT/US01/26735中所述的。CTC和腫瘤相關細胞毒性白細胞的活力、以及對來自個體供體自體補體系統的測定相結合成為一種測定抗腫瘤宿主免疫性的有效方法。當通過CAM富集的有活力的CTC數量在缺少自體血漿時高但在存在自體血漿時低時，可以認為患者具有抗腫瘤免疫性。另一方面，在存在和不存在抵禦免疫殺傷的自體血漿下，失去抗腫瘤免疫性的患者將具有高水平有活力的CTC。通過CAM方法從癌症患者血液中富集的有活力的CTC也可用於與樹突細胞融合，用於抗癌疫苗的開發。例如，可將患不同癌症單個患者的CTC進行離體培養和擴增，細胞可完全利用，或針對特定的膜結構或特定的抗原進行純化，以與樹突細胞相互作用用於開發有效的腫瘤疫苗。通過CAM方法從癌症患者血液中富集的細胞毒性淋巴細胞就其自身而言是有價值的與非腫瘤相關的淋巴細胞相比，仔細比較它們的基因表達譜，可產生涉及正在發生的免疫反應和炎症類型的有價值信息，該免疫反應和炎症被發動對抗轉移性腫瘤細胞。此外，其他有用的治療方法可以體內擴展這些細胞，例如，使用IL-2，接著再將它們導入到患者體內以增加它們的抗腫瘤免疫響應。在治療黑色素瘤和其他腫瘤中該方法具有驚人的效力。本發明的實施方案可用於診斷和治療目的，提供分離例如患者體內大量的其他循環細胞與轉移的小級分CTC的能力。本發明的實施方案(1)能特異性地分離有活力的靶細胞，例如腫瘤和內皮細胞，而不涉及無關或損傷的細胞；(2)從全血的超過五十億個細胞中，能獲得超過一百個諸如腫瘤或內皮細胞的靶細胞的富集；(3)在相同的測試條件下，能容易地從正常血細胞中鑑定出諸如「癌細胞」或「內皮祖細胞」的靶細胞；(4)能從背景正常血細胞中富集用於診斷和治療患有諸如轉移性癌症和心血管疾病的疾病患者的細胞。
附圖簡述


圖1A描繪了CAM 16孔室載玻片的前視圖，其底部表面塗覆有CAM膜，例如螢光標記的膠原薄膜，能富集用於癌症和心血管疾病診斷的循環腫瘤細胞和內皮祖細胞；
圖1B描繪了CAM 96孔室載玻片的前視圖，其底部表面塗覆有CAM膜，例如螢光標記的CAM膜，該膜包含能富集用於癌症和心血管疾病診斷的循環腫瘤細胞和內皮祖細胞的膠原；圖2A、2B和2C描繪了直立的7ml、15ml和30ml可在疾病診斷中使用的真空血液收集試管的前視圖，該試管沿其內表面塗覆有CAM膜；
圖2D描繪了直立的沿其內表面塗覆有CAM膜的組織培養瓶的前視圖，該瓶可用於癌症和心血管疾病診斷和治療；
圖2E描繪了諸如圖2A-2D中容器中的CAM膜的放大的前視圖3A描繪了直立的血液收集試管的前視圖，其帶有塗覆有CAM膜的浸量尺插入物；
圖3B描繪了圖3A浸量尺的前視圖4A描繪了血液過濾盒的三維視圖，該盒包含用於導入要被過濾的樣品的在外殼中的預過濾器篩網入口；塞滿塗覆有薄的CAM膜的細胞分離珠的主要過濾室；用於除去過濾的血液的在外殼中的後過濾器篩網出口，其可與本發明的用於診斷、治療或處理的血液過濾系統結合；以及
圖4B是圖4A塞滿塗覆有CAM膜的細胞分離珠的主要過濾室放大的橫斷面圖，描繪了內部密封區由細胞分離珠所形成的網格通道。圖5是來自卵巢腺癌腹水的白細胞(A)和腫瘤細胞(B)/(C)/(D)的免疫細胞化學顯微照片，所述細胞通過細胞粘附基質富集，使用了抗CD45抗體、全白細胞抗原、以及全細胞角蛋白(B)/(C)或CD-31(D)，而無陽性選擇的(A)/(B)及(C)/(D)抗體EpCA。圖6A-C是選自的DNA微陣列簇10個基因表達的實時RT-PCR相對表達分析，有關於來自腹水的腫瘤細胞(圖6A和6B)以及來自原發性實體瘤的腫瘤細胞(圖6A和6C)。
本發明實施方案的詳述
本發明涉及取自患者的液體樣品中靶細胞的分離和檢測，所述靶細胞用於篩選、診斷和處理諸如癌症和心血管疾病的疾病，並用於產前診斷。使用本發明的方法利於從取自患者的液體樣品中分離靶細胞。這樣細胞的分離可用於處理與該細胞相關的疾病狀態。例如，取自患者的血樣中腫瘤細胞和內皮細胞分別是轉移性癌症和心血管疾病的指示。同樣地，存在於孕婦血液中的胎兒細胞可由此分離並用於與胎兒相關疾病的產前診斷。本發明的實施方案涉及靶細胞分離，包括使用基於侵襲偽足粘附表型行為捕獲靶細胞的功能性富集方法進行的腫瘤、內皮和胎兒細胞分離策略。這種細胞粘附特性，表現出與模仿血管微環境的ECM基質高親和力和特異性結合的傾向，似乎是並不是由一種特異性蛋白所介導的，而是通過蛋白複合物介導的，該蛋白複合物包括簇集在稱為「侵襲偽足」的細胞凸出物表面上的特異性細胞粘附受體整聯蛋白。
CAM細胞富集
CAM細胞富集的腫瘤和內皮細胞分離策略包括使用功能性的富集方法，其基於對材料的粘附表型行為來捕獲靶細胞，如過去幾十年所詳細描述的(Aoyama和Chen，1990；Chen和Chen，1987；Chen等，1994a；Chen等，1984；Chen等，1994b；Chen，1996；Chen，1989；Chen和Wang，1999；Ghersi等，2002；Goldstein和Chen，2000；Goldstein等，1997；Kelly等，1994；Monsky等，1994；Monsky等，1993；Mueller等，1999；Mueller和Chen，1991；Mueller等，1992；Nakahara等，1996；Nakahara等，1998；Nakahara等，1997；Pavlaki等，2002；Pineiro-Sanchez等，1997；Saga等，1988；Zucker等，2000；Zukowska-Grojec等，1998)。業已發現具有侵襲偽足的細胞(「侵襲偽足細胞」)與模擬血管微環境的基質以高親和力結合，特別是在幹擾狀態下。基於侵襲偽足的行為，可以設計功能性細胞富集步驟，該步驟對有活力的轉移性腫瘤細胞和血管原性內皮細胞具高選擇性且可捕獲極少的白細胞/單核細胞和紅細胞，並在溶液中留下其他類型細胞。CAM細胞富集測定可額外包括陰性鑑定/選擇過程，該過程使用了直接抗白細胞共同抗原CD45的抗體。本發明方法採用的CAM包含了不進行生物化學反應的芯，如膠原聚合物，其與細胞粘附分子、特別是天然和合成的血源性粘附分子物理締合。CAM優選設計成允許有活力的腫瘤細胞粘附在基質上，同時避免粘附於血液中正常的背景細胞；也就是說，允許有活力的腫瘤細胞以大的親合力粘附，但避免粘附於正常細胞(優選包括，例如，超過99.9％的白細胞和99.9999％的紅細胞)及死亡或垂死的腫瘤細胞。該CAM塗層也可包含能與一種或多種CAM-侵襲細胞反應的配體(如，抗體、螢光和/或比色標記等等)。該配體可產生可見或不可見的(但可檢測的)CAM改變，作為要被檢測的一個或多個細胞存在的指示。或者，這樣的配體可串列布置在與CAM相關聯的分離的檢測層中。CAM薄塗層優選固定在細胞分離部件的內底表面。因此，CAM可用於成功地從例如，來自I和IV期非小細胞肺癌(NSCLC)患者血樣的單核細胞級分中回收有活力的腫瘤細胞。CAM方法也可用於標記鑑定目的的腫瘤細胞。例如，當使用螢光標記的膠原製備CAM時，就標記了侵襲性腫瘤細胞，因為它們具有消化和攝取膠原的傾向。相反地，正常細胞就不幹擾CAM。就所期望富集的侵襲偽足細胞而言，CAM組合物和試驗表面結構可設計成改善對血管內微環境的模擬，使得從諸如全血的樣品中回收最多數量的有活力的期望細胞。侵襲偽足細胞更有效的富集也可通過使用部件旋轉方法而獲得，該旋轉方法能最佳地模仿血液流動並增加腫瘤細胞與CAM之間的接觸。在一個優選的實施方案中，樣品通常應以規定保留樣品中侵襲偽足細胞活力的方式進行處理。
CAM-啟動的細胞分離裝置
CAM啟動的細胞分離裝置可包括多種設計，例如細胞培養室載玻片、培養用微量滴定板、或培養瓶等。例如，如圖1所示，CAM啟動的細胞分離裝置在一個單位陣列(14)中可包含多個孔(12)，在一個或多個孔(12)的底部具有CAM(10)。圖1A說明的是一個13-孔微陣列，而圖1B說明的是一個96-孔微陣列。CAM啟動的細胞分離裝置可包括各種形狀(16，18，22)的血液收集試管，可裝有或不裝有蓋(20)；或諸如圖2所示的容器(24)，在其內壁上塗覆有CAM膜(10)，底表面(26)未塗覆，裝有或不裝有蓋(20)。優選地，上述容器在使用前是滅菌的。CAM啟動的細胞分離裝置可用於，例如，從置於容器中的樣品(28)中分離CAM(30)中的CTC和/或CEC。CAM(10)可包括，例如，併入包含細胞粘附材料的層(30)內的玻璃珠(34)。CAM啟動的細胞分離裝置可使用包含測量卡(38)的浸量尺(36)，如圖3B中的透視圖和剖視圖，測量卡(38)的表面塗覆有CAM膜。浸量尺或測量卡插入到細胞分離容器(16)中。CAM膜可覆蓋在浸量尺(38)表面上和/或試管(16)和/或蓋(20)的內壁上。在一個實施方案中，CAM啟動的細胞分離裝置還包括分離前和/或分離後的部件，例如過濾器(如Amicon過濾器、中空過濾器)、膜、或幫助在細胞群與CAM膜接觸前分離出細胞群的梯度(gradients)(如水溶性聚蔗糖、蔗糖等)。至於圖4，所示的是血液過濾盒(43)的三維視圖，該盒包含用於導入要被過濾的樣品的在外殼中的預過濾器(41)，例如篩網(或CAM-塗覆的篩網)，塞滿CAM(10)的主要過濾室(40)，和在外殼中的後過濾器(42)出口。圖4B是塞滿CAM(10)的主要過濾室(40)放大的橫斷面圖。在一個實施方案中，CAM啟動的細胞分離裝置的CAM膜包含膠原塗覆的微珠，直徑在200-2000微米範圍內，成形以產生網格通道使得血液流入膜中。在該血液過濾單元中的全血可在約37℃下溫育，並旋轉以模仿血液流動以增加細胞和CAM之間的接觸和，以及支持從血液中有效地富集有活力的細胞。含有諸如腫瘤細胞和內皮祖細胞的靶細胞的血液可貯藏在CAM-啟動的富集裝置中持續4-48小時的一段時間，以便增加富集效率。在設計CAM啟動的細胞分離裝置和系統時需要注意三個參數(i)CAM組成和試驗表面結構，用以改善對腫瘤血管內微環境的模擬，以便從全血中回收最大數量的有活力的腫瘤細胞；(ii)部件旋轉程序，用以最佳地模仿血液流動，增加腫瘤細胞與CAM之間的接觸，並促進更有效地富集有活力的腫瘤細胞；以及(iii)血液處理方式，用以改善在血樣中腫瘤細胞活力的保留。上述用於富集腫瘤細胞的陽性CTC選擇方法也可作為陰性過濾步驟用於收集自體血液或骨髓，以除去癌細胞。因此，本發明的CAM啟動的血液過濾方法可用於癌症手術過程中進行血液再利用的自體輸血、治療性骨髓移植、外周血幹細胞移植和血漿分離置換。所述的CAM啟動的血液過濾裝置通過去除循環中能轉移的細胞，可用於預防由此產生的癌症全面擴散。可以進行特異性和靈敏性對照試驗以優化試驗中腫瘤細胞富集的效率。重要的變量包括(a)CAM捕獲後外源添加的腫瘤細胞系的活力，(b)最有效富集並分離有活力的腫瘤細胞的條件，以及(c)導致細胞從CAM膜上完全洗脫的細胞處理方式。
實施例1來自血液的CTC和CEC
可將全血置於CAM血液收集裝置中，例如血液收集試管(圖2和3)。該試管可在約37℃下溫育，並旋轉以模仿血液流動以便增加細胞和CAM之間的接觸。可在抗凝血劑存在下進行血液收集，例如，每mE枸櫞酸鹽葡萄糖抗凝劑溶液USP(ACD，Baxter HealthcareCorporation，Deerfield，IL)中添加50單位的肝素鋰，以阻止CAM血液測試裝置中血液凝固。密封的CAM-血液試管可置於滾筒中，在約37℃下每分鐘旋轉5-30轉，接著溫育1-3小時用於產生細胞粘附。
實施例2特異性和靈敏性對照
可選擇不同腫瘤來源的人腫瘤細胞系用於進行特異性和靈敏性對照試驗。例如，可使用人結腸腫瘤細胞系SW-480、人胃腫瘤細胞系RF-48、幾種乳腺腫瘤細胞系、人惡性黑色素瘤細胞系LOX、以及幾種卵巢腫瘤細胞系。腫瘤細胞系可購自美國典型培養物保藏中心(Manassas，VA)。所有的細胞系應確認對支原體(Mycoplasma)感染是陰性的。對腫瘤細胞系應檢驗(a)平板接種後1小時之內對CAM高親和力結合；(b)高增殖率；以及(c)在使用或用表達質粒轉化前，腫瘤細胞系應容易且穩定地(100％)用紅色或綠色螢光染料進行螢光標記，所述質粒表達綠色螢光蛋白(GFP)以便能在富集處理結束時直接可見腫瘤細胞。對照正常血液可用已知的一些綠色螢光標記的或GFP表達性螢光性人腫瘤細胞接種，並進行CAM細胞富集方法，以評估它們的可比較效率。來自健康供體的全血或來自臍帶的臍帶血可通過NationalDisease Research Interchange(Philadelphia)獲得。在採血後，血液應馬上添加枸櫞酸鹽葡萄糖抗凝劑溶液USP(ACD，Baxter HealthcareCorporation，Deerfield，IL)和肝素鋰以阻止經常在進一步試驗操作過程中所發生的血液凝固。正常的血液不含有具癌特性的細胞。因此，摻入到這些血樣中的腫瘤細胞應當是在該特異性和靈敏性檢測中所唯一回收的。來自健康個體的臍帶血或血樣可用已知的一些螢光標記的，即螢光染料預標記的或GFP-標記的腫瘤細胞接種。可將3mL等份量的混合血樣轉移到CAM測定裝置中用於腫瘤細胞富集。可除去懸浮的血細胞。例如，當I型膠原為支撐CAM膜的骨架時，使用膠原酶可將CAM捕獲的細胞釋放到懸浮液中。為了測定來自臍帶血的對照有活力的腫瘤細胞的數量，例如，可摻入約3,000個GFP-腫瘤細胞到3mL臍帶血(約15,000,000,000個血細胞)或細胞完全培養基(含15％人血清)中並進行CAM富集。回收自培養基的細胞可指示實際上有活力的腫瘤細胞的數量。(回收自臍帶血的細胞數量)/(回收自培養基的細胞數目)的比率表示該測定的效率。與培養基相比，臍帶血有活力的腫瘤細胞回收百分數可用於確定CAM富集測定所用的最佳條件。這些條件包括CAM-血液試管溫育一段時間(如，1-3小時)、旋轉速度(如，每分鐘5-30轉)、以及貯藏血液以保持細胞活力的時間長度(如4-48小時)。極其大量存在的背景血細胞將阻止癌細胞與CAM表面的直接接觸，並減弱CAM方法的靈敏性。血液收集試管的CAM膜能有利地設計為使得CAM與腫瘤細胞表面接觸面積最大化。細胞溫育的時間長度也很重要，因為CAM依賴於腫瘤細胞區別於造血細胞的差異粘附。
實施例3相對於血液收集試管，在CAM-血液過濾裝置中測定細胞活力
另一個難題是血樣的細胞活力在運送到研究實驗室路程中會改變。增加貯藏時間預計可能危害血液中細胞。為確定CAM血液裝置中的腫瘤細胞在運送過程中是否保持活力，將3,000個GFP-腫瘤細胞摻入到3mL臍帶血及含有15％人血清(Sigma)的對照培養基中。每一等份試樣在4℃下貯藏一系列時間(4、6、8、12、16、24、36和48小時)。然後，通過CAM對每一等份試樣進行捕獲，並通過CAM測定GFP-腫瘤細胞回收百分率。對每一時間點，進行4次重複試驗，並測定回收百分率。結果顯示CAM-捕獲的腫瘤細胞活力優於血液中懸浮的細胞。可使用本領域普通技術人員已知的任何方法對CAM-富集的細胞計數，包括鏡檢和流式細胞術(參見如下詳細的方法)。對於細胞富集試驗而言，通過鏡檢計數獲得的初步數據表明回收率隨摻入劑量而增加，大致依照對數曲線。使用本發明公開的CAM-啟動的細胞分離裝置，在原始樣品每毫升血液中存在多於1,000個GFP-LOX細胞時，可獲得約40％的摻入臍帶血中的GFP-LOX人惡性黑色素瘤細胞的回收率，變率約為10％。
使用流式細胞儀計數並確認患者血液中有活力腫瘤細胞的策略
在臨床實驗室中，可通過多參數流式細胞分析儀測定標記的腫瘤細胞，使用FITC標記的膠原(綠色)來檢測侵襲性腫瘤細胞，使用PE標記的抗-CD45白細胞共同抗原抗體(紅色)來檢測並排除白細胞，以及使用7-AAD來排除死亡的細胞。該自動化的細胞分析可通過使用鏡檢術進行平行和獨立的鏡檢評估來驗證，例如，使用細胞譜系標記，包括抗上皮、內皮和造血抗原的抗體。可使用多參數流式細胞分析儀通過流式細胞術對血液中侵襲性腫瘤細胞進行計數，使用了，例如(a)FITC標記的膠原，其可為腫瘤細胞所攝取(綠色)以檢測侵襲性腫瘤細胞，和(b)PE-標記的抗-CD45白細胞共同抗原抗體(紅色)，用於檢測並排除細胞群中已汙染的白細胞。例如，通過CAM捕獲的腫瘤細胞和共分離的正常血細胞可用藻紅蛋白(PE)-綴合的CD45抗體和死亡細胞核酸染料7-AAD後染色。吸出標記的細胞樣品並進行分析，例如，在FACSCalibur流式細胞測定器(Becton Dickinson)上進行分析。除其它因素之外，用於數據分析的標準可包括(a)通過前向光散射確定的尺寸，(b)通過正交光散射確定的粒度，(c)死亡的7-AAD細胞陰性事件，(d)PE-標記的CD45單克隆抗體(mAb)正常細胞的陰性事件，以及(e)FITC-腫瘤細胞的陽性事件。本領域技術人員應當明白，存在幾種從異源臨床標本活細胞中辨別凋亡和死亡細胞的細胞計量法(例如，使用FITC-標記的膜聯蛋白V和碘化丙錠)。例如，為將細胞活力測試整合入CAM純化的細胞的多參數流式細胞術中，在固定的CAM細胞群中可使用7-氨基-放線菌素D(7-AAD，Molecular Probes)標記死亡細胞。7-AAD可為488nm的氬雷射譜線所激發，並發射遠紅外光。7-AAD輻射光譜可與FITC和PE輻射所分離(OLIVER等，1999)。螢光參數容許鑑定CAM純化的血液細胞亞群中的死亡細胞(7-AAD)、有活力且具侵襲性的腫瘤細胞(FITC-膠原)以及白細胞(PE-CD45)。新標記的細胞可遞送至流式細胞儀分析室中用於即刻計數或貯藏在懸浮液中，例如，在4℃下貯藏1-3天。可設定FACSCalibur流式細胞測定器每小時計數2-4個細胞樣品。在獲得自癌症或心血管疾病患者個體的典型血樣中，循環腫瘤和內皮細胞在數量上大大地超過(在超過100萬倍的範圍內)正常造血細胞。雖然所述的實施方案並不受限於任何具體假說，但本發明人假定(a)在癌症進展最初期，轉移性細胞開始出現於原發性腫瘤；這些細胞具有侵襲行為，(b)作為癌症存在指示的血液腫瘤細胞群能用於早期診斷和進一步的分子分析，以及(c)存在於循環和原發性腫瘤細胞中基因的診斷性組合可用於確定循環腫瘤細胞的組織位置來源、確定特異性癌症亞型、以及高置信度地預測患者的轉移潛能。
CAM培養方法富集細胞的鏡檢特性
可平行進行高產量的CAM培養，作為獨立的CAM方法，以驗證通過CAM富集和流式細胞儀計數的腫瘤細胞。使用鏡檢和免疫細胞化學方法可容易地放大該CAM培養方法，上述鏡檢和免疫細胞化學方法使用了細胞譜系或推定的腫瘤標記。鏡檢可用於鑑定通過CAM富集自血液的CTC，具有如下特徵，表示為Co+/Epi+/Endo+/Leu-；CEC為Co-/Epi-/Endo+/Leu-；腫瘤相關的淋巴細胞為Co-/Epi-/Endo-/Leu+。具體來說，該CTC是1)來自攝取和濃縮的TRITC-標記的膠原片段的陽性螢光(Co+；降解和攝取ECM傾向是侵襲性和轉移性細胞的標誌之一)。
2)對上皮特異性標記的陽性免疫細胞化學檢測，包括細胞角蛋白和上皮膜抗原(BerEP4、EpCAM、GA733和Muc-I)(Epi+)。
3)對內皮特異性標記的陽性免疫細胞化學檢測，包括CD31，vanWillebrand因子(vWF)和VEGF受體(Endo+)。
4)對白細胞/單核細胞譜系標記的陰性免疫細胞化學檢測，包括CD45、CD14和CD68；對白細胞樣細胞學陰性(Leu-)。將CAM細胞室方法的抗體標記設計與差分幹涉對比(DIC)亮視野相結合，並使用三重螢光過濾器，例如可使用Nikon Eclipse E300倒置螢光顯微鏡，提供了在每一顯微視野內鑑定腫瘤細胞的強有力的多重方法。在同一個螢光顯微視野中，儘管APAAP染色的細胞型標記在DIC亮光下呈現紅色，但侵襲性細胞的TRITC-膠原標記觀察到的是紅色螢光，FITC-細胞型標記觀察到的是綠色螢光，而Hoechst 33258核染料發出藍色螢光。圖片可儲存在計算機硬碟驅動器中，可藉助於諸如Metamorph圖像分析軟體(Universal Imaging Corporation)的軟體對樣品中帶色或螢光標記的細胞數量計數。載有CAM-富集和標記的細胞的載玻片可在螢光顯微鏡下對陽性腫瘤細胞掃描。
CAM-富集細胞的多重分子分析微陣列和實時RT-PCR
相對於預計存在於白細胞中的那些，在循環腫瘤細胞中預計特異性存在的mRNAs表達水平可用作為富集成功程度的量度標準。在給定細胞群中腫瘤細胞的百分數可使用上皮(GA733-1)和白細胞(CD45)標記的表達來確認，使用了腫瘤細胞系和白細胞樣品作為陽性對照。例如，對純化自血樣的細胞樣品使用Roche LightCycler，可進行實時RT-PCR。可進行上皮標記GA733-1和白細胞標記CD45相對於β-肌動蛋白的實時PCR定量。預計上皮標記GA733-1在純腫瘤細胞亞群和腫瘤細胞系中高水平表達，而不在白細胞中高水平表達。而且，白細胞標記CD45應在白細胞樣品和不純的腫瘤細胞群中被檢測到，而不在腫瘤細胞系或純腫瘤細胞樣品中被檢測到。在回收的腫瘤細胞樣品中觀察到的真實GA733-1信號可解釋為證明了CAM富集方法恢復了細胞庫，其中腫瘤特有的標記能容易且可再現地被測定。測定每一CAM腫瘤細胞群中CD45信號水平也是重要的，該信號水平指示了白細胞汙染的程度。如果觀察到實質上的汙染，那麼可推斷，例如，CD45陰性選擇步驟對於測試而言是必須的，且需要整合入最終的實驗方案中。大多數實體癌的分子機制尚不清楚。在每一臨床標本中，癌細胞的數量和病理學類型是易變的；癌細胞周圍還圍繞著許多類型和數量的正常細胞。此外，在進展和轉移過程中腫瘤細胞改變了它們的基因表達譜。CAM細胞富集方法提供了有活力的腫瘤細胞群，它們可用於離體腫瘤細胞的分子分析，該分析使用了DNA微陣列和實時RT-PCR分析。這些有活力的腫瘤細胞群能拓寬發現通常表達於來自原發性腫瘤和血液的腫瘤細胞的基因，以及特定上皮癌的腫瘤細胞中特異性表達的基因的研究。如表1和2所示，本發明的細胞分離方法已用於鑑定分離自血樣的腫瘤細胞，該鑑定使用了DNA微陣列和RT-PCR技術。數據顯示了特定腫瘤細胞類型的特徵基因的表達。
表1.細胞樣品及其原始臨床標本的組織病理學信息*
*在總共77個細胞樣品中，41個細胞樣品通過DNA微陣列檢查；63個細胞樣品通過實時RT-PCR檢查；27個細胞樣品通過DNA微陣列和實時RT-PCR檢查。
表2A.富集自卵巢和子宮腫瘤標本的不同類型腫瘤細胞中正調節的126個基因
表2B.富集自卵巢和子宮腫瘤標本的不同類型白細胞中正調節的48個基因
表2C.富集自卵巢和子宮腫瘤標本的不同類型成纖維細胞中正調節的45個基因
測定宿主抗腫瘤免疫性的方法和組合物
由於宿主存在著對腫瘤的免疫性，因此在循環中大多數CTC是死亡或凋亡的，如共同未決的PCT專利申請PCT/US01/26735所述的。CAM-啟動的血液裝置，CTC活力以及來自個體供體的血漿結合成為測定宿主抗腫瘤免疫性的有效方法。CAM-富集的CTC經常與細胞毒性的白細胞形成簇。細胞粘附基質可容易地分離這樣的免疫和癌細胞複合物的簇，所述複合物來自可能具有給人希望的預後的患者。此外，與腫瘤細胞溶解相關的補體系統可溶組分能通過在自體血漿存在下CTC的活力來測定，該自體血漿來自同一患者的血液。因此，對於宿主免疫性而言，腫瘤細胞毒性白細胞和可溶性補體系統的存在應該是重要的指示劑。為測定存在抗腫瘤細胞毒性白細胞和補體系統下有活力的CTC數量，在存在10-20％自體血漿下可通過CAM-啟動的細胞分離裝置篩選全血或單核細胞。當在不存在自體血漿下通過CAM富集的CTC數量高，而在存在自體血漿下數量低時，患者可能具有高的抗腫瘤免疫性。另一方面，在自體血漿存在和不存在下檢測到的抵抗免疫殺死的高水平的有活力CTC，應當是患者具有高度的惡性腫瘤的最強指示劑。
實施例4來自全血的腫瘤細胞的CAM陽性分離
用於從全血中分離腫瘤細胞的例證性實驗方案如下1.製備臍帶血在CAM血液測試裝置的每個試管中添加摻入已知數量GFP-腫瘤細胞的3mL抗凝的臍帶血(加入300μg的ACD和肝素鋰)。將密封的CAM-血液試管放置在滾筒上，在37℃下以每分鐘5-30轉進行旋轉。溫育1-3小時以產生腫瘤細胞粘附。
2.製備對照培養基在CAM血液測試裝置的每個試管中添加摻入已知數量GFP-腫瘤細胞的3mL對照培養基(加入300μg的ACD和肝素鋰)。將密封的CAM-腫瘤試管放置在滾筒上，在37℃下以每分鐘5-30轉進行旋轉。溫育1-3小時以產生腫瘤細胞粘附。
3.用移液管小心地除去血液或培養基上清液。用3mL洗滌溶液(PBS/0.1％，BSA/10％，ACD和肝素鋰)洗滌試管5次，不要擾動內壁上的CAM膜。
4.在已徹底洗淨和除去紅細胞的CAM血液過濾裝置的每個試管中添加1mL膠原酶溶液。將密封的CAM-血液試管放置在滾筒上，在37℃下以每分鐘5轉進行旋轉。溫育10分鐘，以便溶解CAM並釋放腫瘤細胞到懸浮液中。膠原酶溶液(PBS，0.3mM CaCl2，0.2μg/mL I型膠原酶[Worthington Biochemical]，25μg/mL DNase[Roche])。
5.將懸浮液轉移到新的Bppendorf管中。在冰上立刻用TRITC-抗-CD45(用於鏡檢)或PE-抗-CD45(用於流式細胞術)進行免疫螢光標記。通過鏡檢和流式細胞術對標記的腫瘤細胞計數。
實施例5含有螢光材料的CAM膜
如果CAM基質發螢光的話，則侵襲偽足細胞消化並內化ECM基質，那麼腫瘤細胞在富集過程中應當發出螢光。為達到該目的，在CAM塗覆到捕獲容器之前，將發螢光的TRITC或FITC-I型膠原聚合物摻入到CAM底物中。陰性鑑定方法可用於區別癌細胞和白細胞，該方法使用了抗白細胞共同抗原CD45的藻紅蛋白(PE)-或FITC或TRITC-綴合的抗體。當前，RT-PCR和免疫細胞化學(靶向上皮分子，例如CK18和CK20細胞角蛋白，GA733上皮膜抗原，Muc-1和全上皮抗原BerEP4)被用於確認上皮來源的循環腫瘤細胞(Ghossein等，1999；Molnar等，2001；Racila等，1998；Schoenfeld等，1997；Soeth等，1997；Vlems等，2002；Wharton等，1999)。儘管這兩種方法都具有高檢測靈敏性，並在全血單核細胞級分的差異離心富集(約500)後能成功地用於分辨血液中的循環腫瘤細胞，但檢測率低，這是因為血液中每10億個正常細胞中所存在的循環腫瘤細胞少於100個。此外，無法獲知是否該方法捕獲了最關鍵的細胞，因為仍然無法獲知循環轉移進程中的關鍵基因。基於抗上皮抗體的親和純化的應用將導致血液中腫瘤細胞大量損失。相反地，CAM可在一步反應中達到100萬倍的富集，從來自15×109個血細胞的3,000個有活力的腫瘤細胞獲得大於40％的收率。為了進一步改善靶細胞的富集，可進行多步驟的細胞富集方法從血液中回收超過85％的腫瘤細胞。該方法包括首先對全血細胞進行密度梯度離心以濃縮單核細胞，接著在發螢光的CAM膜上培養這些細胞一段合適的時間，如12-18小時，以便(a)標記腫瘤細胞，(b)在CAM膜上培養腫瘤細胞和少於0.1％的白細胞，以及(c)用抗體或核酸染料對CAM-捕獲的細胞群染色。通過鏡檢，單個腫瘤細胞和細胞叢都能容易地觀察到(而在流式細胞術中細胞叢通常難以產生)。CAM血液過濾測定法可用於分離癌症患者血液中有活力的腫瘤細胞、內皮祖細胞和免疫淋巴細胞。然後將CAM-捕獲的細胞平行接種於16-孔室的載玻片(Lab-Tek，Rochester，NY)中，該載玻片塗覆有基於FITC(或TRITC)-膠原的CAM並培養了12-18小時。侵襲性腫瘤細胞將攝取發螢光的CAM並變成為FITC(或TRITC)所標記，而共純化的內皮細胞和白細胞仍保持未標記狀態。除循環腫瘤細胞的陽性鑑定之外，分離的細胞通過標記TRITC(或FITC)-CD45或CD31(用於螢光鏡檢)或用PE-CD45或CD31標記(用於流式細胞術)可進行陰性鑑定的測試。
實施例6通過流式細胞術對分離的細胞計數
每位患者約10-20mL的血液可收集在Vacutainer試管中(Becton Dickinson，綠色蓋子，肝素鋰抗凝劑，每一試管容有7ml)。可將新鮮收集血樣的等份試樣轉移到CAM血液測試試管中，或進行密度梯度離心以獲取單核細胞，並在CAM上進行進一步的細胞富集和鑑定。通過流式細胞術對血液中有活力的腫瘤細胞的計數，可基於如下標準進行(a)腫瘤細胞通過攝取FITC標記的膠原顯象；(b)PE-標記的正常血細胞可用作為鑑定汙染的白細胞的補充信號；(c)7-AAD細胞死亡的陰性事件。FITC-膠原-或GFP-標記的腫瘤細胞可通過CAM得到捕獲，共分離的正常血細胞可用藻紅蛋白(PE)綴合的CD45抗體進行免疫後染色。可以僅吸出500μl樣品並在FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinson)上進行分析。通過使用核酸染料7-AAD的螢光閾值，數據可以列表方式獲得。多參數數據分析的標準包括(a)通過前向光散射確定的尺寸，(b)通過正交光散射確定的粒度，(c)死亡的7-AAD細胞陰性事件，(d)FITC-膠原-或GFP-腫瘤細胞的陽性事件，以及(e)PE-標記的CD45單克隆抗體正常細胞的陰性事件。為了使血液中存在的腫瘤細胞能以低於已公開的每毫升血液10,000,000,000個血細胞中100,000個腫瘤細胞比率(Glaves等，1988；Karczewski等，1994)的頻率進行計數，可有利地考慮下列因素
(i)樣品體積可從3-20mL減少到500μl，總的細胞計數從15,000,000,000減少到1,000,000，而在合理的一段時間內通過流式細胞儀的腫瘤細胞沒有明顯的損失(樣品流速＝60μl/mm)。(ii)富集的腫瘤細胞須可與共分離的正常細胞區分。該腫瘤細胞可以是FITC-膠原-或GFP-標記的，而超過99％的共分離細胞應當是白細胞且可用藻紅蛋白(PE)-綴合的抗CD45抗體標記。(iii)腫瘤細胞經常以直徑50μm-500μm的叢塊存在。在加載到流式細胞儀之前，來自CAM血液過濾和基於抗體的磁珠方法的細胞樣品可通過50μm篩網以除去大的叢塊。或者，當在CAM上培養叢塊時，循環腫瘤細胞從叢塊上脫離並在12-18小時內開始侵襲CAM膜。當使用發螢光的CAM膜時，通過CAM方法富集的腫瘤細胞可用螢光膠原標記，並可通過膠原酶以單個細胞形式懸浮。
實施例7CAM富集的患者腫瘤細胞在流式細胞術中的應用
(1).在每一塗覆有FITC-標記的膠原的CAM血液過濾裝置的試管中添加3mL抗凝的血液(0.3mL肝素鋰加枸櫞酸鹽葡萄糖抗凝劑溶液USP-ACD，Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，Jib)。將密封的CAM-血液試管放置在滾筒上，在37℃下以每分鐘5-30轉進行旋轉。溫育1-3小時用於產生腫瘤細胞粘附。(2).用移液管小心地除去非粘附的細胞和上清液。用3mL溶液小心地洗滌試管5次，避免擾動內壁上的CAM膜。洗滌溶液(PBS/O 1％BSA 1％ACD和肝素鋰)。(3).添加1mL的完全細胞培養基到每一CAM血液過濾裝置中，該培養基在pH7.4的HEPE緩衝液中含有15％人血清。將密封的CAM-血液試管放置在滾筒上，在37℃下以每分鐘5轉進行旋轉。溫育9-15小時以容許腫瘤細胞通過攝取的FITC-I型膠原而得到標記。(4).用移液管小心地除去培養基上清液。用3mL PBS洗滌試管3次，不要擾動內壁上的CAM膜。(5).添加1mL膠原酶溶液到業已徹底清潔的CAM血液過濾裝置的每一試管中。將密封的CAM-血液試管放置在滾筒上，在37℃下以每分鐘5轉進行旋轉。溫育10分鐘，以便溶解CAM並釋放腫瘤細胞到懸浮液中。膠原酶溶液(PBS，0.3mM CaCl2，0.2μg/mL I型膠原酶[Worthington Biochemical]，25μg/mL DNase [Roche])。(6).將懸浮液轉移到兩個Eppendorf管中，每管500μl。(7).用於多參數流式細胞術的染色/製備添加100μl的固定劑溶液(PBS，6％多聚甲醛，pH7.2)到Eppendorf管的500μl細胞懸浮液中(最終固定劑濃度為1％多聚甲醛)，在20-25℃下固定10分鐘。以1,000rpm旋轉1分鐘獲得細胞沉澱。除去固定劑並用500μl PBS溶液洗滌試管3次。放置在冰上並添加10μg/mL的PE-抗-CD45(用於標記白細胞)和1μg/mL的7-AAD(用於染色死亡細胞)，接著在黑暗中於4℃下溫育10分鐘。上述實驗方案指定用於CTC檢測。對於CEC和腫瘤相關的淋巴細胞的檢測，PE-抗-CD31和PE-抗-CD45可分別用於標記CEC和腫瘤相關的淋巴細胞。
實施例8通過CAM 96孔細胞室方法富集的腫瘤細胞在流式細胞術中的應用
(1).通過密度離心製備MNC級分使用存留在Vacutainer血液收集試管(Becton Dickinson，綠色蓋子，肝素鋰作為抗凝血劑，每一試管容有7mL)中的3-15mL抗凝的血液。以1,000rpm旋轉獲得細胞沉澱並將細胞重懸於含0.5mM EDTA的5mL PBS中。依照廠商說明通過Ficoll-Paque密度離心(Pharmacia)獲得單核細胞(MNC)級分，用含15％牛血清的完全培養基洗滌，並懸浮在3-15mL的完全培養基中。(2).在CAM 96-孔室載玻片上培養MNC級分接種100μl/孔的細胞懸液(也適用於通過諸如CAM和Dynal AAMB的其它方法捕獲的細胞)到期望的孔中，上述96-孔微量滴定板中有8孔塗覆有基於FITC-膠原的CAM，其中業已充滿了100μl含15％牛血清的完全培養基，並在CO2培養箱中於37℃下培養12-18小時。該步驟通過測定它們消化和內化螢光膠原片段的能力對腫瘤細胞進行標記。(3).用移液管小心地除去非粘附的細胞及上清液，用200μl PBS洗滌孔2次，不要擾動內壁上的CAM膜。非粘附的細胞由MNC級分中死亡的腫瘤細胞和非腫瘤血細胞組成。可匯集懸浮的細胞並分離CD19白細胞或幹細胞。(4).添加100μl膠原酶溶液(PBS，0.3mM，CaCl2，0.2μg/mL I型膠原酶[Worthington Biochemical]，25μg/mL DNase[Roche])到業已徹底清潔的96-孔CAM血液裝置的一行8個孔的每一孔中。粘附的細胞溫育10分鐘，以便溶解CAM並釋放結合的腫瘤細胞到懸浮液中。(5).從8-孔中轉移總共800μl的懸浮液到Eppendorf管中。(6).添加200μl固定劑溶液(PBS，10％多聚甲醛，pH7.2)到Eppendorf管的800μl細胞懸浮液中(最終固定劑濃度為2％多聚甲醛)，並在20-25℃下固定10分鐘。(7).以1,000rpm旋轉1分鐘獲得細胞沉澱，除去固定劑並用500μl PBS溶液洗滌試管3次。將細胞沉澱放置在冰上並添加10μg/mL的PE-抗-CD45、CD14和CD68(用於標記白細胞、單核細胞、巨噬細胞)和1μg/mL的7-AAD(用於染色死亡細胞)，接著在黑暗中於4℃下溫育10分鐘。上述實驗方案指定用於CTC檢測。對於CEC和腫瘤相關的淋巴細胞的檢測，PE-抗-CD31和PE-抗-CD45可分別用於標記CEC和腫瘤相關的淋巴細胞。
實施例9通過CAM 16-孔細胞室方法富集的腫瘤細胞的鏡檢鑑定
(1)在低速下製備細胞和血漿級分。750rpm離心5分鐘Vacutainer血液收集試管(Becton Dickinson，綠色蓋子，肝素鋰作為抗凝血劑，每一試管容有7ml)中3-7mL抗凝的血液在750rpm旋轉5分鐘或在1,000rpm旋轉3分鐘獲得細胞沉澱。將總共120μl的離心血液上清液的血漿轉移到Eppendorf管中，該管裝有680μl含15％牛血清的抗凝的完全培養基[稱為血漿培養基來自特定供體的15％血漿、在10％的抗凝血劑(ACD和肝素鋰)和75％的完全培養基中]。剩餘血漿以0.5μL等份貯藏。(2).通過密度離心製備M7NC級分細胞可重懸於含0.5mM EDTA的5mL PBS中。依照廠商說明通過Ficoll-Paque密度離心(Pharmacia)獲得單核細胞(MINC)級分，用含15％牛血清的完全培養基洗滌，並在分級分離前懸浮在相同體積的完全培養基中，如血液。(3).製備與含有或不含有來自每一特定供體的15％血漿的完全培養基預溫育的CAM 16-孔室載玻片在塗覆有基於TRITC-膠原的CAM的16-孔室載玻片(96-孔微量滴定板形式；Lab-Tek，Rochester，NY)的上面8個孔的每個孔中，接種100μl的完全培養基和10％的抗凝血劑。16孔室載玻片(96孔微量滴定板形式；Lab-Tek，Rochester，NY)的下面8個孔的塗覆基於TRITC-膠原的CAM的每個孔中，裝入100μl完全培養基和10％的抗凝血劑，以及15％的個體血漿[該血漿培養基15％血漿來自特定供體，在10％抗凝血劑(CDA+肝素)中，根據步驟1製備]。(4).在CAM 16-孔室載玻片上MNC級分的培養接種100μl的細胞懸液(也適用於通過諸如CAM和Dynal AAMB的其它方法捕獲的細胞)到塗覆有基於TRITC-膠原的CAM的16-孔室載玻片(96-孔微量滴定板形式；Lab-Tek，Rochester，NY)的每個孔中，其中業已充滿了100μl含15％牛血清的完全培養基，並在CO2培養箱中於37℃下培養12-18小時。該步驟通過測定它們消化和內化螢光膠原片段的能力對腫瘤細胞進行標記。(5).用移液管小心地除去非粘附的細胞和上清液。非粘附的細胞由MNC級分中死亡的腫瘤細胞和非腫瘤細胞組成。(6).抗體和核酸染色添加200μl固定劑溶液(PBS，3.7％多聚甲醛，pH 7.2)到CAM標記室裝置的每個孔中並在20-25℃下溫育10分鐘。除去固定劑並用200μl PBS洗滌試管3次，放置在冰上立即使用藍色螢光Hoechst 33342核染料和綠色螢光FITC-抗-vonWillebrand因子(標記內皮表型)(用於螢光鏡檢)，和紅色APAAP-抗-ESA(細胞角蛋白，EMA等上皮標記，造血細胞標記CD45/CD14/CD68/CD19/CD8，或其他內皮細胞標記CD31，fit-1，等)(用於DIC亮視野鏡檢)進行免疫標記。上述實驗方案指定用於CTC檢測。對於CEC和腫瘤相關的淋巴細胞的檢測，抗-CD31和抗-CD45可分別用於標記CEC和腫瘤相關的淋巴細胞，接著用於產生cRNA探針。
實施例10CAM 96-孔細胞室方法富集的腫瘤細胞在實時RT-PCR和DNA微陣列分子分析中的應用
(1).通過密度離心製備MNC級分[與上述實施例7實驗方案平行進行]使用存留在Vacutainer血液收集試管(BectonDickinson，綠色蓋子，肝素鋰作為抗凝血劑，每一試管容有7mL)中的3-15mL抗凝的血液。以1,000rpm旋轉獲得細胞沉澱並將細胞重懸於含0.5mM EDTA的5mL PBS中。依照廠商說明通過Ficoll-Paque密度離心(Pharmacia)獲得單核細胞(MNC)級分，用含15％牛血清的完全培養基洗滌，並懸浮在3-15mL的完全培養基中。(2).在CAM 96-孔室載玻片上培養MNC級分接種100μl/孔的細胞懸液(也適用於通過諸如CAM和Dynal AAMB的其它方法捕獲的細胞)到96-孔微量滴定板的其餘88個孔中，這些孔塗覆有基於I型膠原的CAM，其中業已充滿了100μl含15％牛血清的完全培養基，並在CO2培養箱中於37℃下培養12-18小時。(3).用移液管小心地除去非粘附的細胞及上清液，用200μl PBS洗滌孔2次，不要擾動內壁上的CAM膜，非粘附的細胞由MNC級分中死亡的腫瘤細胞和非腫瘤血細胞組成。可匯集懸浮的細胞並分離CD19白細胞或幹細胞。(4).CAM-捕獲的細胞的RNA分離添加10μL/孔Trizol試劑到業已徹底清潔的96-孔CAM血液裝置88-孔中的每一孔中。使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)抽提總RNA，接著在RNeasy旋轉柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)上純化。
實施例11使用細胞型抗體標記的免疫細胞化學用以確認細胞級分的純度
使用細胞型抗體標記的免疫細胞化學被用於確認細胞級分的純度。圖5上面兩個圖顯示了通過CAM從卵巢漿液性腺癌腹水中富集的白細胞(Leu)和腫瘤細胞(Epi)的免疫細胞化學鑑定，使用了抗CD45(一種全白細胞抗原)的抗體(左圖，Leu，紅色)，以及抗全細胞角蛋白(上皮抗原)的抗體(右圖，Epi，紅色)。下面兩個圖顯示了先通過CAM富集再通過抗體EpCAM陽性選擇的純腫瘤細胞的免疫細胞化學鑑定。在此，用抗全細胞角蛋白抗體標記的腫瘤細胞居多(左圖，Epi，紅色)。注意一些EpCAM抗體-Dynal珠子在腫瘤細胞上可見。少量(2％)純腫瘤細胞用抗CD31(一種內皮表面抗原)抗體標記(右圖，Endo，紅色)。細胞核被染成藍色作為普遍的細胞標記，在用非離子型去汙劑浸漬質膜後使用Hoechst 33342核染色來進行。(圖片尺寸，331μm×239μm。)實施例12實時RT-PCR分析
實時RT-PCR分析可用於進一步解釋一種或多種癌症的遺傳原理。RT-PCR分析也可用於驗證微陣列數據。定量實時RT-PCR被用於測定選自DNA微陣列簇的10種基因的表達，這些基因特異於純化的63種細胞樣品中具代表性的7種細胞群(圖5A)。(A)在不同腫瘤細胞類型中5種正調節基因(MMP7，粘蛋白1，GA733-1，脂籠蛋白2和細胞角蛋白18)；白細胞中4種正調節基因(CD45，自分泌運動因子，CXCR4和SDF-1)；所有63種細胞樣品中成纖維細胞(I型膠原)中的一種正調節基因的定量實時RT-PCR分析。(B)在7種細胞組中差異調節的10種基因的定量實時RT-PCR分析。條形圖用於顯示不同細胞組的典型基因表達模式，以及細胞組內和細胞組之間表達水平的波動。對於每個基因而言，相對表達與每組中數個細胞樣品的平均倍數表達(對β-肌動蛋白歸一化)進行比較。誤差線(Error bars)，平均值的標準誤差(SE of themeans)。通過CAM啟動的細胞分離裝置分離的4種不同類型的腫瘤細胞中，發現5種正調節基因在大多數富集自卵巢和子宮腫瘤標本的腺癌細胞樣品中高表達(圖6A-6C)。在針對腫瘤細胞、白細胞和成纖維細胞相關基因的不同類型細胞組之間的表達差異也可看出DNA微陣列數據與實時RT-PCR數據之間存在相似。這些結果表明大多數陣列探針組有可能準確地測定複雜的轉錄物混合物中期望轉錄物的水平。應當理解上述所公開的各種內容及它們的其他特徵和功能或替換物可理想地組合成許多其他不同的系統或應用。同樣地，應當理解目前各種未預見到的或不曾預料到的替換物、變型、變體或改進在此可隨後為本領域技術人員所實施，其也意在為下列權利要求所包含。
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權利要求
1.一種用於從液體樣品中分離靶細胞的裝置，包括具有內表面和外表面的容器；細胞粘附基質，其包含與一種或多種細胞粘附分子締合的非反應性芯材；其中所述細胞粘附基質塗覆在所述容器的所述內表面上。
2.權利要求1的裝置，其中所述細胞粘附基質的非反應性芯材是選自明膠、交聯的明膠、骨、玻璃、惰性聚合物和葡聚糖的材料中的至少一種。
3.權利要求1的裝置，其中所述細胞粘附基質的所述細胞粘附分子是選自蛋白聚糖、纖連蛋白、纖維蛋白、肝素、層粘連蛋白、生腱蛋白、玻連蛋白、和/或其片段的至少一種分子。
4.權利要求1的裝置，其中所述容器的內表面至少5％塗覆有所述的細胞粘附基質。
5.權利要求1的裝置，還包括至少一種對所述靶細胞具有親和性的配體，該配體當與所述靶細胞締合時是可檢測的。
6.權利要求5的裝置，其中所述的配體是螢光標記的。
7.權利要求5的裝置，其中所述配體整合到所述細胞粘附基質中。
8.權利要求5的裝置，其中所述配體在與所述細胞粘附基質締合的層中。
9.權利要求1的裝置，還包括鄰近所述細胞粘附基質的細胞分離機構，所述細胞分離機構被有效地構造成在所述靶細胞和所述細胞粘附基質相互作用前從含有所述靶細胞的樣品中除去細胞。
10.權利要求9的裝置，其中所述細胞分離機構是選自過濾器、膜、篩網、材料梯度的至少一種機構。
11.權利要求5的裝置，其中至少一種配體被有效地配置以便容許對配體與分離的靶細胞相互作用進行可視檢測。
12.一種使用權利要求1的裝置的方法，包括將所述液體樣品中細胞混合物與所述裝置中所述細胞粘附基質接觸；從所述細胞粘附基質上分離靶細胞。
13.權利要求12的方法，還包括從所述細胞粘附基質上除去未結合的細胞。
14.權利要求12的方法，其中所述液體樣品是血樣或腹水樣品或活組織切片或刮片或塗片樣品。
15.權利要求12的方法，其中所述細胞混合物包括在密度梯度離心或紅細胞裂解後來自血樣的單核細胞。
16.權利要求12的方法，其中所述靶細胞是腫瘤細胞、內皮細胞或胎兒細胞。
17.權利要求16的方法，其中腫瘤細胞來自肺癌、膀胱癌、乳房組織癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、食道癌、頭頸癌、宮頸癌、子宮癌、腦癌、腎癌、甲狀腺癌、結腸癌或直腸癌中的至少一種。
18.權利要求12的方法，其中靶細胞是內皮細胞或內皮祖細胞。
19.權利要求12的方法，其中靶細胞是獲得自孕婦的胎兒細胞。
20.權利要求12的方法，其中所述細胞粘附基質包括珠子。
21.權利要求12的方法，其中所述細胞粘附基質包括螢光標記的細胞粘附基質成分。
22.權利要求12的方法，其中所述靶細胞包含侵襲偽足。
23.權利要求12的方法，其中靶細胞包括細胞粘附受體整聯蛋白。
24.一個具有開口、底部和環繞的側壁的容器，在所述容器的內表面上包含至少一塗層的細胞粘附基質，該塗層被有效地構造成在液體置於所述容器的開口中時與液體樣品接觸。
25.權利要求24的容器，其中所述容器選自微量滴定板、顯微鏡載玻片室、組織培養裝置、細胞室裝置、血液過濾裝置、試管、瓶、或其組合。
26.權利要求21的螢光標記的細胞粘附基質，其中所述基質被用於標記血液中的癌細胞。
27.一種用於產前診斷疾病的方法，包括將來自孕婦的血樣與細胞粘附基質接觸，從所述細胞粘附基質上分離所述胎兒細胞，在培養基中培養所述胎兒細胞，以及檢測所述胎兒細胞遺傳和染色體異常的存在。
28.權利要求27的方法，其中遺傳和染色體異常選自唐氏症候群、馬凡氏症候群、Taysach氏病和地中海貧血。
29.權利要求27的方法，其中所述細胞粘附基質包括多個塗覆的珠子，該珠子包括非反應性芯材和圍繞所述芯材的細胞粘附分子。
30.權利要求29的細胞粘附基質，其中所述非反應性芯是選自膠原微珠、明膠微珠和玻璃微珠、或其組合的至少一種材料。
31.權利要求30的容器，其中膠原標記有螢光染料。
32.一種用於體外診斷癌症的方法，包括將獲得自患者的樣品液體與包含血源性成分的細胞粘附基質接觸；從所述樣品液體的細胞中分離與所述基質粘附的轉移性腫瘤細胞；培養與所述基質粘附的轉移性腫瘤細胞一段預定時間；以及對所述培養物中所述轉移性腫瘤細胞進行鏡檢和流式細胞術分析。
33.權利要求32的方法，其中所述方法還包括對轉移性癌細胞進行免疫細胞化學操作和/或用標記的細胞粘附基質和核酸染料對所述癌細胞染色的步驟，以鑑別在所述樣品液體中存在的癌細胞類型。
34.權利要求32的方法，其中所述方法還包括使用DNA微陣列分析和/或實時PCR定量上皮腫瘤基因標記以鑑定所述轉移性腫瘤細胞。
35.權利要求34的方法，其中腫瘤基因標記是GA733-2、GA733-1、MMP7、粘蛋白1、脂籠蛋白2和細胞角蛋白18、E-鈣粘蛋白-1、seprase、自體毒素和CXCR4。
36.一種具有液體入口和液體出口的過濾盒，包括鄰接所述液體入口的預過濾器；鄰接所述液體出口的後過濾器；以及包含細胞粘附基質的過濾室，所述過濾室位於所述預過濾器和所述後過濾器之間。
37.權利要求36的方法，其中所述預過濾器或所述後過濾器中之一與細胞粘附基質結合。
38.一種用於從液體樣品中分離靶細胞的裝置，包括具有一用以容納所述液體樣品的內表面和一外表面的容器；包括與具有細胞粘附基質的卡連接的蓋子的浸量尺。
全文摘要
公開了用模擬轉移性環境、心血管環境或胎盤環境的細胞粘附基質系統進行分離和診斷疾病的方法和裝置。所述細胞粘附基質使從諸如血液的液體樣品中富集諸如轉移性腫瘤細胞、胎兒細胞和內皮祖細胞的靶細胞更容易，用於診斷和治療患有諸如癌症、心血管和胎兒疾病的疾病的患者，和用於轉移性疾病、心血管疾病和胎兒疾病的分子分析研究應用。在此描述了使用多重分子分析的用於循環腫瘤細胞和內皮細胞的細胞富集和檢測的血液測試樣機和方法。此外，在此也描述了用於確定具有癌症進展危險的患者中針對腫瘤的宿主免疫性的方法和組合物，以及分離來自孕婦的胎兒細胞富集級分用於產前診斷的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1922304SQ200480039363
公開日2007年2月28日 申請日期2004年10月30日 優先權日2003年10月31日
發明者陳文典, 陳力, 陳策 申請人:維特克公司